Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

Riepilogo

Nucleasi di stilisti come nucleasi dito di zinco (ZFNs) e attivatore di trascrizione come nucleases effettrici (Talens) possono essere utilizzati per modificare il genoma di embrioni preimpianto di topo attivando sia la fine nonhomologous giunzione (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) percorsi. Questi progressi consentono la rapida generazione di mouse con precise modificazioni genetiche.

Abstract

Topi transgenici portatori modificazioni sito-specifiche genoma (knockout, knock-in) sono di importanza vitale per sezionare sistemi biologici complessi nonché per la modellazione malattie umane e testare strategie terapeutiche. I recenti progressi nell'uso di nucleasi design come nucleasi dito di zinco (ZFNs), trascrizione attivatore-come nucleases effettrici (Talens), ed i cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) / CRISPR-associato (CAS) Sistema 9 per il sito- specifico ingegneria genomica aperta la possibilità di effettuare una rapida modificazione genoma mirata in virtualmente qualsiasi specie di laboratorio senza la necessità di fare affidamento su staminali embrionali (ES) tecnologia cellulare. Un esperimento editing genoma inizia tipicamente con l'identificazione di design nucleasi siti bersaglio all'interno di un gene di interesse seguita dalla costruzione di domini leganti il ​​DNA personalizzati per dirigere l'attività nucleasi al locus genomico investigatore definito. Plasmidi Designer nucleasi sono in vitro </ Em> trascritto per produrre mRNA per la microiniezione degli ovociti di topo fecondati. Qui, forniamo un protocollo per realizzare la modifica del genoma di mira da iniezione diretta di TALEN mRNA in oociti di topo fecondati.

Introduzione

I topi sono di gran lunga la piattaforma più popolare per la generazione di modelli animali transgenici. Il toolbox versatile per l'ingegneria genetica dell'embrione topo ^1-3 è stato recentemente prorogato di approcci di modifica del genoma basato su nucleases stilisti come nucleasi dito di zinco (ZFN) ^4-6, trascrizione nucleases effettrici attivatore-like (Talen) ^7,8, ed i cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) / Sistema CRISPR-associato (CAS) ⁹ 9. ZFN e la funzione TALEN come coppie di due domini progettati su misura a base di proteine ​​che legano il DNA (array di proteine ​​dita di zinco e ripetere variabile di-residui (RVDS), rispettivamente) che sono ciascuno accoppiato al endonucleasi FokI ^10-12. Viceversa, la specificità di taglio del DNA Cas9-mediata è fornito da transattivazione RNA CRISPR (crRNA e tracrRNA, che possono anche essere combinati in una singola molecola di RNA chimerico guida definito RNA) ¹¹ che agiscono in un complesso con l'Proteine ​​CRISPR.

Talens con una sequenza definita di RVDS può essere rapidamente costruito dagli sperimentatori individuali con una moltitudine di strategie di assemblaggio scegliere ^13-17. CRISPR/Cas9 promette ancor meno generazione ad alta intensità di manodopera di nucleasi di design, tuttavia la specificità della guida RNA-DNA-binding non è ancora completamente risolto ^18,19. Generazione di ZFNs misura è stata finora limitata a laboratori accademici specializzati e fornitori commerciali come Sangamo Biosciences e il servizio Sigma CompoZr.

In generale, genome editing con nucleasi design mira a introdurre doppie rotture del filamento (DSB) a loci genomici definito, che poi attirano fine nonhomologous giunzione (NHEJ) o ricombinazione omologa (HR) di riparazione del DNA macchinari ^10,12. Riparazione NHEJ-mediata di un DSB provoca spesso l'introduzione di inserzioni e delezioni in prossimità del sito di riparazione. Così NHEJ riparazione cun essere sfruttati per buttare giù la funzione di un gene bersaglio introducendo una mutazione frame-shift ai geni codificanti proteine ​​sequenza ^4,7,9. In alternativa, aggiunta o sostituzione di informazioni genetiche definite possono essere raggiunti realizzando un donatore DNA insieme alle nucleasi progettista. Un donatore di DNA comprende ricercatore-progettato sequenze di DNA fiancheggiati da regioni di omologia con il locus bersaglio, quindi servire come modello per la riparazione DSB da HR. Entrambi i plasmidi ^5,6,20 e singolo filamento oligonucleotidi ^8,9,21 sono stati utilizzati con successo come donatori. Né-NHEJ né HR-mediata editing genoma richiedono l'introduzione di un marcatore selezionabile nel genoma dell'embrione mouse, che rende queste strategie particolarmente adatto per la creazione di piccole alterazioni nella sequenza nucleotidica senza disturbare l'architettura genetica complessiva.

In questo protocollo si descrivono tutte le procedure essenziali per l'editing genoma nellaembrione di topo usando Talens. Questi includono 1) individuazione di un sito di destinazione TALEN ^22, 2) la costruzione di Talens dal Golden Gate clonazione ^13, 3) la sintesi in vitro di TALEN mRNA, 4) la microiniezione di mRNA TALEN in ovociti di topo fecondati, 5) le procedure chirurgiche per il trasferimento di embrioni e 6) analisi di mutagenesi TALEN indotta in animali fondatori. Ci concentriamo su TALEN mRNA microiniezione e lo screening dei fondatori per NHEJ-indotte inserzioni / delezioni. A questo scopo abbiamo generato bifunzionali costrutti Talen che permettono sia l'espressione in cellule di mammifero, quando trasfettate come plasmidi e nella sintesi in vitro di TALEN mRNA per microiniezione in embrioni di topo. Questi costrutti comprendono una spina dorsale RACCONTO troncato ²³ fusi per eterodimerica FokI domini ^24,25 per ottimizzare la modifica del genoma nelle cellule di mammifero. Questo protocollo può anche essere adottata per microiniezione di altre nucleasi di design o per le iniezioni combinate di nucleasi di designe costrutti donatori (disegno di donatori di DNA è stata descritta in eccellenti pubblicazioni tecniche Wefers et al. ^26,27).

