Intatta Caratterizzazione istologica di Microdevices Brain-impiantati e il tessuto circostante

Riepilogo

Qui vi presentiamo un metodo istologico per l'acquisizione, l'etichettatura, otticamente compensazione, e di imaging intatto interfaccia tessuto cerebrale intorno microdispositivi cronicamente impiantati nel tessuto cerebrale dei roditori. Risultati dalle tecniche comprendenti questo metodo sono utili per comprendere l'impatto delle varie penetranti cerebrali impianti sul loro tessuto circostante.

Abstract

La ricerca sulla progettazione e l'utilizzo di microdispositivi cervello-impiantati, ad esempio matrici di microelettrodi, mira a produrre dispositivi clinicamente rilevanti che si interfacciano per lungo tempo con il tessuto cerebrale circostante. Tessuto circostante questi impianti è pensato per reagire alla presenza dei dispositivi nel tempo, che comprende la formazione di un isolante "cicatrice gliale" attorno ai dispositivi. Tuttavia, l'analisi istologica di questi cambiamenti del tessuto viene tipicamente eseguita dopo espianto del dispositivo, in un processo che può disturbare la morfologia del tessuto di interesse.

Qui mostriamo un protocollo in cui sono raccolti corticali-impiantati dispositivi intatto nel circostante tessuto cerebrale dei roditori. Descriviamo come, una volta perfusi con fissativo, cervelli vengono rimossi e tranciato in modo da evitare dispositivi dell'espianto. Abbiamo delineare etichettatura immunofluorescenza e metodi di compensazione ottica utili per la produzione di carattere informativo, ma di spessore del tessutosezione. Infine, dimostriamo il montaggio e immagini di queste sezioni di tessuto al fine di indagare l'interfaccia biologica intorno cerebrali impiantati dispositivi.

Introduzione

Il campo di neuroprosthetic ricerca si propone di aiutare le persone che soffrono di varie disabilità e disturbi bypassando le strutture malate o danneggiate nel corpo attraverso il sistema nervoso centrale di interfacciamento ^1,2 dispositivi. Microdispositivi Brain-impiantati, ad esempio matrici di microelettrodi (MEA), può essere utilizzato per registrare o stimolare strutture cerebrali, e permettere così la creazione di interfacce a lungo termine tra l'elettronica e dei tessuti del SNC ^3-5. MEA penetranti, i dispositivi che sono conficcati nel tessuto cerebrale, promettenti come interfacce particolare a causa della vicinanza entro il quale essi presentano elettrodi a un insieme relativamente piccolo di neuroni vicini ⁶ bi-direzionali.

Tuttavia, complesso risultato tessuto risposte dal lungo termine impianto di MEA penetranti, spesso con conseguente variabili e gradualmente degradanti elettrofisiologiche segnale-rumore rapporto più giorni a mesi, e un aumento impedenza elettricazione tra i siti degli elettrodi e la massa ^7,8. Le origini putativi di questi cambiamenti includono l'attivazione della microglia, astrocitosi reattiva lungo i microdispositivi, e una perdita di neuroni o migrazione dal tessuto circostante per dispositivi impiantati ^9-11. Una sfida importante per la comprensione di questi cambiamenti del tessuto intorno croniche, AAM penetrazione è la difficoltà di acquisizione dei dati istologici dell'interfaccia tessuto intatto circostante dispositivi impiantati cronicamente ^12. L'analisi istologica del tessuto con il dispositivo / interfaccia tessuto ancora presente sarebbe migliorare l'attuale dispositivo di rimozione protocolli istologici. Con un dispositivo indisturbata rimanendo nel tessuto, l'effetto biologico di interazioni relativamente sottili, come l'utilizzo di rivestimenti biocompatibili ^13,14 o la compensazione elettrica della superficie dell'elettrodo, ^15,16 potrebbero essere esposte e analizzati rispetto all'impianto.

