Compactas pontos quânticos para uma única molécula de imagem

Resumo

Descreve-se a preparação de pontos quânticos coloidais com minimizada tamanho hidrodinâmico para uma única molécula de imagens de fluorescência. Em comparação com os pontos convencionais quântica, estas nanopartículas são semelhantes em tamanho às proteínas globulares e são optimizadas para uma única molécula de brilho, estabilidade contra a fotodegradação, e resistência a ligação não específica a proteínas e células.

Resumo

Única molécula-imagem é uma ferramenta importante para a compreensão dos mecanismos da função biomolecular e para visualizar a heterogeneidade espacial e temporal de comportamentos moleculares subjacentes à biologia celular ^1-4. A imagem de uma molécula individual de interesse, é tipicamente conjugado com um marcador fluorescente (corante, proteína, grânulo, ou quantum dot) e observadas com epifluorescência ou por reflexão total interna microscopia de fluorescência (TIRF). Embora os corantes fluorescentes e de proteínas têm sido o esteio de imagens de fluorescência ao longo de décadas, a fluorescência é instável sob elevados fluxos de fótons necessárias para observar as moléculas individuais, obtendo-se apenas de alguns segundos de observação antes de completa perda de sinal. Esferas de látex e os grânulos de corantes marcados proporcionar estabilidade melhorada do sinal, mas à custa de maior tamanho hidrodinâmico drasticamente, o que pode alterar prejudicialmente a difusão e o comportamento da molécula em estudo. ntent "pontos quânticos (QDs>) oferecem um equilíbrio entre estes dois regimes problemáticos. Estas nanopartículas são compostos de materiais semicondutores e podem ser projetados com um tamanho compacto hidrodinamicamente com excepcional resistência à fotodegradação ^5. Assim, nos últimos anos QDs têm sido fundamentais na viabilização observação a longo prazo do comportamento complexo macromolecular no nível única molécula. No entanto, estas partículas têm sido ainda encontrados para exibir difusão prejudicada em ambientes aglomerados moleculares, tais como o citoplasma celular e a fenda sináptica neuronal, onde os tamanhos são ainda demasiado grande ^{de 4,6 , 7.}

Recentemente, temos os núcleos de engenharia e revestimentos de superfície de QDs para minimizar tamanho hidrodinâmico, enquanto equilibra as compensações para a estabilidade coloidal, fotoestabilidade, brilho e ligação inespecíficos que têm dificultado a utilidade de QDs compactos no ^8,9 passado. O objetivo deste artigo é demonstrara síntese, modificação e caracterização destes nanocristais optimizado, composto por uma liga Hg _{x 1-x} Cd núcleo Se revestidas com um isolante _y Zn Cd _1-y shell S, ainda revestidos com um ligante de polímero multidentado modificada com polietilenoglicol curto ( cadeias PEG) (Figura 1). Comparado com nanocristais CdSe convencionais, Hg _{x CD} ligas _{1-X SE} oferecer maiores rendimentos quânticos de fluorescência, com comprimentos de onda de vermelho e de infravermelho próximo para reforço de sinal-para-ruído de células, de excitação e de não citotóxicas comprimentos de onda visíveis. Os revestimentos de polímero multidentados se ligar à superfície de nanocristais de uma conformação fechada e plana para minimizar o tamanho hidrodinâmico, e PEG neutraliza a carga de superfície para minimizar a ligação não específica de células e biomoléculas. O resultado final é um nanocristais brilhantemente fluorescentes com emissão entre 550-800 nm e um tamanho hidrodinâmico quase total 12 nm. Isto é, no same gama de dimensões, como muitas proteínas globulares solúveis em células, e substancialmente mais pequenas do que as convencionais QDs peguilado (25-35 nm).

Protocolo

Os procedimentos de síntese a seguir envolvem padrões de ar livres de técnicas e a utilização de um colector de vácuo / gás inerte; metodologia detalhada pode ser encontrada nas referências 10 e 11. MSDS para todas as substâncias potencialmente tóxicas e inflamáveis ​​deve ser consultado antes do uso e compostos de todos inflamáveis ​​e / ou ar-lábil deve ser aliquotado em septo fechados frascos em uma caixa de luva ou saco de luvas.

1. Síntese de Mercúrio seleneto de cádmio (Cd Hg _{x 1-X} SE) Quantum Núcleos Dot

1. Prepare uma solução 0,4 M de selênio em trioctylphosphine (TOP). Adicionar selénio (0,316 g, 4 mmol) a um balão de 50 ml de 3 tubuladuras, em seguida evacuar e encher-se com árgon utilizando uma linha Schlenk. Sob condições isentas de ar (azoto anidro ou atmosfera de árgon), adicionam-se 10 ml TOP e aquecer a 100 ° C com agitação durante 1 h para dar uma solução límpida e incolor. Arrefece-se a solução à temperatura ambiente e ajustar o balão de lado.
2. Para um balão de 250 ml com 3 tubuladuras, adicionar óxido de cádmio (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), ácido tetradecylphosphonic (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol), e octadeceno (ODE, 27,6 ml), e evacuar a solução utilizando uma linha de Schlenk, sob agitação. Aumentar a temperatura para 100 ° C e de evacuar para mais 15 min para remover as impurezas de baixo ponto de ebulição.
3. Sob atmosfera de árgon ou de azoto, aquece-se a mistura a 300 ° C durante 1 hora para dissolver completamente o CdO. A solução irá mudar de uma cor avermelhada para transparente e incolor. Arrefecer a solução à temperatura ambiente.
4. Adicionar hexadecilamina (HDA, 7,0 g) à solução de cádmio, de calor a 70 ° C, e de evacuar. Uma vez que a pressão constante é atingido, aumentar a temperatura até 100-110 ° C e refluxo da solução durante 30 min. Alternar a válvula da linha de Schlenk de gás inerte e inserir o termopar directamente na solução.
5. Sob condições isentas de ar, adicionam difenilfosfina (DPP, 100 ul) à solução e aumentar a temperatura para 310 ° C. Remover 7,5 ml de 0,4 M de solução de TOP-Se(3 selénio mmol) de uma seringa descartável de plástico ligada a uma agulha de calibre 16.
6. Uma vez que a temperatura se equilibra a 310 ° C, ajustar o controlador de temperatura de 0 ° C e rapidamente injectar a solução TOP-Se directamente na solução de cádmio. A solução passa de incolor a amarelo-laranja e a temperatura irá cair rapidamente e aumentar de novo até ~ 280 ° C. Após 1 min de reacção, retirar o balão da manta de aquecimento e esfriar rapidamente com um fluxo de ar até que a temperatura seja inferior a 200 ° C.
7. Quando a temperatura atinge 40 ° C, dilui-se com 30 ml de hexano, sendo a maioria do restante precursor cádmio vai resolver para fora da solução. Remover este precipitado por centrifugação (5000 xg, 10 min).
8. Em cada um dos seis tubos de polipropileno de 50 ml de centrífuga cónico, diluir 12 ml da solução de nanocristais bruto com 40 ml de acetona, de centrifugação (5000 xg durante 10 min), e decantar cuidadosamente o sobrenadante e descartar.
9. Dissolve-se o nanocrpelotas ystal em hexano (25 ml volume total). Extrair esta solução três vezes com um volume igual de metanol, mantendo a fase superior. Para a terceira extracção, o volume de metanol pode ser ajustado para ~ 15 ml para se obter uma solução concentrada de hexano QDs CdSe puros em cerca de 200 uM. O rendimento típico da reacção é de 3 mol de nanocristais CdSe com um diâmetro de 2,3 nm (50-60% de rendimento da reacção).
10. Determine o diâmetro nanocristais e concentração através da medição do espectro de absorção de UV-Vis e consulta a carta do tamanho-instalação do Mulvaney e colegas de trabalho ^{de 12} e as correlações de extinção Bawendi e colegas de trabalho ^13. Veja o Apêndice para mais detalhes.
11. Mercury de permuta catiónica: os nanocristais pode ser parcialmente permutado com mercúrio para vermelho-deslocar a absorção e emissão de fluorescência. Misture a seguir, em conjunto, a fim de um frasco de vidro de 20 ml com barra de agitação (esta reacção pode ser dimensionada como desejado): 3 ml de hexano, 2 ml de clorofórmio, 1 mL de Cd ^ M 200Se solução QD (200 nmol), 15 ul de oleilamina (OLA), e 500 ul de uma solução 0,1 M de Hg (OT) ₂ em clorofórmio. Mercury octanethioate (HgOT ₂₎ podem ser preparados por reacção de acetato de mercúrio e octanethiol em metanol (ver apêndice). À medida que os catiões reacção prossegue de câmbio, o grau de deslocamento vermelho pode ser monitorizada com UV-Vis espectrofotometria de absorção. Depois a banda de absorção desejada tenha sido atingida, medir a absorção da solução de nanocristais em 350 nm e determinar o coeficiente de extinção novo, partindo do princípio de que a concentração dos nanocristais não foi alterada (30,7 uM neste exemplo). Extingue-se a reacção pela remoção do mercúrio que não reagiu: adicionam-se 5 ml de decano, 10 ml de hexano e 7 ml de metanol e extrai-se a solução, mantendo-se a fase superior que contém os nanocristais. Extrair duas vezes com hexano e metanol, e ajustar o volume de metanol de modo a que a fase superior é de aproximadamente 7 ml. Se as fases são lentos a separar-se, a solução pode ser centrifugada (5000 xg,10 min). Adicionar 100 ul TOP, 100 OLA ul e 100 ul de ácido oleico para os nanocristais seguidos por 40 ml de acetona para induzir a precipitação. Colete os nanocristais através de centrifugação e dispersar em 3 ml de hexano. Centrifugar novamente para remover os componentes insolúveis, e determinar a concentração de nanocristais de novo, utilizando o coeficiente de extinção a 350 nm novo. Permitir que a solução de nanocristais de idade, pelo menos, 24 horas a temperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte.

2. Crescimento de sulfeto de zinco Cádmio (Cd _y Zn _1-y S) Shell

1. Preparar soluções 0,1 M de precursores de casca, em 50 ml de 3 tubuladuras erlenmeyer. Cádmio precursor: hidrato de acetato de cádmio (230,5 mg, 1 mmol) e 10 ml de oleilamina (OLA). Precursor de zinco: acetato de zinco (183,5 mg, 1 mmol) e 10 ml OLA. Precursor de enxofre: enxofre (32,1 mg, 1 mmol) e 10 ml ODE. Sob vácuo, aquecer cada solução a refluxo durante 1 hora para se obter soluções límpidas, e, em seguida, carregar-se com árgon. A solução de enxofre podeser arrefecida até à temperatura ambiente, mas os precursores de cádmio e de zinco são mantidos a aproximadamente 50 ° C. Os cálculos das quantidades de precursor de casca podem ser encontrados na referência 14.
2. Adicionar a um frasco de 3 tubuladuras de: Cd Hg _{x 1-x} Se QDs (120 nmol, 2,3 mm de diâmetro), ODE (2 ml), e óxido de trioctylphosphine (TOPO, 250 mg). Evacuar fora do hexano, à temperatura ambiente utilizando a linha de Schlenk. Aumentar a temperatura para 100 ° C e refluxo, durante 15 min. Alterar a válvula da linha de Schlenk de árgon ou de azoto gasoso e inserir o termopar na solução de nanocristais.
3. Aumentar a temperatura para 120 ° C, adicionar 0,5 monocamadas de solução precursora de enxofre (140 ul), e permitir que a reacção prosseguir durante 15 min. Alíquotas pequenas (<50 ul) podem ser removidos utilizando uma seringa de vidro para monitorar o progresso da reacção utilizando fluorescência e / ou UV-Vis espectrofotometria de absorção. Aumentar a temperatura para 140 ° C, adicionar 0,5 monocamadas de solução precursora de cádmio (140 ul), e permitir que a reacção prosseguir durante 15 min. Adicionar 500 ul de OLA anidro à solução de reacção.
4. A 160 ° C adicionar 0,5 monocamadas de solução precursora de enxofre (220 uL) seguido por uma quantidade igual de solução de precursor de zinco a 170 ° C com 15 minutos entre cada adição. Em seguida, a 180 ° C adicionar 0,25 monocamadas de solução precursora de enxofre (150 ul) e uma solução de precursor de zinco em intervalos de 15 min.
5. Arrefece-se a solução à temperatura ambiente e novamente calcular um coeficiente de extinção de novo para essas partículas, utilizando um espectro de UV-Vis, assumindo que o número de nanocristais não mudou (120 nmol em 3,8 ml solução de reacção). Armazene a solução de reacção como uma mistura em bruto num congelador; os nanocristais podem ser descongeladas e purificados conforme necessário, utilizando o mesmo método descrito nas secções 1.8 e 1.9.
6. Os nanocristais podem ser caracterizados utilizando microscopia electrónica, espectroscopia UV-Vis, absorção e espectroscopia de fluorescência. Rendimento quântico pode sercalculado absolutamente usando uma esfera de integração ou relativamente, em comparação com um padrão conhecido, utilizando os métodos de referência 15.

3. Transferência de Fase

1. Adicionar purificado núcleo / invólucro Hg _x Cd _1-x Se / _y Zn Cd _1-y S QDs (5 ml, 20 mM) a 50 ml de 3 tubuladuras e remover o hexano sob vácuo forte para se obter uma película seca. Encher o balão com árgon, adicionar piridina anidra (3 ml) à película de nanopartículas e aquecer a suspensão a 80 ° C. Ao longo de 1-2 h as nanopartículas irá dissolver completamente.
2. Adicionar 1-tioglicerol (1 ml) à solução e agita-se a 80 ° C durante 2 horas. Em seguida, arrefecer a solução até à temperatura ambiente e adicionou-se trietilamina (0,5 ml) para desprotonar tioglicerol. Agita-se durante 30 min. A solução pode tornar-se turva após a adição de trietilamina, devido à fraca solubilidade de nanocristais polares desta mistura de solventes.
3. Transferir a solução para um QD 50 ml cont tubo de centrífuga cónicoaining uma mistura de 20 ml de hexano e 20 ml de acetona, e misturar bem. Isolar os nanocristais precipitados através de centrifugação (5000 xg, 10 min), e lavar o sedimento com acetona.
4. Dissolve-se o pellet QD em DMSO (5 ml) com ultra-sons de banho, e em seguida de centrifugação (7000 xg, 10 min) para remover agregados possíveis. Determinar a concentração das nanopartículas de um espectro de absorção no UV-Vis. Esta solução de QDs puros deve ser utilizada no prazo de 3 horas, como os tióis de superfície pode oxidar lentamente em condições ambientes, ao ar.
5. Dilui-se a solução QD para 10 uM ou menos com DMSO e transferir para um balão graduado de 50 ml. Prepara-se uma solução de 5 mg / ml de ácido poliacrílico tiolada (síntese descrita no Apêndice) em DMSO. Adicionar a solução de polímero (0,15 mg de polímero por nmol QDs) gota a gota à solução com agitação QD e desgaseificar a solução à temperatura ambiente durante 5 min.
6. Purgar a solução QD / polímero com árgon e de calor a 80 ° C durante 90 min. Em seguida, arrefecer a solução até à temperatura ambiente de umd gota a gota adicionar um volume igual de borato de sódio 50 mM, pH 8. Agita-se durante 10 min.
7. Purificar os QDs através de diálise (20 kDa de corte), em borato de sódio 50 mM, pH 8, e, em seguida, concentrar as partículas utilizando um filtro de centrífuga (10 de corte kDa). Determinar a concentração de um espectro de absorção no UV-Vis.

4. PEG Revestimento

1. Num frasco de vidro de 4 ml com barra de agitação, uma mistura QDs nmol em tampão de borato com um excesso molar de 40.000 x 750 Da monoamino-polietileno-glicol (30 mg, 40 umol). Se uma funcionalidade química específica, deve ser adicionado aos nanocristais (por exemplo, hidrazida ou maleimida), pode ser introduzido através da substituição de uma fracção do amino-PEG com um amino-PEG heterobifuncional (30% fracção molar normalmente funciona bem). Dilui-se a solução de nanocristais de 1 uM com tampão de borato. Esta reacção pode ser dimensionada como desejado.
2. Prepara-se uma solução fresca de DMTMM (20 mg, 72 umol) em DMSO (144 ul). Esta solução pode ser aquecida brevemente under um fluxo de água da torneira quente ou submerso num banho de ultra-sons para dissolver completamente o DMTMM. Rapidamente adicionar um excesso de 25.000 x molar desta solução 0,5 M DMTMM (50 ul) à solução QD e agitar à temperatura ambiente durante 30 min.
3. Repetir o passo 4,2 mais quatro vezes para saturar a superfície de nanocristais com PEG. Finalmente, adiciona-se 200 ul de tampão Tris 1 M para parar a reacção e purificar os nanocristais utilizando diálise, filtros centrífugos, ou ultracentrifugação.
4. Os nanocristais podem ser analisadas para monodispersity, tamanho hidrodinâmico, e carga de superfície utilizando a cromatografia líquida, electroforese em gel de agarose, e microscopia de fluorescência. Para determinar o tamanho e distribuição de tamanho hidrodinâmico utilizando um sistema de cromatografia líquido automatizado (GE AKTAprime Plus), utilizar uma coluna de Superose 6, uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min com PBS eluente tampão, e detecção de absorção a 260 ou 280 nm. Comparar os tempos de eluição de nanopartículas com os de padrões de peso molecular. Por eletroforese em gel de agaroseresistência, preparar um gel de agarose a 0,5% em 50 mM de tampão de borato de sódio (pH 8,5) ou 50 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 7,4), misturar amostras de 1 uM, com 10% de glicerol e de carga em poços, e rodar a 100 V durante 30 min . Imagem os nanocristais no gel usando uma varinha de mão UV ou luz UV e para a excitação de fluorescência. Para os nanocristais imagem ao nível única molécula utilizando a microscopia de fluorescência, diluir as partículas para 0,2 nM em tampão fosfato 10 mM, 2,5 ul de soltar a solução sobre uma lamela de vidro e coloque cuidadosamente uma segunda lamela por cima do cordão de líquido para espalhar uma película entre as lamelas. Imagem da superfície ligados partículas usando um objetivo alta abertura numérica (o ideal é pelo menos 1,40) em modo de epifluorescência ou TIRF com excitação em comprimentos de onda entre 400-580 nm e um elétron-multiplicação da câmera CCD. Parâmetros de imagem exactas variarão entre a configuração de microscopia.

Resultados

A Figura 2 representa a absorção representante e espectros de fluorescência de nanocristais de CdSe, _x Hg Cd nanocristais _{1-X SE} depois de troca de cátions e Hg _x CD _1-X SE / Cd _y Zn _1-y S nanocristais após crescimento shell. Os nanocristais CdSe núcleo ter um rendimento quântico de fluorescência perto de 15% (incluindo o comprimento de onda de emissão de armadilha de profundidade), mas este rendimento cai para menos de 1% depois...

Discussão

Em relação ao convencional pontos quânticos de CdSe, ternário liga Hg _{x CD} nanocristais _{1-X SE} pode ser ajustado em tamanho e comprimento de onda de fluorescência de forma independente. O tamanho é primeiro seleccionado durante a síntese de núcleos CdSe nanocristais, e o comprimento de onda de fluorescência é escolhido de um passo secundário de troca de catiões de mercúrio, o que não altera substancialmente o tamanho dos nanocristais ^9. É importante para permitir que o Hg ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Selênio	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphine	Strem	15-6655	97% puro, instável em ar
Óxido de cádmio	Sigma-Aldrich	202894	Altamente tóxico: uso cautela
Tetradecylphosphonic ácido	Síntese PCI	4671-75-4
Octadeceno	Alfa Aesar	L11004	Grau técnico
Hexadecilamina	Sigma-Aldrich	H7408
Difenilfosfina	Sigma-Aldrich	252964	Pirofórico
Acetato de mercúrio	Sigma-Aldrich	456012	Altamente tóxico: uso cautela
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Odor forte
Ácido oléico	Sigma-Aldrich	W281506
Acetato de zinco	Alfa Aesar	35792
Cádmio hidratar acetato	Sigma-Aldrich	229490	Altamente tóxico: uso cautela
Oleilamina	Fisher Scientific	AC12954	Instável, em ar
Enxofre	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine óxido	Strem	15-6661	99%
Piridina	VWR	EM-PX2012-6	Anidro
Tioglicerol	Sigma-Aldrich	M1753	Odor forte
Trietilamina	Sigma-Aldrich	471283	Anidro
Tubagem de diálise	Espectro Labs	131342	20 kDa de corte
Filtro centrífugo	Millipore	UFC801024	10 kDa de corte
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	Da 750
DMTMM, 4 - (4,6-dimetoxi-1 ,3,5-triazina-2-il)-4-hidrato de cloreto de methylmorpholinium	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Cromatografia Plus Sistema	GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL coluna de cromatografia	GE HealthCare	17-5172-01
Agarose, OmniPur	VWR	EM-2120
			Apêndice Síntese de mercúrio octanethiolate: Adicionar lentamente uma solução de metanol de acetato de mercúrio (1 eq.) A uma solução em agitação de 1-octanethiol (3 eq.) E hidróxido de potássio (3 eq.) Em metanol à temperatura ambiente. Isolar o mercúrio precipitado octanethiolate (II) por meio de filtração, lava-se duas vezes com metanol e uma vez com éter e, em seguida, seco sob vácuo. Síntese de polímero multidentado: Dissolver o ácido poliacrílico (1 g, 1773 Da), em 25 ml de dimetilformamida (DMF) num balão de 150 ml de três tubuladuras e de bolha com árgon, durante 30 min. Adicionar uma solução anidra de cisteamina (374 mg, 4,87 mmol) em 10 ml de DMF. À temperatura ambiente, com agitação vigorosa, adiciona-se lentamente diisopropilcarbodiimida anidro (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) ao longo de 30 min, seguido de trietilamina (170 ul, 1,22 mmol), e deixar a reacção prosseguir durante 72 horas a 60 ° C. Adicionar mercaptoetanol (501 mg, 6,41 mmol) para extinguir a reacção e agitou-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Remover DMF por meio de evaporação rotativa e isolar o polímero, com a adição de uma mistura 2:1 de gelo-acetona fria: clorofórmio, seguido de centrifugação. Dissolve-se o polímero em ~ 5 ml de DMF anidro, filtra-se precipitar novamente com éter dietílico, e de repetição. Seca-se o produto sob vácuo e armazenamento sob atmosfera de árgon. Determinação de CdSe diâmetro do núcleo: A partir do espectro de absorção no UV-Vis determinar o comprimento de onda do primeiro pico exciton (λ, em nm), o que é o pico mais longo comprimento de onda (por exemplo, cerca de 498 nm para CdSe na Figura 2a), e usar o dimensionamento curva de Mulvaney e colaboradores 12: Determinação da concentração de nanocristais CdSe: A partir de um fundo-subtraído do espectro de UV-Vis de uma solução opticamente clara de nanocristais CdSe, determinar a absorção a 350 nm de comprimento de onda. Diluições em série pode ser utilizado para determinar se a absorção óptica está dentro do intervalo linear da Lei de Beer. A concentração dos nanocristais (QD, em M) pode ser determinada ligando o diâmetro dos nanocristais (D, em nm), o valor de absorção óptica (A 3SA), e o comprimento do percurso da cuvete (l, em cm) para a equação seguinte a partir de a correlação empírica de Bawendi e colaboradores 13: