Компактный квантовых точек для одиночных молекул изображений

Резюме

Мы описываем получения коллоидных квантовых точек с минимальным гидродинамическим размер одной молекулы флуоресцентной микроскопии. По сравнению с обычными квантовыми точками, эти наночастицы близки по размерам к глобулярных белков и оптимизированы для одной молекулы яркость, устойчивость против фотостарения, а также устойчивость к неспецифического связывания с белками и клетками.

Аннотация

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology ^1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.

Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation ⁵. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large ^4,6,7.

Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past ^8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed Hg_xCd_1-xSe core coated with an insulating Cd_yZn_1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, Hg_xCd_1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

протокол

Следующие процедуры синтеза включает стандартные воздуха без техники и использования вакуума / инертной газовой трубе; подробной методологии можно найти в ссылках 10 и 11. Бюллетени для всех потенциально токсичных и легковоспламеняющихся веществ необходимо проконсультироваться с использованием и все легковоспламеняющихся и / или воздушно-лабильные соединения должны быть аликвоты в перегородке-запечатанных флаконов в ящике для перчаток или перчатки сумки.

1. Синтез селенида кадмия ртути (Hg _х Cd _1-х Se) Quantum Dot сердечников

1. Подготовить 0,4 М раствор селена в trioctylphosphine (TOP). Добавить селена (0,316 г, 4 ммоль) в 50 мл 3-колбу, а затем эвакуировать и заполнить аргоном с помощью линии Шленка. В воздухе свободный условиях (сухого азота или аргона), добавить 10 мл TOP и тепла до 100 ° C при перемешивании в течение 1 часа, получая прозрачный, бесцветный раствор. Охладите раствор до комнатной температуры и установить колбу в сторону.
2. В 250 мл 3-колбу, добавляют оксид кадмия (CdO 0,0770 г, 0,6 ммоль), tetradecylphosphonic кислоты (TDPA, 0,3674 г, 1,32 ммоль) и октадецена (ОДУ, 27,6 мл), и эвакуировать решения с использованием линии Шленка при перемешивании. Увеличение температуры до 100 ° C и эвакуировать еще 15 минут для удаления низкокипящих примесей точки.
3. В атмосфере аргона или азота, нагреть смесь до 300 ° С в течение 1 ч до полного растворения CdO. Решение будет меняться от красноватого цвета с прозрачным и бесцветным. Охладите раствор до комнатной температуры.
4. Добавить гексадециламин (HDA, 7,0 г) к кадмию решение, нагреть до 70 ° C, и эвакуировать. После постоянного давления достигается, повышение температуры до 100-110 ° C и рефлюкс раствор в течение 30 мин. Переключение клапана Шленка линии инертного газа и вставить термопару непосредственно в раствор.
5. В воздухе без условий, добавить дифенилфосфина (DPP, 100 мкл) к решению и увеличить температуру до 310 ° C. Удалить 7,5 мл 0,4 М ТОП-Se решения(3 ммоль селен) в одноразовый пластиковый шприц прилагается к 16 иглы.