Hprima che si dimostra un metodo per raccogliere, elaborare, e l'immagine l'interfaccia microdispositivo intatta per microscopia dettagliata basata su un'analisi del tessuto cerebrale circostante. In questo metodo, il dispositivo e il tessuto cerebrale circostante vengono raccolti in una spessa (> 250 micron) sezione di tessuto utilizzando un vibratomo. Per migliorare la penetrazione istologico etichetta in queste fette spesse, etichette fluorescenti istochimiche ed immunoistochimiche sono applicati in concentrazioni elevate in soluzioni contenenti siero di blocco e detersivo per più giorni. Una soluzione di compensazione ottica viene utilizzato per migliorare la profondità di imaging microscopia, e il tessuto è montato in 2-sided camere per la successiva scansione laser microscopia confocale ^17. Per catturare l'interfaccia completa istologico, un computer controllato stadio traslazionale viene utilizzato durante l'imaging per raccogliere Z-stack panorami lungo la lunghezza della protesi. Oltre all'imaging applicare etichette tessuti, raccogliendo riflettanza laser indietro da impiantie la trasmissione della luce attraverso il tessuto sia aiuto localizzare l'interfaccia dispositivo in relazione al tessuto circostante. Tissue redatto utilizzando questo "Device-Capture Istologia" (DCHist) protocollo prevede l'accesso di imaging per le morfologicamente conservati tessuti / dispositivo di interazioni, e migliora così al precedente dispositivo di rimozione protocolli istologici ^18.

Protocollo

Soluzioni

Soluzione tampone fosfato (PBS) - in g / l; 9 g NaCl, 0,144 g di KH ₂ PO _4, 0,795 g di Na ₂ HPO _4, a pH 7,4

4% formaldeide - in ml / l; 202 ml di sodio fosfato bibasico soluzione (0,4 M Na ₂ HPO _4), 48 ml di sodio fosfato monobasico soluzione (0,4 M NaH ₂ PO _4), 500 ml di soluzione di formaldeide al 8%, 250 ml Milli- Q DDi acqua, a pH 7.4

HEPES salina tamponata di Hank con sodio azide (HBHS) - in g / l, 7,5 g di NaCl, 0,3 g di KCl, 0,06 g di KH ₂ PO _4, 0,13 g di Na ₂ HPO _4, 2 g di glucosio, 2,4 HEPES g, 0,05 g MgCl ₂ 6 parti di H ₂ O, 0,05 g MgSO ₄ 7 parti di H ₂ O, 0,165 g di CaCl _2, 0,09 g di NaN ₃ a pH 7,4

Soluzione di lavaggio (WS) - 1% vol / vol, néSiero di capra normale, 0,3% Triton X-100, in HBHS con sodio azide (NaN _3). Refrigerare il WS a 4 ° C prima dell'utilizzo in fasi successive.

U2 Sca l e Solution - 4 M urea, 30% glicerolo e 0,1% Triton X-100 ¹⁷

PROCEDURA

Tutti gli esperimenti sono stati fatti sotto la supervisione del Animal Care Purdue e del Comitato uso e il programma degli animali da laboratorio presso la Purdue University.

1. Chirurgia

1. Vari metodi chirurgiche asettiche sono compatibili con il metodo presentato istologico. L'uso di un telaio stereotassico e inseritori automatici sono raccomandati per migliorare l'impianto riproducibilità e controllo delle matrici di microelettrodi (MEA) angolo rispetto a piani stereotassiche.

Nota: In questa dimostrazione il nostro metodo chirurgico è il seguente: tenere il soggetto roditore in stereotassico earbars while sotto anestesia isoflurano (tra il 1-3%) portato dal medico di ossigeno grado. Test per la mancanza di una convergenza pizzico riflettono nel ratto o mancanza di un riflesso tail pinch nel topo per confermare che l'animale è completamente anestetizzato. Applicare pomate oftalmiche e pulire il sito chirurgico con tre lavaggi alternati di Betadine ed etanolo. Lavarsi le mani, guanti chirurgici, alba retina, maschera e abito. Iniettare un bolo di lidocaina per intorpidire la zona chirurgica, creare un'incisione con le forbici o un bisturi, periostio chiaro con raschietto osso e applicatori di cotone, e creare una craniotomia con un manipolo dentale trapano e punta da trapano. Guidare un singolo gambo MEA nella corteccia utilizzando un micromanipolatore. Avere un aiuto assistente chirurgico per mantenere condizioni asettiche chirurgia e documentare i progressi della chirurgia.

2. Dopo l'impianto del MEA nel cervello, raccogliere immagini attraverso un microscopio chirurgico per informare l'eventuale rimozione del cranio di tutto il bpioggia. Porzioni impiantati dei dispositivi saranno conservati in situ.

Nota: L'eventuale raccolta di tessuto con dispositivi in situ dipende strettamente corrispondente piano di inserzione del dispositivo con il piano di sezionamento tessuto. Note dettagliate sul piano di inserimento relativo dispositivo al cervello sono quindi molto importanti.

3. Dopo l'impianto del dispositivo, applicare l'elastomero siliconico Kwik-Sil (WPI), intorno a qualunque esposto MEA stinchi o dei cavi, e permettono di curare. Un pezzo di plastica sterilizzata, come una punta di pipetta taglio, può essere usato per aiutare a contenere l'elastomero di silicone in una piccola bene intorno al craniotomia durante l'indurimento.
4. Applicare uno strato di due parti acrilico dentale ("Liquid Jet" e "Powder Jet" da Lang Dental) il Kwik-Sil e qualsiasi cranio esposto.

Nota: In un passo successivo, della paletta viene fuso tramite per consentire l'impianto da separaredal cranio. UV-curing acrilico dovrebbe essere evitato il Kwik-Sil e craniotomia, come questa acrilico molto duro è difficile da rimuovere successivamente. Materiali visivamente opachi intorno all'impianto dovrebbe anche essere evitata; chiaro Kwik-Sil fornisce una vista dell'impianto durante le fasi successive di questo protocollo.

5. Eseguire le procedure di post-operatorie per la cura come da protocollo locale della normativa sul benessere degli animali, e tornare soggetti ambulatoriali per singolo ospitato gabbia-box.

2. Perfusione e raccolta dei tessuti

Nota: vedere Gage et al. per una descrizione dettagliata procedura di perfusione nel modello animale ratto ^19.

1. Utilizzare il protocollo di anestesia e perfusione approvato dalla cura degli animali dell'ente e sul comitato per l'uso. Dopo l'anestesia profondamente il roditore (confermato da una mancanza di convergenza pizzico riflesso nel ratto o coda pizzico riflesso nei topi) e di esporre il cuore, fanno poco profondi tagli a forbiceal ventricolo sinistro e dell'atrio destro. Inserire un ago smussato nel ventricolo sinistro e fornire camera temperatura PBS. Fornire un totale di ~ 10 ml PBS a ~ 5 ml / min in topi e ~ 200 ml di PBS a ~ 100 ml / min in ratti. Cercare di depurazione del sangue dal fegato durante.
2. Iniettare etichette chimiche istologicamente rilevanti transcardiaca, se lo si desidera, con la consegna siringa facendo attenzione ad evitare l'introduzione di bolle.

Nota: le etichette vascolari (ad esempio DII) e nucleici coloranti di contrasto acido (ad es Hoechst 33342) sono esempi di etichette chimiche da consegnare durante la perfusione. Quando somministrato correttamente, questi marcatori istologici dovrebbero etichettare l'intero animale ^20.

3. Consegnare tamponata, temperatura ambiente, 4% di formaldeide transcardiaca per fissare l'animale. Evitare di perforazione del setto attraverso il cuore, che può essere evidenziato da polmone naso drenaggio durante la perfusione. Se vuoi inserire tremori fissaggio dei muscoli grandiper indicare perfusione completo. Consegnare un totale di ~ 10 ml di fissativo a ~ 5 ml / min nei topi e ~ 200 ml di fissativo a ~ 100 ml / min nei ratti.
4. A seguito di perfusione, decapitare l'animale, esporre una parte del tronco cerebrale o del cervelletto con rongeurs o forbici, e la testa posto in soluzione di formaldeide al 4% per una notte a 4 ° C.
5. Lavare la testa in tre cambi di PBS con 1-4 intervalli di un'ora tra un lavaggio.
6. Conservare teste fisse in HBHS contenenti sodio azide a 4 ° C per giorni o mesi.

3. Rimozione cervello con Dispositivi situ

Nota: Eseguire questa sezione in una cappa aspirante indossando opportuni dispositivi di protezione. Evitare l'essiccamento dei tessuti restituendo la testa fissa per HBHS soluzione periodicamente.

1. Attenzione sezionare via la pelle e altri tessuti provenienti da tutto il calotta acrilica con pinze e forbici piccole.
2. Indossando calore-iguanti nsensitive, usare un saldatore per rimuovere acrilico dentale ed esporre una superficie di base chiara Kwik-Sil (Figura 2a).

Nota: Lo scopo di questo passo è consentire micro-forbici un appropriato angolo di accesso a posizioni in cui i dispositivi impiantati entrano nel cervello, in modo che cerebrali impiantati componenti possono essere separati dai componenti fissati al cranio.

3. Sotto un microscopio chirurgico, tagliato in elastomero di silicone con curve micro-forbici, eliminando piccoli pezzi di Kwik-Sil con pinzette fino alla posizione in cui i dispositivi di entrare nel cervello.
4. Continuare il taglio lungo la superficie della craniotomia con curve micro-forbici a componenti separati di dispositivi collegati al polisilicio e cranio da componenti impiantati nel cervello. Anche in questo caso usare l'ingrandimento del microscopio e grande attenzione quando si tagliano attraverso i componenti del dispositivo esposti, avendo cura di evitare di spingere o trascinare l'implanti nel tessuto fisso.
5. Togliere l'osso intorno al Cuffia con cura usando rongeurs. Utilizzare una spatola per separare il cervello con dispositivi impiantati dal cranio. Conservare il cervello in soluzione HBHS fino al momento di tagliare.
6. Posizionare il cervello in un piatto di vetro riempito di Petri HBHS, e uso di un rasoio per rimuovere il tessuto estraneo, come midollo spinale, cervelletto, o bulbo olfattivo, a seconda che sono rilevanti per la posizione del dispositivo di impianto. Utilizzare un blocco cerebrale (Ted Pella) e lame di rasoio alla sezione del cervello e creare un piano piatto ampiamente le angolo dei dispositivi impiantati, questo è realizzato mettendo il cervello in un blocco cervello di dimensioni adeguate, orientando il cervello tale che qualsiasi parte visibile dell'impianto è parallelo alla guida di lama di rasoio, e mettendo una lama di rasoio in un guidalama almeno 2 mm dall'impianto. Premere il lametta attraverso il tessuto. Montare questa superficie ad una piattaforma vibratomo. Alternamente, una lama di rasoio montato un micromanipolatore può essere utilizzato in modo altrettanto controllato come il blocco cervello per creare un piano strettamente corrispondente alla direzione dell'impianto.
7. Posizionare ghiaccio sotto la piattaforma vibratomo, e, dopo aver lasciato la superficie del tessuto ad asciugare brevemente su un tovagliolo di carta, aderiscono il cervello a un vibratomo con Super Glue. Incollare il piano di tessuto piatto creato nel passaggio precedente è allo stadio. Con dimensioni di tessuto asimmetrici, orientare il campione in modo che la dimensione maggiore viene incollato parallelo alla direzione di movimento della lama vibratomo per evitare la lama potenzialmente battendo il tessuto sopra. Dopo i set colla (~ 1-2 min), aggiungere refrigerati (~ 4 ° C) PBS al piatto vibratomo intorno al tessuto.
8. Raccolta di sezioni di tessuto dello spessore tra 200-400 micron, compresi i tessuti di controllo, utilizzando la massima velocità di vibrazione (~ 100 Hz) e una lenta progressione lama (<0,2 mm al secondo), con un angolo di 10 ° lama da Horizontal. Raccolta di sezioni accuratamente con una spatola o pennello scoop e conservare in HBHS in una piastra a 24 pozzetti a 4 ° C.
9. Una volta che il dispositivo in situ è visibile ad occhio nudo o un microscopio chirurgico, raccogliere sezioni più sottili di avvicinarsi al dispositivo in incrementi fetta di 100 um o meno.

Nota: tipiche di silicio micro-impianti sono visibili ad occhio nudo in formaldeide-fisso tessuto corteccia cerebrale di roditori tra 300 e 500 micron dalla superficie del dispositivo.

10. Con il dispositivo in situ ora vicino alla superficie del tessuto, raccogliere una fetta tessuto> 250 micron contenente il dispositivo all'interno. Stima dello spessore necessario può essere aiutata da fette di riferimento precedentemente raccolti.

Nota: i dispositivi più grandi, dispositivi multidenti e dispositivi ad angolo possono richiedere fette di tessuto spessi (> 500 micron) per catturare il dispositivo in un solo pezzo del tessuto; remembro che sia la penetrazione di etichette applicate e la profondità di imaging microscopia sarà limitata nella eventuale raccolta dati da queste fette molto spesse. Se possibile, evitare di colpire il dispositivo con la lama vibratomo, come questo può causare trascinamento del dispositivo attraverso la deformazione dei tessuti e morfologiche.

4. Tessuto di esecuzione e compensazione

1. Lavare 3 volte a fette di 5 minuti per lavaggio in HBHS
2. Incubare in boroidruro di sodio (5 mg NaBH _4/1 ml di HBHS) per un totale di 30 min (15 min ogni lato della fetta). Capovolgere le fette con un acciaio inossidabile o in Teflon rivestito cucchiaio micro e pennello piccolo (Ted Pella). Movimenti lenti e riflessivo migliorare il successo di ciascun flip fetta. Evitare di toccare le aree intorno al dispositivo impiantato con il pennello. Quando possibile, aggiungere la soluzione notevolmente più richiesto (> 2 ml) permette di manipolare e capovolgere le fette di tessuto più facilmente.

Nota: Questo passo riduce endogena autofluorescenza, saltare questo passaggio se le etichette fluorescenti sono state applicate durante la perfusione o XFP marcatori transgenici sono presenti.

3. Lavare 3x fette a 5 min a lavaggio in soluzione di lavaggio a temperatura ambiente.

Nota: agitazione durante le fasi di lavaggio e l'incubazione è opzionale. Gli autori ipotizzano che sottile stridente dell'impianto rigida rispetto al tessuto cerebrale circostante può verificarsi con agitazione. Tuttavia, un mixer orbitale spostano ad una velocità dolce (<60 rpm) può evitare questo, aumentando la circolazione di soluzioni.

4. Blocco per 2 ore in soluzione di lavaggio a temperatura ambiente (a fogli mobili fette dopo un'ora).
5. Incubare in anticorpi primari (diluito in soluzione di lavaggio) per circa 48 ore (24 ore su ciascun lato della fetta) a 4 ° C.
6. Effettuare 3 lavaggi rapidi 6 min con soluzione di lavaggio.
7. Eseguire 6, 1 ora (3 lavaggi lavaggioes su ciascun lato del tessuto slice) in soluzione di lavaggio (conservare a 4 ° C durante la notte se lavaggio).
8. Incubare in anticorpi secondari (diluito con soluzione di lavaggio) per circa 48 ore (24 ore per lato) a 4 ° C.
9. Effettuare 3 lavaggi rapidi 6 min con soluzione di lavaggio.
10. Eseguire 6, 1 ora lavaggi (3 lavaggi su ogni lato) in soluzione di lavaggio, conservare a 4 ° C, se il lavaggio durante la notte.
11. Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere il glicerolo-based "U2 - Sca l e" soluzione di compensazione. Permette di cancellare circa 1 settimana per fette spesse (250-500 micron) o 2-3 settimane per sezioni di tessuto di grande spessore (> 500 micron) a 4 ° C.
12. Coprire la piastra con pellicola e conservare a 4 ° C.
13. Montare in diapositive in grado di ospitare sezioni di tessuto di spessore (figura 2b, 2c) con la soluzione di compensazione come mezzo di montaggio e sigillatura con smalto trasparente. Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce.

5. Panorama Imaging di Full TiUMERO e Device Interface

1. Utilizzo di più lungo lavoro obiettivi microscopio a distanza (> 2 mm), iniziano di esposizione con un microscopio confocale a scansione laser o 2-fotone microscopio. Dimostreremo con una Zeiss LSM 710, Carl Zeiss software "Zen" (2010), e un computer controllato fase XY si traducono in immagine un panorama 3D attorno ad un impianto.

Nota: corretto per l'indice di rifrazione della soluzione di compensazione sia in software, attraverso un collare correttivo sull'obiettivo, o nel trattamento dei dati dopo la raccolta. In questa dimostrazione si entra in un valore indice di rifrazione per la soluzione di compensazione "U2" di 1,4 nel Zen software microscopio Leica, questa impostazione consente di regolare in modo sottile z-passo intervalli per spiegare mancata corrispondenza indice di rifrazione.

2. Nel tessuto in prossimità del dispositivo, più o meno valutare le opportune asse z impostazioni di una raccolta delle finestre e dati nella z-dimensione per ciascun canale fluorescente con laser a bassa potenza (~ 00,5-5%) e di grandi dimensioni z-passo (> 25 micron).

Nota: Includere spazio sopra e sotto quando si imposta l'asse z durante la configurazione per panoramica raccolta dei dati, in quanto il tessuto non può trovarsi completamente piatto sul vetrino (~ 20 micron per ogni direzione).

3. Impostare l'obiettivo al centro xy del panorama finale, utilizzando il software Zen panorama, determinare il numero di posizioni di raccolta richieste per ogni asse (x e y) per coprire la vostra regione di interesse.
4. Rivalutare e finalizzare l'asse z finestra di raccolta.
5. Impostare manualmente la sensibilità del rivelatore e la potenza del laser a far decollare in modo appropriato con maggiore profondità, lo scopo è in genere di mantenere all'incirca la stessa intensità dell'immagine a qualsiasi profondità di imaging nella sezione tessuto, ma per evitare anche il rumore di fondo elevato.
6. Raccogliere ogni fluorescente serie di immagini di dati. Se necessario, per evitare la sovrapposizione di segnali, eseguire linea lasers sequenziale.

Nota: Se disponibile, impostare il software di salvare automaticamente i dati sul disco rigido durante la raccolta.

7. Modificare le impostazioni del software per raccogliere la "riflessione" e "trasmittanza" dati, e utilizzare più una, laser lunghezza d'onda più penetranti (per esempio 633 nm) per catturare questi canali. Determinare la potenza del laser e la sensibilità del rivelatore per "riflessione" e raccolta "trasmittanza" e ripetere la stessa serie di raccolta intorno al dispositivo impiantato.
8. Esportare i dati per l'elaborazione successiva, quantificazione e analisi.

Risultati

MEA cervello impiantati possono essere raccolti in fettine di tessuto dal primo separando eventuali cranio montati componenti dal cervello incorporate componenti. Figura 2a mostra i risultati di rimozione di un lato di una paletta in cemento dentale ed una porzione di Kwik-Sil circonda un cavo MEA su un cranio ratto. Un saldatore è stato utilizzato per rimuovere il cemento dentale e Kwik-Sil in una cappa aspirante. Il cablaggio e le strutture non sono stati impiantati MEA prossima tagliati con micro-forbici lentamente scavando attraverso il Kwik-Sil fino alla superficie del cervello fisso.

Dopo il taglio, l'etichettatura, e la rimozione dei tessuti, semplici misura diapositive sono utili per il montaggio delle fettine di tessuto di spessore (Figura 2b). Una fetta cervello montato contenente un microdispositivo impiantato è mostrato in Figura 2c. Imaging attraverso entrambi i lati della slitta può consentire di valutare l'interfaccia intorno a un dispositivo, come mostrato in figura 3 , dove microglia lungo il supporto di silicio di un MEA sono visibili da un lato (Figura 3a) e microglia lungo degli elettrodi e tracce sono visibili sul lato opposto (Figura 3b).

Una volta montato, il tessuto può essere ripreso utilizzando una piattaforma di traslazione XY. Panoramica di etichette fluorescenti attraverso intere fette di tessuto può essere generato con la risoluzione desiderata (Figura 4). Esame dettagliato dell'interfaccia tessuto morfologicamente conservati intorno microdispositivi impiantati possono essere raccolti ad alti ingrandimenti per l'analisi della risposta del tessuto locale (Figura 5).

Figura 1. Panoramica della procedura. (Ac) Cervello micro-impianto interventi sono finalizzati con uno strato di polimero Kwik-Sil immediatamente circostante il dispositivo, seguito da un rivestimento cemento acrilico. (D, e) eutanasia seguito, lo strato acrilico viene bruciata, e cranio montati componenti del dispositivo sono separati dai componenti impiantati tagliando attraverso l'elastomero siliconico. (F, g) Il cervello viene quindi rimosso dal cranio e viene tagliato e montato alla fase vibratomo. (Hk) fette di tessuto sono raccolti, compresa una fetta tessuto contenente il dispositivo. (L) del tessuto possono essere elaborati e montati in camere personalizzate per la microscopia dettagliata. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. (A) Cancellare Kwik-Sil do elastomero di siliconerrounding un elettrodo-array cavo (freccia) è stato esposto da bruciando una finestra nel tappo cemento dentale sulla testa di un roditore perfuso con un saldatore. (B) Per accogliere l'imaging in entrambi i lati di una fetta tessuto spesso, semplice "slide-camere" può essere realizzato tagliando un vetrino coprioggetto plastica e aderendo ai lati intorno al tessuto e soluzione di montaggio. (C) Un cervello di ratto fetta del tessuto con l'impianto intatto (freccia rossa) viene mostrato dopo il montaggio. Entrambi i lati del tessuto è rapidamente accessibile a immagini di microscopia con questa configurazione. Per scala, pannello (a) è di 25 mm di diametro in basso, mentre i pannelli (b, c) sono 80 mm di diametro in basso.

Figura 3. Int massimaensity z-proiezioni di 40 micron stacks di immagini spesse, raccolte attorno al retro (a) e anteriore (b) di una matrice microelettrodo impiantato. Microglia (marcato con anti-Iba1 e Alexa Fluor 633, bianco) e la riflessione della luce laser (rosso), raccolte dalla superficie del dispositivo, sono stati sequenzialmente ripreso da entrambi i lati di una fetta tessuto 400 micron di spessore. Come gli impianti cerebrali sono spesso opaco, montaggio con accesso ottico ad entrambi i lati fornisce una chiara visione di strutture tessutali etichettati "dietro" dell'impianto rispetto all'obiettivo microscopio. Scala bar 50 pm.

Figura 4. Una fetta DCHist etichettato ripreso utilizzando un computer controllato tappa di un microscopio confocale a scansione laser. (A) nuclei cellulari (colorate con Hoechst 33342) e (b) monociti / microglia(Contrassegnato con anti-Iba1) sono stati contemporaneamente stampato su canali separati. (C) trasmissione di luce e la riflettanza sono stati raccolti, che mostra la posizione del 4-settimane impianto rispetto a Hoechst e Iba1 dati. (D) Sovrapposizione di tutti i canali di trasmissione, ma è anche mostrato. L'area rettangolo bianco si espande nelle immagini che appaiono a destra. Scala bar 1 mm.

Figura 5. Utilizzando un computer controllato da tavolino del microscopio e software appropriato, dati di immagini panoramiche possono essere raccolti intorno all'impianto. Riflettanza (a) e trasmittanza (b) consentire una localizzazione del dispositivo, mentre le etichette fluorescenti anticorpo o chimiche (c, anti-Iba1 etichettatura della microglia e macrophages) permettono immagini dettagliate delle componenti del tessuto lungo l'interfaccia tessuto intatto. Scala bar 200 micron.

Discussione

Il "Device-Capture Istologia" (DCHist) metodo illustrato qui consente la valutazione istologica stretta delle interazioni morfologicamente conservate tra i tessuti cerebrali e impianti di tessuto. Tessuto collezione DCHist richiede un'attenta separazione del cranio montati componenti del dispositivo da componenti impiantati nel cervello. DCHist richiede anche la raccolta di una grossa fetta del tessuto istologico (> 250 micron). Queste sezioni di tessuto, una volta etichettati, eliminato, montato, e con immagini, in grado di fornire nuove intuizioni nel pregiudizio impianto o cronica conseguente risposta ai dispositivi a permanenza. Utilizzando strumenti di microscopia avanzata, l'interfaccia tra il tessuto e il dispositivo può essere ripreso e analizzato in dettaglio alto come mostrato nelle figure 3-5.

Le tecniche presentate nella loro forma attuale si basano sulla capacità di scavare lentamente il Cuffia realizzata in due parti di cemento dentale e Kwik-Sil fino al punto di impianto del dispositivo.Utilizzando cemento dentale che può essere bruciato o rimosso e un elastomero silicone trasparente attraverso cui piccole forbici può essere guidato visivamente grande aiuto nel successo separare il dispositivo impiantato dalle cranio montati componenti. Tentativo di ridurre il dispositivo sotto il cranio e sopra il cervello per raccogliere in situ non è raccomandato, come il cranio montato impianto sarà estratta dal cervello una quantità significativa.

Anche se più sottili, gli impianti più piccoli, come singoli accordi multilaterali gambo di Tecnologie NeuroNexus, sono più suscettibili di DCHist, i principi non sono limitati a gambo singolo dispositivo o matrici di microelettrodi. Raccolta e strategie di imaging sono sostanzialmente applicabili ai dispositivi multi-gambo e grandi impianti come cannule, con i requisiti è che essi devono essere separati da qualsiasi supporto cranio e raccolte all'interno di una sezione di tessuto di spessore. Sebbene gli autori sono focalizzati sulla analisi del tessutocircostanti gli impianti corticali, i dispositivi guidati più in profondità nel cervello potrebbe anche essere raccolte e ripreso. La profondità di inserimento dell'impianto non dovrebbe influenzare la cattura dell'impianto in una fetta fornito il dispositivo non si discosta notevolmente da l'angolo noto di inserimento.

Limitazioni esistono per l'utile applicazione del metodo DCHist. Sezioni di tessuto cerebrale sono difficili da immagine attraverso centinaia di micrometri, soprattutto nelle aree di sostanza bianca, anche se le soluzioni di compensazione ottica può notevolmente migliorare la profondità di imaging in diversi tessuti ^21. Per migliorare ulteriormente la profondità di imaging, microscopia a due fotoni di eccitazione può essere impiegato insieme con la compensazione ottica descritta.

Un'altra potenziale limitazione del metodo descritto può essere i metodi specifici immunoistochimica fluorescenti e anticorpi impiegati dai ricercatori. Diffusione passiva spinge in genere l'integrazione di questi marcatori attraverso il tessuto fissoe sui siti di legame dell'antigene. Le concentrazioni finali di lavoro degli anticorpi deve essere determinata dai ricercatori su un caso per caso per massimizzare la penetrazione del marchio, evitando alti livelli di etichettatura sfondo. Etichettatura anticorpo non deve essere variabile tra fette che vengono elaborati in modo identico, ma differenti anticorpi possono variare notevolmente nella loro capacità di penetrare e contrassegnare loro antigene, con alcuni anticorpi facilmente etichettatura antigeni molte centinaia di micrometri profonde e di altri antigeni etichettatura solo decine di micrometri profonda. Descriviamo migliorare questa diffusione applicando etichette anticorpali superiori a concentrazioni tipiche, per più giorni di applicazione, e in una soluzione contenente detergente diluita e bloccando siero. Periodicamente lanciando le fette promuove anche l'etichettatura. Fasi di recupero Antigen e processi di fissaggio alternativi (ad esempio glutaraldeide, forno a microonde, ecc) può essere adatto per antigeni specifici. Anticorpo secondario-fluorochconiugati roma possono variare anche in loro prestazioni etichettatura sezioni spesse, anche se questo non è stato osservato dagli autori con Alexa Fluor etichette da Invitrogen. In alternativa, soggetti animali transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti nei tipi cellulari di interesse può essere utilizzato per evitare problemi con la penetrazione anticorpo etichetta, come molte proteine ​​fluorescenti come eGFP, mantengono la loro fluorescenza dopo trattamento con formaldeide, e può essere immediatamente visualizzata in sezioni di tessuto.

DCHist è un potente insieme di tecniche per catturare e analizzare l'impatto di microdispositivi impiantati sul tessuto cerebrale. Giunto questo protocollo istologico con valutazione in vivo della qualità elettrofisiologia e dati di impedenza elettrodo ²² potrebbe migliorare notevolmente la nostra comprensione delle origini biologiche della variabilità fisiologia e del degrado. Il campo di impiantati dispositivi protesici neurali, in particolare, possono beneficiare il dettaglio DCHist imaging del dispositivo intatto / tessuto di interfaccia per informare ulteriore sviluppo biologicamente neutrali dispositivi MEA.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagenti
Hoechst 33342	Invitrogen	14533	DNA marcatore
Coniglio anti-Iba1	Wako (Giappone)	019-19741	Anticorpo monociti
Acrilico dentale	Lang Dental (vari distributori)	Jet protesi polvere Repair & Liquid	Cuffia costruzione
Kwik-Sil	Mondo Strumenti di precisione	KWIK-SIL	Copertura esposti impianti craniali
Siero di capra normale	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Tessuto di elaborazione
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Tessuto di elaborazione
Urea	Sigma-Aldrich	U4883	Cancellazione soluzione
Glicerina	Sigma-Aldrich	G20225	Cancellazione soluzione
			Attrezzatura
Curve micro-forbici	Mondo Strumenti di precisione	14208	Impianto di taglio prima di rimuovere il cervello
Lamette da barba	Ted Pella	(Varie dimensioni)	Per l'utilizzo con blocco del cervello
Acrilico Cervello Matrice	Ted Pella	15054	Cervello blocco per creare piano di partenza nel tessuto
Scivoli di plastica	Ted Pella	260225	Tessuto di montaggio
Copertura in vetro	Ted Pella	(Varie dimensioni)	Tessuto di montaggio
Elettrodi array	NeuroNexus Technologies	(Diverse versioni)	Esempio MEA
Vibratomo	Leica	VT1000 S	Sistema specifico utilizzato nel metodo presentato
Lame vibratomo	(Diversi fornitori)		Raccolta fette
Piastre da 24 pozzetti	(Diversi fornitori)		Memorizzazione ed elaborazione fette di tessuto
Microscopio confocale a scansione XY motorizzata stadio	Carl Zeiss Microscopy	Software Zeiss LSM 710 e 'Zen 2010'	Sistema specifico utilizzato nel metodo presentato
Saldatore	(Diversi fornitori)		Lavori di scavo Cuffia