Dichiarazione etica

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti del veterinario cantonale del Canton Zurigo.

Protocollo

1. Identificazione dei Talen siti bersaglio

1. Visitare il sito Web 2.0 TAL Effettuatore Nucleotide targeter (http://tale-nt.cac.cornell.edu) e scegliere "TALEN targeter".
2. Inserire la sequenza del gene bersaglio. Se l'espressione pCAG-T7-TALEN costruisce viene utilizzato (Figura 1C) scegliere "Miller et al., 2011" sotto "Usa un architettura Preset" al fine di prevedere siti di destinazione che possono essere avviati con la lunghezza ottimale distanziale (15-20 bp) e il numero di RVDS Tale (15-20) per questa architettura TALEN.
3. Scegliere "NN" sotto "G Substitute" (NH RVDS specifico per guanosina sono inoltre disponibili ma non ancora ampiamente testati per il montaggio TALEN).
4. Facoltativo: per altre impostazioni e opzioni seguire le istruzioni sul sito e link forniti qui.
5. Un file di testo con i potenziali siti bersaglio viene generato, che può essereimportato in un foglio di calcolo per l'osservazione più conveniente. Selezionare la coppia TALEN (s) per Golden Gate montaggio.
6. Facoltativo: Sequenza della regione genomica di interesse nel ceppo di topi che verrà utilizzato per la microiniezione per rilevare eventuali polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) che potrebbero non essere contabilizzati in banche dati pubbliche e potrebbe potenzialmente impedire nucleasi vincolante.
7. Opzionale: Fare riferimento alla Tabella 3 per design aggiuntive nucleasi-relative risorse online.
8. La maggior parte dei plasmidi necessari per ZFN e TALEN costruzione possono essere ottenuti da Addgene:
   http://www.addgene.org/special-collections/
   Addgene ID per il kit Golden Gate TALEN e mammiferi costrutti di espressione Talen sono riportati nella Tabella 2.
   In alternativa, moduli particolari funzionali come i domini zinc finger possono essere ordinati da un fornitore di servizi di sintesi del gene.

2. Golden Gate TALEN Assembly

Questa sezione descrive l'assemblaggio di Talens utilizzando un protocollo pubblicato da Cermak et al. Talens ¹³ lunghi sono costruiti utilizzando due successive fasi di clonazione Golden Gate (Figura 1). Questo approccio consente l'incorporazione di un numero qualsiasi di RVDS tra 12 e 31 nei costrutti di espressione finale. Il protocollo assemblea è stato adattato a vettori di destinazione progettato per la generazione di mRNA (Figura 1C) che esprimono Talens altamente attivi seguenti ovocita microiniezione. Si prega di fare riferimento anche al protocollo on line del kit Golden Gate TALEN per stabilire e mantenere la biblioteca plasmide ( http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/ ).

1. Giorno 1 - Golden Gate Reaction # 1 - Assemblea dei RVD Array in pFUS Vettori
   1. Opzionale: Per ogni coppia TALEN progettato nel Protocol 1, immettere la sequenza del DNA dei due siti bersaglio (compresi iniziale T, 5 'a 3') nel foglio TALEN_Voytas_Pipetting per generare uno schema di pipettamento per ciascuna reazione Golden Gate (inserire anche concentrazioni di tutti plasmidi utilizzati per gli assembly ). Il foglio di calcolo fornisce anche la sequenza di DNA atteso di tutti RVDS che possono essere utilizzati per l'allineamento dei risultati sequenziamento al punto 2.5.2.
   2. Per ogni unica TALEN progettato nel protocollo 1:
      Se la lunghezza TALEN è 12-21 (standard), selezionare Ripetizione variabile di-residui (RVDS) 1-10 e la destinazione vettore pFUS_A. Selezionare restanti RVDS e una destinazione vettore pFUS_B, ad esempio per un TALEN con 15 RVDS (tra cui l'ultima ripetizione, che verrà aggiunta al montaggio finale al punto 2.3.3, selezionare RVDS 11-14 e pFUS_B4 destinazione vettore (Figura 1A).
      Se la lunghezza TALEN è 22-31, uso RVDS 1-10 e destinazione vector pFUS_A30A. Scegli RVDS 11-20 e la destinazione vettore pFUS_A30B. Selezionare restanti RVDS e un vettore pFUS_Bdestination, ad esempio per TALEN con 24 RVDS raccogliere RVDS 21-23 e la destinazione vettore pFUS_B3.
   3. Impostare Golden Gate reazione # 1 per ogni pFUS + combinazione RVD separatamente, vale a dire 1-10 + pFUS_A e restanti RVDS + rispettivo vettore pFUS_B o per TALEN più di 21 RVDS, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B e le restanti RVDS + rispettivo vettore pFUS_B. Utilizzare 150 ng di ciascun vettore RVD, 150 ng di pFUS vettore, 1 ml BsaI, 1 ml T4 DNA ligasi, 2 microlitri di buffer 10x T4 DNA ligasi, e H ₂ O a 20 microlitri di volume totale di reazione. (Utilizzo di aliquote freschi di T4 ligasi tampone per ogni turno di assembly Golden Gate è raccomandato in quanto ripetuto scongelamento / congelamento del tampone di ligasi T4 può ridurre l'efficienza delle reazioni.)
   4. Posizionare le reazioni Golden Gate in un cycler termico.
      Programma:
      37 ° C 5 min
      16 ° C 10 min
      10 cicli
      50 ° C 5 min
      80 ° C 5 min
   5. Aggiungere 1 ml ATP 10 mM e 1 ml Plasmid-Safe nucleasi per ciascuna miscela e incubare a 37 ° C per 1 ora. Questo trattamento rimuove prodotti di ligazione incompleti lineari che possono essere clonati in vettori di destinazione in vivo ricombinazione omologa in batteri trasformati.
   6. Trasforma E. coli con reazioni individuali ligazione (elettrocompetenti o chimicamente competente E. coli che facilitano α-complementazione come XL1-Blue o DH5a può essere usato qui e nelle trasformazioni successive).
   7. Batteri piastra su spectinomicina (50 mg / ml) piastre con X-Gal e IPTG (40 mcg / ml) per il blu / selezione colonia bianca.
2. Giorno 2 - Conferma del corretto montaggio pFUS-RVDS
   1. Utilizzando colonia PCR con primer pCR8_F1 e pCR8_R1 (Vedi Tabella 1 per sequenze primer) schermo 1-3 whitecolonie di ogni piatto. Correggere pFUS-RVDS assemblaggi in genere mostrano una banda corrispondente alla lunghezza combinata di tutti RVDS clonati (ad esempio circa 1,1 kb per 10 RVDS) e una "scala" dei piccoli gruppi meno prominenti (Figura 1B).
      Programma PCR:
      95 ° C 3 min
      95 ° C 30 sec
      55 ° C 30 sec
      72 ° C 1 min 45 sec
      30-35 cicli
      72 ° C 10 min
   2. Utilizzare confermato cloni per iniziare cultura durante la notte (2-5 ml LB con 50 mg / ml spectinomicina).
3. Giorno 3 - Golden Gate Reazione # 2 - Array RVD in Talen vettori di espressione
   1. Eseguire "minipreps" per isolare i gruppi pFUS-RVD (a seconda del numero di RVDS sia pFUS_A e pFUS_B o pFUS_A30A, pFUS_A30B e pFUS_B).
   2. Optional: Sequenza singoli vettori pFUS utilizzando primer pCR8_F1, pCR8_R1 (vedi Tabella 1 per le sequenze di primer). Sequencing può anche essere effettuata sul finale TALEN costruisce (sezione 2.5.2); tuttavia, per più Talens completa legge di tutti RVDS potrebbe non essere possibile utilizzando il sequenziamento Sanger.
   3. Impostare Golden Gate reazione # 2 per ogni singolo TALEN. 150 ng di ciascun vettore pFUS, 150 ng di PLR-HD, PLR-NG, PLR-NI, PLR-NN (ultimo "mezzo-repeat"), secondo il disegno della sequenza RVD e per l eft TALEN utilizzare 75 ng di pCAG-T7-TALEN-ELD-destinazione e per il diritto TALEN utilizzare 75 ng pCAG-T7-TALEN-KKR-destinazione (o viceversa). Aggiungere 1 ml Esp3I, 1 ml T4 DNA ligasi, 2 microlitri di buffer 10x T4 DNA ligasi, H ₂ O a 20 microlitri volume totale di reazione.
   4. Posizionare le reazioni Golden Gate in un cycler termico.
      Programma:
      37 ° C 5 min
      16 ° C 10 min
      10 cicli
      37 ° C 15 min
      80 ° C 5 min
   5. Utilizzare reazioni sezione 2.3.4 per trasformare E. coli.
4. Giorno 4 - Conferma del corretto montaggio TALEN
   1. Schermo 1-3 colonie bianche da ogni piastra da colonia PCR con primer TAL_F1 e TAL_R2 (cfr. tabella 1 per le sequenze di primer). Talens correttamente assemblati mostrano un prodotto di PCR con una lunghezza corrispondente al numero totale di RVDS Incorporated (Figura 1D, questa banda è talvolta difficile da rilevare, mentre l'effetto "scaletta" rappresenta un indicatore robusto di montaggio successo).
      Programma PCR:
      95 ° C 3 min
      95 ° C 30 sec
      55 ° C 30 sec
      72 ° C 3 min
      30-35 cicli
      72 ° C 10 min
   2. Usa confermato cloni corretti per avviare colture batteriche durante la notte (2-5 ml LB con 100 mg / ml ampicillina).
5. Giorno 5 - Conferma del corretto montaggio TALEN
   1. Eseguire "minipreps" per isolare i plasmidi pCAG-T7-ta.
   2. Se sequenziamento non è stata eseguita in séction 2.3.2, utilizzare primer TAL_Seq_5-1 e TAL_R2 (vedi Tabella 1 per le sequenze dei primer) per determinare il montaggio RVD corretto in full-length TALEN.

3. Nuclease mRNA sintesi

1. Generazione di modello di DNA
   1. Preparare midi o maxipreps di plasmidi pCAG-T7-ta per la sintesi di mRNA di alta qualità.
   2. Linearizzare 10 pg del TALEN o ZFN mRNA sintesi plasmide con un enzima di restrizione che preferenzialmente fende valle e in prossimità del codone di STOP nucleasi (per vettori pCAG-T7-ta utilizzano SacI). plasmidi sintesi di mRNA tipicamente includono un promotore T7 o SP6 fago monte della sequenza codificante nucleasi.
   3. Eseguire 200-500 ng di plasmide digerito su un gel di agarosio 0,7-1% per verificare la completa digestione.
   4. Rimuovere sali dal plasmide digerire facendo precipitare il DNA con acetato di sodio 0,1 volumi e 3 volumi di etanolo per 1 ora a camera temperature. Sedimentare il DNA mediante centrifugazione a 14.000 xg per 10 o più minuti, lavare il pellet con 200 ml di etanolo 70%, centrifugare per altri 5 minuti, rimuovere l'etanolo, asciugare il pellet e risospendere in un volume adeguato di acqua priva di RNasi. La purificazione del plasmide linearizzato è possibile anche utilizzando un sistema basato su colonne, ad esempio QIAquick PCR Purification Kit.
   5. Determinare la concentrazione del modello lineare e utilizzando 1 mg per impostare trascrizione in vitro.
2. mRNA Sintesi e poliadenilazione
   1. Per la trascrizione in vitro di pCAG-T7-TALEN plasmidi usa il mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit. Impostare la reazione di trascrizione per ogni TALEN sul ghiaccio: a 20 ml con acqua priva di nucleasi, 10 microlitri T7 2x NTP / ARCA, 2 ml 10x T7 Reaction Buffer, 1 mg di DNA stampo, 2 microlitri T7 mix di enzimi. Mescolare la reazione e incubare per 1-2 ore a 37 ° C.
   2. Utilizzare la completa trascrizione 20 microlitrizione miscela di reazione per impostare la reazione di poliadenilazione su ghiaccio: 36 ml di acqua priva di nucleasi, 20 microlitri di buffer 5x EPAP, 10 microlitri 25 MnCl2 mM, ATP 10 microlitri 10 mm. Mescolare e togliere 2,5 microlitri della miscela di reazione come campioni di controllo L1 ed R1 (per nucleasi sinistra e destra, rispettivamente). Aggiungere 4 ml di E-PAP enzima e incubare la reazione per 45-60 minuti a 37 ° C. Rimuovere altri 2,5 ml di miscela di reazione come campioni di controllo L2 e R2.
3. mRNA Purificazione
   1. Utilizzare NucAway Colonne Spin per la purificazione di mRNA (scambio di buffer e la rimozione di nucleotidi prive di personalità giuridica). Toccare le colonne di stabilirsi gel secco in fondo della colonna. Colonna Idratare con 650 ml di buffer di RNase-free microiniezione (1 mM Tris-Cl, 0.1 EDTA, pH 7.5). Cap, vortice, toccare le bolle d'aria, e idratare per 5-15 minuti a temperatura ambiente.
   2. Posizionare la colonna in un tubo di raccolta e centrifugaa 750 xg, a 4 ° C per 2 minuti per rimuovere fluido interstiziale in eccesso. Eliminare colonna in tubo di raccolta e posto in una provetta 1,5 ml di eluizione.
   3. Applicare la miscela di reazione completo dal punto 3.2.2 alla colonna e centrifugare a 750 xg, 4 ° C per 2 min. Nucleasi mRNA verrà ora disciolto in tampone microiniezione. Rimuovere 2,5 ml di campioni purificati L3 e R3.
   4. Conservare mRNA a -80 ° C fino aliquote microiniezione sono preparati.
4. mRNA elettroforesi su gel
   1. Pulire una camera di gel per rimuovere le contaminazioni RNasi con la soluzione di SDS 10% o RNaseZAP.
   2. Preparare un gel di agarosio 1% in 1xTBE tampone di corsa.
   3. Mescolare ogni L1/R1 campione di RNA, L2/R2, L3/R3 con 3 volumi di NorthernMax formaldeide Load Dye e incubare per 15 minuti a 65 ° C.
   4. Caricare i campioni e una scala di dimensioni RNA (formato marcatore es RNA Millennium) sul geled eseguire gel a 10 V / cm in TBE 1x fino loading dye raggiunge la fine del gel.
   5. Macchiare il gel usando soluzione verde SYBR (Invitrogen) per 30-60 minuti con agitazione a temperatura ambiente.
   6. Immagine il gel e confrontare le dimensioni di L1/R1 con L2/R2 e L3/R3. I campioni L2/R2 e L3/R3 dovrebbero mostrare nastri di dimensione maggiore rispetto al L1/R1 indicando poliadenilazione successo (Figura 2).
   7. Determinare la concentrazione di mRNA utilizzando uno spettrofotometro.
   8. Preparare aliquote mRNA per microiniezioni mescolando nuclease sinistra e mRNA nucleasi destra in un rapporto di 1:1. Si consiglia di preparare aliquote con una concentrazione totale di 200 ng / mL (100 ng / ml di ogni nucleasi) diluendo con tampone microiniezione. Conservare mRNA aliquote a -80 ° C.

4. Isolamento dell'embrione e microiniezione

1. Isolamento embrione. Questo protocollo è stato utilizzato con successo con C57BL/6J e la tensione BDF1s e può probabilmente essere adattato ad altri ceppi comunemente usati in esperimenti di microiniezione come FVB o CBF1. I topi sono alloggiati sotto una ciclo luce-buio 12 hr-12 ore in un impianto temperatura e umidità controllata con cibo e acqua ad libitum.
   1. Donatrici Superovulate per aumentare il rendimento degli embrioni. 16 femmine (4 settimane) sono superovulate da intraperitoneale (ip) iniezione di gonadotropina siero del 5 IU cavalla gravida (PMSG), seguito da iniezione ip su 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG), 48 ore più tardi.
   2. Mate i 16 femmine superovulate a 16 anni di allevamento (2-8 mesi) maschi subito dopo l'iniezione di hCG.
   3. Sacrifica le femmine utilizzando un protocollo eutanasia riconosciuto come CO ₂ inalazione.
   4. Recuperare gli ovociti fecondati. Ovociti vengono raccolti da ovidotti la mattina successiva e poi liberati da tutte le cellule del cumulo rimanenti da un trattamento di 3-5 min a 0,1% ialuronidasi bovina disciolto in M2 medio. A seconda della capacità di accoppiamento e il ceppo utilizzato il rendimento embrione può variare. 16 femmine C57BL/6J solito producono 150-250, mentre BDF1 cede 300-400 ovociti fecondati, rispettivamente.
2. Embrione microiniezione
   1. Iniettare il nucleasi mRNA. Ovociti stadio pronucleari sono tipicamente iniettati nel primo pomeriggio. Citoplasmatica mRNA microiniezione viene effettuata in M2 liquido sotto olio minerale usando un microscopio invertito dotato Nomarski DIC usando obiettivo 20X e con micromanipolatori embrioni nonché un gruppo di iniezione. Si consiglia di iniziare le iniezioni di TALEN mRNA ad una concentrazione di 10 ng / ml (20 ng / ml in totale).
   2. Aspirare il ovocita con un capillare detenzione e iniettare il mRNA nucleasi nel citoplasma dell'embrione evitando il contatto con il pronuclei. L'iniezione deve essere superficiale, vicino alla membrana plasmatica. Il volume di iniezione deve essere mantenuto basso e l'ago microiniezione dovrebbe essere withdrawn al primo segno di distensione citoplasmatica. Una serie microiniezione formata di norma da 100-300 ovociti. Tipicamente, almeno il 80-90% degli embrioni dovrebbe sopravvivere l'iniezione senza lisi immediato.
   3. A seguito di microiniezione, posizionare gli embrioni per 1 ora a M16 (Sigma) medium a 37 ° C e 5% di CO ₂ e trasferire gli embrioni sopravvissuti in pseudopregnant madri adottive.

5. Surgical Embryo Transfer

1. Preparare i destinatari embrione pseudopregnant (madri affidatarie) un giorno prima mRNA microiniezione. Femmine mature (3-6 mesi) di un ceppo outbred robusto, come CD-1, è adatto per il ruolo. Indurre pseudogravidanza con l'accoppiamento le femmine in un giorno precedente con i maschi chirurgicamente o geneticamente vasectomized ^28. Solo 0,5 femmine DPC con una spina copula chiaro sono utilizzati come embrioni destinatari. Nelle femmine non utilizzate la pseudogravidanza scompare dopo circa 3 weeks permettono il loro uso ripetuto.
2. Anestetizzare il 0,5 DPC affidatari femmine madre mediante iniezione ip di ketamina, xylazina (120 mg / kg e 16 mg / kg, rispettivamente). Questa formulazione garantisce ~ 30 min tempo di tolleranza chirurgica è più che sufficiente per il tempo di funzionamento previsto di 5-10 min.
3. Posizionare l'animale anestetizzato sull'addome su una superficie calda e disinfettare la zona di incisione con un disinfettante adeguato, come il 70% di etanolo e clorexidina o miscela alcol.
4. Incidere la pelle sul dorso dell'animale e aprire la cavità peritoneale con forbici sterili.
5. Visualizzare e esternare il corno uterino tirando il cuscinetto adiposo attaccato al ovaio. Tenere gli organi umido con soluzione calda 0,9% NaCl. Tenete a mente che il sito chirurgico può essere drappeggiato con garza sterile o rasato al fine di conformarsi alle linee guida veterinari locali.
6. Immobilizzare gli organi riproduttivi dal ritaglio del cuscinetto adiposo ovario con una fascetta bulldog.
7. Afferrare nell'ovidotto appena a monte del ampolla con una pinza Orologiai e usare un ago ipodermico di 30 G per creare un piccolo buco nel muro ovidotto.
8. Ritirare l'ago e reinserire un capillare di vetro sottile che contiene gli embrioni nel foro che permette il posizionamento degli embrioni nella ampolla soffiando delicatamente nel boccaglio del supporto capillare. Aspirare il capillare volta gli embrioni vengono depositati nel ampolla e sostituire gli organi riproduttivi indietro nella cavità del corpo.
9. Chiudere la cavità peritoneale con una serie di suture sterili (Prolene 6-0).
10. Chiudere la pelle con 1-2 clip ferita (Autoclip 9 mm) a seconda delle dimensioni dell'apertura.
11. A seguito dell'operazione tornare gli animali per la loro gabbia casa e supervisionare loro fino a quando l'effetto dell'anestesia svanire.
12. Al fine di minimizzare lo stress, ospitare i topi in gruppi sociali stabili (2-4 animali / tipo III gabbia), quando possibile.
13. Applicare analgesico post-operatorios in forma di Dafalgan aggiunti all'acqua potabile (paracetamolo 200 mg / kg di peso corporeo) per 3 giorni dopo l'intervento.

6. Analisi dei Fondatori mediante PCR e T7 Endonuclease o enzimi di restrizione

1. Primer design per amplificare una regione tra 200-700 bp intorno al sito di legame nucleasi. Le distanze avanti regione spacer primer nucleasi e nucleasi spacer regione-reverse primer dovrà essere sufficientemente differente per permettere il rilevamento di due bande separate per Prodotti digeriti su un gel di agarosio (vedi figure 3 e 4 per gli esempi).
2. Eseguire PCR con condizioni ottimizzate. Controllare dimensione amplicone PCR su un gel di agarosio.
3. Optional: prodotti Purify PCR, ad esempio con QIAquick PCR Purification Kit per rimuovere i sali e nucleotidi dal mix PCR. Molti enzimi di restrizione sono attivi in ​​campioni PCR integrate con il buffer di enzima di restrizione e purificazione del caso non è necessaria. Abbiamo anche successfuusato lly endonucleasi T7 in tampone QiagenTaq PCR completata con NEBuffer 2.
4. 1. T7 endonuclease dosaggio. Mescolare 17 ml di prodotto di PCR con 2 ml di NEBuffer 2 ed eseguire la formazione eteroduplici (Figura 3b) programma in un termociclatore:
      95 ° C 2 min
      95 ° C a 85 ° C (-2 ° C / sec)
      85 ° C a 25 ° C (-0,1 ° C / sec)
      4 ° C attesa.
      Aggiungere 1 ml di T7 endonucleasi a ciascun campione e incubare a 37 ° C per 20 min. (Il saggio geometra (Transgenomic), che si basa su CEL 1 nucleasi, può essere utilizzato anche qui. Prega di fare riferimento alle istruzioni del produttore.)
   2. Limitazione digest del prodotto della PCR. Mescolare 17 ml di prodotto di PCR con 2 ml di tampone 10x di restrizione enzimatica e 1 ml di enzima di restrizione. Digerire a temperatura appropriata per 1 ora o più.
5. Aggiungere DNA loading dye per campioni e correre su un gel di agarosio al 2% per rilevare digestione distintamodelli per animali wild-type e fondatori portano alleli mutati. Vedere le figure 3 e 4 per i risultati attesi.
6. Clone prodotti di PCR dei fondatori positivi per gli alleli mutati di sequenziamento Sanger (ad esempio mediante TA-clonazione in pGEM-T Easyor sequenza direttamente da miscele di prodotti PCR utilizzando sequenziamento di prossima generazione.

Risultati

Abbiamo costruito plasmidi destinazione compatibili con l'assieme dorato GateTALEN pubblicato da Cermak et al. ¹³ che permettono l'espressione di Talens in cellule di mammifero e in vitro sintesi di mRNA dal promotore T7 fago (Figura 1C). Questi plasmidi carry domains Foki eterodimeriche (mutazioni eld o KKR) oggi dimostrati ridurre gli effetti fuori bersaglio relativamente per omodimeri Foki ea potenziare l'attività scissione rispetto alla prima generazione FokI eterodimeri ^25,29. Le reazioni di montaggio Golden gate # 1 e # 2 sono di solito molto efficiente e ogni colonia bianca, quando analizzato da colonia PCR, mostra il modello previsto per il particolare numero di RVDS clonati (Figure 1B e 1D).

Gel di analisi in vitro sintetizzato mRNA (Figura 2) dovrebbe rivelare una singola banda distinguibile con poca o nessuna sbavatura per ogni campione analizzato. Ci dovrebbe essere un cambiamento chiara dimensione tra i campioni L1/R1 e L2/R2, L3/R3, che indica poliadenilazione successo.

Animali fondatori possono essere sottoposti a screening per alleli mutati NHEJ indotte mediante genotipizzazione PCR seguito da digestione T7 endonucleasi (figura 3) o una digestione di restrizione usando un enzima che scinde la sequenza wild type all'interno della regione distanziatore della coppia nucleasi (Figura 4). Il saggio T7 endonucleasi è applicabile a qualsiasi tipo di mutazione indipendentemente dalla sequenza genomica specifica all'interno della regione distanziatore della coppia nucleasi iniettato; tuttavia, si rileva solo i disallineamenti tra i filamenti di DNA in prodotti di PCR eteroduplici. Così, nel raro caso in cui uno dei fondatori porta due alleli mutati in modo identico, i prodotti di PCR potrebbero non mostrare alcun modello T7 digestione. Questa distinzione è tuttavia sempre possibile quando un sito di restrizione specifico si trova all'interno della regione spacer nucleasi che verrà eliminato NHEJIndotta inserzioni / delezioni (Figura 5). Qui, le bande non digerito indicano la presenza di mutazioni, e l'assenza di qualsiasi prodotto digeriti suggerisce fortemente fondatore trasportano mutazioni in entrambi gli alleli del gene targeting (contrassegnati con l'asterisco sono obbligatori in Figura 4b).

Figura 1. Golden Gate clonazione di Talen RVDS in eterodimeriche vettori pCAG-T7-Destination. A) Assemblea dei RVD matrici in vettori pFUS. Ecco un esempio viene mostrato per una coppia di TALEN con singoli array TALE composto da 15 RVDS e 17 RVDS, rispettivamente (per array TALE più di 21 RVDS, tre assemblee pFUS-RVDS sono necessari, non mostrato). Le frecce indicano primer per b) i prodotti pFUS specifico reazioni colonia PCR PCR.amplificato dalle assemblee pFUS corrette in genere mostrano una banda corrispondente alla durata totale di tutte RVDS clonati (ad esempio circa 1,1 kb per 10 RVDS) e C "scala" dei piccoli gruppi meno importanti a causa della natura ripetitiva di array RVD.) assemblaggio finale di array pFUS-RVD e un plasmide contenente l'ultima ripetizione (PLR) in eterodimeriche vettori di espressione Talen con FokIELD e FokIKKR varianti, rispettivamente. La spina dorsale TALEN (annotato come N e C) ricorda l'architettura pubblicato da Miller et al. ²³ Il CAG (CMV elemento presto enhancer / pollo beta-actina) promotore assicura alti livelli di espressione in cellule di mammifero trasfettate, mentre il promotore T7 fago permette in sintesi vitro mRNA (utilizzare SacI per la linearizzazione del vettore a valle del codone di stop nucleasi). D) Colony PCR utilizzando primer indicati dalle frecce C) permette di identificare correttamente montato Talens. Full-lungezzah prodotti di PCR sono spesso meno evidenti, mentre l '"effetto scala" rappresenta un indicatore affidabile di montaggio successo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2. . Controllo di qualità dei nuclease mRNA in sintesi vitro mediante elettroforesi su gel di agarosio mRNA ZFN sono mostrati come esempio (L, sinistra ZFN, R, destra ZFN). I campioni L1/R1 mostrano mRNA prima di poliadenilazione, i campioni L2/R2 spettacolo poliadenilato mRNA e L3/R3 mostra purificato mRNA poliadenilato. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

alt = "Figura 3" fo: content-width = "6in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg" width = "600" />
Figura 3. Esempio di endonucleasi saggio T7 utilizzato per l'identificazione di animali fondatori portatori di mutazioni nucleasi indotta del locus bersaglio. A) Una coppia TALEN è stato progettato per fendere all'interno della regione codificante del mouse gene della proteina prionica (PRNP, sequenza bersaglio TALEN può essere fornito su richiesta). Un prodotto di PCR viene generato utilizzando un primer forward (F) situato 110 bp a monte e un primer reverse (R) 250 bp a valle del sito di clivaggio TALEN. B) Il prodotto di PCR viene successivamente sottoposto a heteroduplex formazione e T7 digestione con endonucleasi. C) TALEN mutagenesi indotta all'interno della regione genomica mirata di singoli fondatori è rivelato dalla presenza di un full-length prodotto PCR con prodotti di digestione di 250 e 110 bps.50930/50930fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 4. Esempio di una restrizione digest di prodotti di PCR utilizzati per l'identificazione degli animali fondatori portatori di mutazioni nucleasi-indotte del luogo di destinazione. ZFN specifici per il mouse Rosa26 locus ²⁹ bersaglio di un sito di restrizione XbaI all'interno introni 1. A) Fondatori sono stati proiettati per la genotipizzazione PCR utilizzando un primer forward (F) situato a 500 bp a monte e un primer reverse (R) 250 bp a valle del sito di taglio. B) Digestione dei prodotti di PCR con XbaI svela i modelli di digestione che indicano topi con mutazioni bi-alleliche (contrassegnati con asterisco), mono alleliche mutazioni (bande digerito e digerito, ad esempio animali 2)e topi WT (digestione completa, ad esempio animali 21). C) sequenziamento di topi con potenziali modifiche bi-allelica mostra fino a 3 (24 animali) distinti inserzioni / delezioni. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Nome del Primer	Sequenza 5 'a 3'
pCR8_F1	ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1	cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1	ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2	ggcgacgaggtggtcgttgg
TAL_Seq_5-1	catcgcgcaatgcactgac

Tabella 1. Sequenze di primer utilizzati per la PCR e sequenziamento delle colonie all'interno del gruppo di Golden Gate TALENprotocollo.

Plasmide / Collezione	Collaboratore	Addgene ID	Commenti
Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit 2.0	Voytas lab	1000000024	Contiene tutti i plasmidi necessari per l'assemblaggio Golden Gate TALEN
vettori di destinazione pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD	Pelczar lab	40131, 40132	Add-on plasmidi per l'espressione TALEN in cellule di mammifero e in vitro sintesi di mRNA

Tabella 2. Plasmidi e collezioni plasmidi necessari per il montaggio Golden Gate TALEN possono essere ottenuti da Addgene ( www.addgene.org ).

OnlineRisorsa	Commenti
http://tale-nt.cac.cornell.edu	Progettazione di TALEN; TALEN previsione off-target
http://zifit.partners.org/ZiFiT/	Progettazione di TALEN, APERTO ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9
http://www.genome-engineering.org	Progettazione di TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 previsione off-target
http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html	Assemblea dei TALEN sequenze per la conferma dei risultati di sequenziamento
http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html	Progettazione di assemblaggio modulare ZFN
www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware	Progettazione di assemblaggio modulare ZFN

Tabella 3. Risorse online per la progettazione ZFN, TALEN, e CRISPR/Cas9.

Discussione

Genoma approcci editing nucleasi-driven Designer hanno notevolmente ampliato la gamma di specie suscettibili di modifiche mirate dei rispettivi genomi ^10,12. Nei topi,-gene targeting nelle cellule ES è una tecnica standard per oltre due decenni; tuttavia, si è rivelato difficile per adattarsi alle cellule staminali provenienti da specie diverse del mouse, anche se c'è stata qualche recente successo in cellule ES ratto. Anche con la disponibilità di "off-the-shelf" cloni di cellule ES topo gene targeting fornite da consorzi come EUCOMM, KOMP, o NorCOMM ³ modifica del genoma da ZFN e TALEN fornisce una maggiore precisione e flessibilità per quanto riguarda la gamma di modifiche che possono essere introdotto nel genoma del mouse. Fondatore animali portatori di mutazioni nucleasi-mediata sembrano essere altamente linea germinale competente ^4-6,20,21, che non è sempre il caso di chimere provenienti da blastocisti iniezioni di cellule staminali. Pertanto, in alcuni casi microiniezione di desnucleasi igner possono provocare generazione significativamente più veloce delle linee di nuovi mouse con modificazioni del genoma mirati.

Il successo generazione di topi knockout per iniezione di ZFN e TALEN dipende in larga misura l'attività della coppia nucleasi iniettato. Talens hanno dimostrato di avere un alto tasso di successo in mira una vasta gamma di geni in un numero di organismi; Tuttavia, studi recenti suggeriscono che TALEN legame è sensibile alla citosina metilazione ^30,31. Così, coppie nucleasi appena generati, per esempio Talens clonati in vettori pCAG-T7, possono essere trasfettate transitoriamente in una linea cellulare di topo come NIH-3T3 o Neuro -2a, che imitano lo stato della cromatina embrione di topo in una certa misura. Qui, nucleasica può essere stimata utilizzando la T7 endonucleasi test o una restrizione digest del prodotto di PCR come descritto nel capitolo 5 prima sintesi di mRNA e microiniezione. Si consiglia di sequenziamento della regione genomica di interesse nel rispettoive linea cellulare e il ceppo del mouse utilizzato per esperimenti di microiniezione.

In zigoti del mouse, diverse coppie Talen o ZFN lavoreranno in maniera ottimale a diverse concentrazioni di mRNA e quindi la concentrazione di lavoro ottimale della microiniezione nucleasi mRNA possono essere determinati sperimentalmente. A seconda della coppia di nucleasi, una concentrazione troppo bassa comporterà alcuna scissione, mentre troppo alta può causare letalità embrionale. A seconda della coppia nucleasi, abbiamo avuto successo usando concentrazioni di mRNA totale compresi fra 2 ng / ml e alto come 200 mcg / ul. Questi effetti sono difficili da prevedere da esperimenti in coltura cellulare e la concentrazione ottimale nucleasi sia per la sopravvivenza degli embrioni e la velocità di modifica del locus bersaglio deve essere determinato empiricamente.

Altamente attivo ZFN o TALEN possono fendere la loro sequenza bersaglio oltre la fase unicellulare dell'embrione microiniezione e quindi causare complessi schemi di mutagenesi und mosaicismo in fondatori. Noi e altri ⁴ abbiamo osservato tre o più alleli mutati distinte in un unico fondatore (Figura 5C). Così, quando si stabilisce una nuova linea di topi da questi fondatori, prole devono essere attentamente monitorati mediante sequenziamento per la presenza della mutazione favorevole da saggi di digestione forniscono la prova che solo una mutazione indefinito è presente.

Una delle critiche spesso hanno espresso contro i sistemi ZFN e Talen è la possibilità che questi nucleases sono anche in grado di scindere sequenze presenti altrove nel genoma che sono simili ai siti di destinazione. Tali effetti off-target sono stati osservati con i reagenti di prima generazione utilizzando il dominio omodimerica FokI e costrutti eterodimero stati progettati per alleviare gli effetti ²⁵ off-target. Potenziali siti off-bersaglio possono essere previsti in una certa misura in silico ^32,33 e screening mediante PCR e sequenziamento. Un evidente vantaggio of usando ZFNs e Talens per la generazione di topi piuttosto che linee cellulari è la possibilità di rimuovere off mutazioni di destinazione non collegate alla modificazione del genoma desiderato eseguendo diversi reincroci ad un ceppo selvatico di scelta. Per l'analisi di un gran numero di topi fondatori, prossima generazione sequenziamento dei prodotti di PCR generati dal locus nucleasi targeting e in silico previsti off-target loci potrebbe offrire una lettura qualitativa e quantitativa alternativa ai saggi di digestione dei prodotti di PCR.

Le tecniche di riproduzione assistita descritte in questo protocollo sono ottimizzati per i ceppi mouse standard utilizzati per esperimenti di microiniezione come C57BL/6J o B6D2F1. I topi di diversa origine, quali ceppi dell'esoincrocio, in linea di principio essere utilizzati per approcci modifica del genoma e potrebbero fornire un background genetico più adatto per domande di ricerca specifiche. Le prestazioni di tecniche di riproduzione assistita come la superovulazione può essere predicatoCTED per un numero di ceppi ^34-36 ma potrebbe richiedere ulteriore ottimizzazione per i ceppi non standard al fine di ottenere un numero sufficiente di embrioni per nucleasi microiniezione.

Oltre ZFN e TALEN, nuove nucleasi di design come il sistema CRISPR/Cas9 RNA-guidata ^9,37,38 ora sono stati introdotti per applicazioni di editing genoma. Tutti i metodi per la microiniezione e l'analisi di animali fondatori qui descritti sono applicabili a CRISPR/Cas9 e le modalità future di modifica del genoma anche.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BsaI	NEB	R0535S or L
Esp3I	Thermo Scientific	ER0451
T4 Ligase	NEB	M0202S or L
Spectinomycin	Sigma	S0692-1ML
Ampicillin	Sigma	A0166
X-Gal	Sigma	B4252
IPTG	Sigma	I6758
Plasmid-Safe nuclease	Epicentre	E3101K
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAGEN Plasmid Midi Kit	Qiagen	12143
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit	Invitrogen	AM1345
NucAway Spin Columns	Invitrogen	AM10070
RNaseZAP	Sigma	R2020-250ML
NorthernMax Formaldyde Load Dye	Invitrogen	AM8552
RNA Millennium Markers	Invitrogen	AM7150
10x TBE buffer	Thermo Scientific	B52
T7 endonuclease	NEB	M0302S or L
pGEM-T EasyVector System I	Promega	A3600
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S-7563
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG)	Sigma	G4877
human chorionic gonadotropin (hCG)	Sigma	CG5
M2 embryo culture medium	Sigma	M7167
M16 embryo culture medium	Sigma	M7292
Mineral oil, embryo tested	Sigma	M8410
Ketamine	CentraVet	Ket 201
Xylazine	Sigma Aldrich	46995
Equipment/Tools
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200)	Nikon
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF)	Narishige
Embryo holding capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10
Embryo injection capillaries	Narishige	GD-1
Capillary puller (for example Sutter P97)	Sutter Instruments
Microforge (for example Narishige MF-900)	Narishige
Walton skin scissors	FST	14077-10
Surgical scissors	FST	14041-10
Surgical probe	FST	10140-03
Reflex wound clip system (9 mm)	FST	12031-09
Reflex wound clips (9 mm)	FST	12032-09
Dumont fine forceps 5	FST	11254-20
Moria curved forceps	FST	11370-31
Moria fine forceps	FST	11399-80
Dietrich bulldog clamp	FST	18038-45
C57BL/6J mice	Jackson Labs	strain code 000664
CD-1 mice	Charles River	strain code 000664