6. Как только температура в равновесие при 310 ° C, установить регулятор температуры до 0 ° C и быстро вводить ТОП-Se решение непосредственно в кадмий решение. Решение будет меняться от бесцветного до желто-оранжевого и температура быстро падает и снова вырасти до ~ 280 ° C. Через 1 мин реакции, снимите колбу с нагревательным кожухом и быстро прохладной струей воздуха до температуры ниже 200 ° C.
7. Когда температура достигает ~ 40 ° C, разбавляют 30 мл гексана, большинство из оставшихся предшественника кадмия осядет из раствора. Удалить этот осадок центрифугированием (5.000 мкг, 10 мин).
8. В каждой из шести 50 мл коническую трубку полипропилена центрифуги, развести 12 мл сырого раствора нанокристаллов с 40 мл ацетона, центрифуга (5.000 мкг в течение 10 мин), и осторожно сливают и отбросить супернатант.
9. Растворите nanocrystal гранул в гексане (25 мл общего объема). Извлеките этот раствор 3 раза с равным объемом метанола, сохраняя верхнюю фазу. Для третьего добычи, объем метанола может быть скорректирована до ~ 15 мл для получения концентрированного раствора гексана чистой КТ CdSe примерно 200 мкМ. Типичный выход из этой реакции составляет 3 мкмоль нанокристаллов CdSe диаметром 2,3 нм (50-60% выход реакции).
10. Определить диаметр нанокристаллов и концентрации путем измерения UV-Vis спектра поглощения и консультаций с размером облегающие схема Mulvaney и его коллеги ¹² и исчезновения корреляций Bawendi и сотрудников ^13. См. Приложение для деталей.
11. Mercury катионообменная: нанокристаллы могут быть частично обменивались с ртуть красного смещения спектров поглощения и флуоресценции. Смешайте следующие вместе с тем в 20 мл стеклянный флакон с stirbar (эта реакция может быть расширена по желанию): 3 мл гексана, 2 мл хлороформа, 1 мл 200 мкМ CdSe QD решения (200 нмоль), 15 мкл олеиламин (УПВ) и 500 мкл 0,1 М раствора Hg (OT) ₂ в хлороформе. Mercury octanethioate (HgOT ₂₎ могут быть получены путем взаимодействия ацетата ртути и octanethiol в метаноле (см. приложение). В качестве катион доходов обменной реакции, степень красного смещения можно контролировать с UV-Vis абсорбционной спектрофотометрии. После того, как желаемое полоса поглощения была достигнута, измерения поглощения раствора нанокристаллов при 350 нм и определить новый коэффициент экстинкции, предполагая, что концентрация нанокристаллов не изменилась (30,7 мкМ в этом примере). Quench реакции путем удаления непрореагировавшего ртути: добавить 5 мл декана, 10 мл гексана, и 7 мл метанола и извлечения решения, сохраняя верхнюю фазу, содержащую нанокристаллов. Извлечение в два раза больше гексаном и метанолом, и регулировать громкость метанола так, чтобы верхняя фаза ~ 7 мл. Если фазы медленного отделить, решение может быть центрифугировали (5000 мкг,10 мин). Добавить 100 мкл TOP 100 мкл УПВ, и 100 мкл олеиновой кислоты в нанокристаллы затем 40 мл ацетона, чтобы вызвать осадки. Сбор нанокристаллов с помощью центрифугирования и разогнать в 3-гексана мл. Центрифуга снова, чтобы удалить нерастворимые компоненты и определения концентрации нанокристаллов снова, используя новый коэффициент экстинкции при 350 нм. Разрешить решение нанокристаллов в возрасте не менее 24 часов при комнатной температуре, прежде чем переходить к следующему шагу.

2. Рост сульфида кадмия цинка (Zn Cd _{у 1-й} S) Shell

1. Подготовить 0,1 М решениях корпуса предшественника в 50 мл 3-горлую колбы. Кадмий предшественника: кадмия ацетата гидрата (230,5 мг, 1 ммоль) и 10 мл олеиламин (УПВ). Цинк предшественника: ацетат цинка (183,5 мг, 1 ммоль) и 10 мл УПВ. Сера предшественника: серы (32,1 мг, 1 ммоль) и 10 мл ОДУ. Под вакуумом, нагревать каждое решение с обратным холодильником в течение 1 часа, получая четкие решения, а затем взимать с аргоном. Сера решение можетбыть охлажден до комнатной температуры, но кадмия и цинка прекурсоров поддерживается на уровне 50 ° C. Расчет количества оболочки предшественника можно найти в работе 14.
2. Добавить к 3-колбу: Hg _х Cd _{1-X SE} КТ (120 нмоль, 2,3 нм в диаметре), ОДУ (2 мл), и trioctylphosphine азота (TOPO, 250 мг). Эвакуировать от гексана при комнатной температуре на линии Шленка. Увеличение температуры до 100 ° C и обратным холодильником в течение 15 мин. Изменение клапан Шленка линия аргон или азот и вставьте термопары в раствор нанокристаллов.
3. Повышение температуры до 120 ° C, добавляют 0,5 монослоя серы решения предшественника (140 мкл), и позволяют реакции протекать в течение 15 мин. Малые аликвоты (<50 мкл) могут быть удалены с помощью стеклянного шприца для контроля за ходом реакции с помощью флуоресцентной и / или UV-Vis абсорбционной спектрофотометрии. Повышение температуры до 140 ° C, добавляют 0,5 монослоя кадмия решение предшественника (140 мкл), и позволяют протекания реакции в течение 15 мин. Добавить 500 мкл безводного OLA к реакционному раствору.
4. При 160 ° С добавляют 0,5 монослоя серы решения предшественника (220 мкл) с последующим равным количеством цинка решение предшественника при 170 ° С 15 мин между каждым добавлением. Затем при температуре 180 ° C добавьте 0,25 монослоя серы решения предшественника (150 мкл) и цинка раствор предшественника интервалом в 15 мин.
5. Охладите раствор до комнатной температуры и снова вычислить новый коэффициент экстинкции для этих частиц с помощью UV-Vis спектре, предполагая, что число нанокристаллы не изменилось (120 нмоль в 3,8 реакционный раствор мл). Хранить реакции раствора в виде сырой смеси в морозильной камере; нанокристаллы могут быть разморожены и очищают по мере необходимости, используя тот же метод, описанный в разделах 1.8 и 1.9.
6. Нанокристаллы могут быть охарактеризованы с помощью электронной микроскопии, UV-Vis спектроскопии поглощения и флуоресцентной спектроскопии. Квантовый выход может бытьрассчитанный абсолютно использованием интегрирующей сферы или относительно, по сравнению с известными стандартными методами ведения 15.

3. Фазового перехода

1. Добавить очищенные ядро / оболочка Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й S КТ (5 мл, 20 мкМ) в 50 мл 3-колбу и удаления гексана в высоком вакууме с получением сухой пленки. Наполните колбу с аргоном, добавляют безводный пиридин (3 мл) к фильму наночастиц и тепла в суспензии до 80 ° C. В течение 1-2 часов наночастицы полностью растворяются.
2. Добавить 1-тиоглицерин (1 мл) к раствору и перемешивали при 80 ° C в течение 2 часов. Затем охлаждают раствор до комнатной температуры и добавляют триэтиламин (0,5 мл) для депротонирования тиоглицерин. Перемешать в течение 30 мин. Раствор мутнеет после добавления триэтиламина из-за плохой растворимости полярных нанокристаллов в этой смеси растворителей.
3. Передача QD раствора в 50 мл коническую трубку продолжение центрифугиaining смесь из 20 мл гексана и 20 мл ацетона, и хорошо перемешать. Изолировать осажденного нанокристаллов с помощью центрифугирования (5.000 мкг, 10 мин) и промыть осадок ацетоном.
4. Растворите QD гранул в ДМСО (5 мл) с ванной ультразвуком, а затем центрифуги (7.000 мкг, 10 мин), чтобы удалить возможные агрегаты. Определить концентрацию наночастиц от UV-Vis спектра поглощения. Это решение чисто КТ должны быть использованы в течение 3 часов, а поверхность тиолов может медленно окисляется в условиях окружающей среды в воздух.
5. Развести QD решение 10 мкм или менее с ДМСО и перенести в 50 мл колбу. Подготовить 5 мг / мл раствора тиолированного полиакриловой кислоты (синтез описан в приложении) в ДМСО. Добавить полимерный раствор (0,15 мг полимера на нмоль КТ) по каплям к QD решение при перемешивании и дегазации раствора при комнатной температуре в течение 5 мин.
6. Очистите КТ / раствор полимера с аргоном и тепла до 80 ° С в течение 90 мин. Затем охлаждают раствор до комнатной температурыг каплям добавляют равный объем 50 мМ борат натрия, рН 8. Перемешать в течение 10 мин.
7. Очищают КТ с помощью диализа (20 кДа отсечки) в 50 мМ борат натрия, рН 8, а затем сосредоточиться частиц с помощью центробежного фильтра (10 кДа обрезания). Определить концентрацию от UV-Vis спектра поглощения.

4. PEG покрытия

1. В 4 мл стеклянный флакон с stirbar, смешайте 1 нмоль КТ в боратного буфера с 40000 х молярный более 750 Da monoamino-полиэтиленгликоля (30 мг, 40 мкмоль). Если конкретные функциональные химические должна быть добавлена ​​к нанокристаллов (например, гидразид или малеимида), она может быть введена путем замены доли амино-ПЭГ с гетеробифункциональных амино-ПЭГ (30% молярной доли обычно хорошо работает). Разведите раствор нанокристаллов до 1 мкм с боратный буфер. Эта реакция может быть расширена по желанию.
2. Подготовка свежий раствор DMTMM (20 мг, 72 мкмоль) в ДМСО (144 мкл). Это решение может быть кратко нагревается иnder струей теплой водопроводной воды или погружается в ванну ультразвуком, чтобы полностью растворить DMTMM. Быстро добавить 25000 х молярный избыток этого 0,5 М раствора DMTMM (50 мкл) в КТ решения и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин.
3. Повторите шаг 4,2 четыре раза для насыщения поверхности нанокристаллов с PEG. Наконец, добавьте 200 мкл 1 М Трис-буфера для гашения реакции и очистить нанокристаллов использованием диализ, центробежные фильтры, или ультрацентрифугирования.
4. Нанокристаллы могут быть проанализированы для монодисперсности, гидродинамический размер и заряд поверхности методом жидкостной хроматографии, электрофореза в агарозном геле, и флуоресцентной микроскопии. Для определения гидродинамических размер и распределение по размерам с использованием автоматизированной жидкостной хроматографии (GE AKTAprime Plus), использовать Superose 6 колонку, скорость потока 0,5 мл / мин с элюент PBS буфера и поглощения обнаружения при 260 или 280 нм. Сравнить раз наночастиц элюирования с тех стандартов молекулярной массы. Для агарозном геле электрофотографическихсопротивления, подготовить 0,5% агарозном геле в 50 мМ борат натрия буфером (рН 8,5) или 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,4), смешайте 1 мкм образцы с 10% глицерина и нагрузки в скважины, и работать на 100 В в течение 30 мин . Изображение нанокристаллов в геле с использованием УФ палочки рукой или УФ-просвечивания и для возбуждения флуоресценции. Чтобы изображение нанокристаллов на одном уровне молекул с помощью флуоресцентной микроскопии, развести частиц до 0,2 нМ в 10 мМ фосфатного буфера, падение 2,5 мкл раствора на стекло покровное, и осторожно поместите второй покровное в верхней части жидкого шарика распространяться пленки между покровные. Изображение поверхности связанных частиц с помощью высокой числовой апертуры объектива (в идеале, по крайней мере, 1,40) в любом эпифлуоресцентной или TIRF режиме при возбуждении на длинах волн 400-580 нм и электронно-умножение CCD камера. Точные параметры изображения будет варьироваться между микроскопии установки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 2 представлена ​​представитель спектры поглощения и флуоресценции для CdSe нанокристаллов, Hg _х Cd _{1-X SE} нанокристаллов после катионного обмена, и Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й нанокристаллы S после оболочку роста. Нанокристаллов CdSe есть основно?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

По сравнению с обычными CdSe квантовых точек, тройной сплав ртути _х Cd _{1-X SE} нанокристаллы могут быть настроены по размеру и длине волны флуоресценции самостоятельно. Размер первой выбранной в процессе синтеза нанокристаллов CdSe ядра, а длина волны флуоресценции выбран вторично...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Селен	Sigma-Aldrich	229865
Tri-н-octylphosphine	Стрем	15-6655	97% чистого, неустойчивы в воздухе
Кадмий оксид	Sigma-Aldrich	202894	Очень токсично: Соблюдайте осторожность
Tetradecylphosphonic кислоты	PCI синтеза	4671-75-4
Октадецена	Alfa Aesar	L11004	Технический сорт
Гексадециламин	Sigma-Aldrich	H7408
Дифенилфосфина	Sigma-Aldrich	252964	Пирофорный
Mercury ацетат	Sigma-Aldrich	456012	Очень токсично: Соблюдайте осторожность
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Сильный запах
Олеиновая кислота	Sigma-Aldrich	W281506
Цинк ацетат	Alfa Aesar	35792
Кадмий ацетат гидрат	Sigma-Aldrich	229490	Очень токсично: Соблюдайте осторожность
Олеиламин	Fisher Scientific	AC12954	Нестабильность в воздухе
Сера	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine оксид	Стрем	15-6661	99%
Пиридин	VWR	EM-PX2012-6	Безводный
Тиоглицерин	Sigma-Aldrich	M1753	Сильный запах
Триэтиламин	Sigma-Aldrich	471283	Безводный
Диализа	Спектр Labs	131342	20 кДа отсечка
Центробежный фильтр	Millipore	UFC801024	10 кДа отсечка
Monoamino-PEG	Rapp полимеры	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4 - (4,6-диметокси-1 ,3,5-триазин-2-ил)-4-methylmorpholinium хлорид гидрат	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus хроматографической системы	GE Healthcare
Superose 6 10/300 GL колоночной хроматографии	GE Healthcare	17-5172-01
Агарозы, OmniPur	VWR	EM-2120
			Приложение Синтез ртути octanethiolate: Медленно добавить раствор метанола ртути ацетата (1 экв.) Для перемешивания раствора 1-octanethiol (3 экв.) И гидроксид калия (3 экв.) В метаноле при комнатной температуре. Изолировать ртути (II) octanethiolate осадок фильтрованием, промывают два раза с метанолом и один раз эфиром, а затем сушат под вакуумом. Синтез полидентатным полимеров: Растворите полиакриловой кислоты (1 г, 1773 Da) в 25 мл диметилформамида (DMF) в 150 мл трехгорлую колбу и пузырь с аргоном в течение 30 мин. Добавить безводного решение цистеамина (374 мг, 4,87 ммоль) в 10 мл DMF. При комнатной температуре при интенсивном перемешивании медленно добавляют безводный диизопропилкарбодиимид (DIC, 736 мг, 5,83 ммоль) в течение 30 мин, затем триэтиламин (170 мкл, 1,22 ммоль), и позволяют протекания реакции в течение 72 ч при температуре 60 ° C. Добавить меркаптоэтанол (501 мг, 6,41 ммоль) для гашения реакции, и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Удалить DMF с помощью роторного испарителя и изолировать полимера с добавлением смеси 2:1 ледяной ацетон: хлороформ, с последующим центрифугированием. Растворите полимера в ~ 5 мл безводного DMF, фильтр, осадок снова диэтиловый эфир, и повторите. Сухой продукт под вакуумом и магазинов в атмосфере аргона. Определение диаметра основной CdSe: от UV-Vis спектр поглощения определить длину волны первого экситонного пика (λ, в нм), которая является самой длинной длины волны пика (например, примерно 498 нм для CdSe в рис. 2а), и использовать размера кривой Mulvaney и сотрудники 12: Определение концентрации нанокристаллов CdSe: от фона вычитается UV-Vis спектра оптически прозрачный раствор нанокристаллов CdSe, определяют поглощение при 350 нм. Серийные разведения могут быть использованы, чтобы определить, оптическое поглощение в пределах линейного диапазона закона Бера. Концентрации нанокристаллов (квантовых точек в M) может быть определено путем включения в нанокристаллов диаметром (D, в нм), оптические значения поглощения (3SA), а длина кювет пути (л, в см) в следующее уравнение из эмпирические соотношения Bawendi и сотрудники 13: