디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

요약

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

초록

사이트 별 게놈 수정 (녹아웃, 노크에있는)를 운반하는 형질 전환 마우스는 복잡한 생물학적 시스템을 해부뿐만 아니라 인간의 질병을 모델링 및 치료 전략을 테스트하기 위해 매우 중요합니다. 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs) 및 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / 대한 CRISPR 관련 (CAS) 9 시스템 사이트로 디자이너 클레아의 사용에서 최근의 진보 특정 게놈 공학은 배아 줄기 (ES) 세포 기술에 의존 할 필요없이 거의 모든 실험 종 급속한 표적 유전자 변형을 수행 할 수있는 가능성을 연다. 게놈 편집 실험은 일반적으로 조사 정의 게놈 현장에 핵산 분해 효소의 활동을 직접 지정 DNA 결합 도메인의 구성에 따라 관심의 유전자 내에서 디자이너 클레아 대상 사이트의 식별로 시작합니다. 가방 클레아 플라스미드 체외에 </ EM> 수정 된 마우스 난자의 미세 주입에의 mRNA를 생성하는 전사. 여기, 우리는 수정 된 마우스의 난자에 TALEN mRNA를 직접 분사 대상이 게놈 수정을 달성하기위한 프로토콜을 제공합니다.

서문

마우스는 유전자 변형 동물 모델을 생성하기위한 지금까지 가장 인기있는 플랫폼이다. 마우스 배아 ^1-3의 유전 공학에 대한 다양한 도구 상자는 최근 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN)와 같은 디자이너 클레아 제에 따라 게놈 편집 방법에 의해 ^4-6, 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALEN)를 ^7,8 확장되었습니다 및 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 (CAS) 9 시스템 ^9. ZFN하고, 각각 FokI 효소 ^10-12에 결합된다 (각각 징크 핑거 단백질의 배열과 반복 변수를 디 - 잔기 (RVDS))이 맞춤 설계 단백질 기반의 DNA-결합 도메인 쌍으로서 TALEN 기능. 반대로, Cas9 매개 DNA 절단의 특이성은 (또한 하나의 키메라 RNA 분자라고 가이드 RNA에 결합 할 수 있습니다 crRNA 및 tracrRNA) CRISPR RNA를을 transactivating에서 제공하는 복잡 한 행동 ⁽¹¹⁾CRISPR 단백질.

RVDS의 정의 된 순서와 TALENs 빠르게 ^13-17 선택할 수있는 조립 전략 다수의 개별 실험자에 의해 구성 될 수있다. CRISPR/Cas9 그러나 가이드 RNA-DNA의 특이성은 아직 완전히 ^{18, 19가} 해결되지 바인딩, 디자이너 클레아의 더 적은 노동 집약적 인 발전을 약속합니다. 사용자 정의 ZFNs의 생성은 지금까지 전문 대학 실험실과 같은 Sangamo Biosciences에와 시그마 CompoZr 서비스로 상용 공급 업체로 제한하고있다.

일반적으로 디자이너 클레아와 편집 게놈 이후에 합류 동종 끝 (NHEJ) 또는 상동 재조합 (HR) DNA 수리 기계 ^{(10, 12)을} 유치 정의 게놈 유전자 좌에서, 이중 가닥 휴식 (DSB)를 소개하는 것을 목표로하고있다. DSB의 NHEJ - 중재 수리는 종종 수리의 사이트에 근접 삽입과 삭제의 도입 발생합니다. 따라서 NHEJ 수리 C는 유전자의 단백질 - 코딩 서열 ^4,7,9 내에 프레임 쉬프트 돌연변이를 도입함으로써 표적 유전자의 기능을 노크 위해 이용 될 수있다. 대안 적으로, 또는 추가로 정의 된 유전 정보의 보충은 가방 클레아 함께 DNA 공여체를 제공함으로써 달성 될 수있다. DNA 기증자 따라서 HR에 의해 DSB 복구를위한 템플릿으로 봉사 대상 궤적 상 동성 지역으로 측면에 조사 설계 DNA 서열을 포함한다. 플라스미드 ^5,6,20 및 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드 ^8,9,21 모두 성공적으로 기증자로 사용되었습니다. NHEJ-또는 이용 HR-매개 게놈 편집 둘다 전체적인 유전자 구조를 방해하지 않고, 염기 배열에서의 작은 변화를 생성하기위한 이러한 전략이 특히 적합하게 마우스 배아의 게놈에 선별 마커의 도입을 필요로한다.

이 프로토콜에서 우리의 게놈 편집을위한 모든 필수 절차에 대해 설명합니다TALENs를 사용하여 마우스 배아. 이들은 TALEN 대상 사이트 ^22의 1) 식별을 포함, 골든 게이트 복제 ^(13)에 의해 TALENs 2) 건설, TALEN의 mRNA, 수정 된 마우스 난자, 배아 전송을 위해 5) 수술 절차에 TALEN의 mRNA 4) 미세 주입 3) 체외 합성 , 6) 설립자 동물 TALEN 유발 돌연변이의 분석. 우리는 TALEN mRNA의 미세 주입 및 NHEJ에 의한 삽입 / 삭제에 설립자의 심사에 초점을 맞 춥니 다. 이 목적을 위해 우리는 플라스미드로 마우스 배아에 미세 주입을위한 TALEN의 mRNA의 생체 합성에 형질 때 포유 동물 세포 모두에서 발현을 허용 관능 TALEN 구조를 생성 한. 이러한 구조는 이종이 FokI 융합 잘린 이야기 백본 ^(23)는 포유 동물 세포에서 최적의 게놈 편집 ^{(24, 25)를} 도메인을 포함한다. 이 프로토콜은 다른 디자이너 클레아의 미세 주입 또는 디자이너 클레아의 결합 주사를 채택 할 수있다기증자 구조 (DNA 기증자의 디자인 Wefers 등. ^{(26, 27)에} 의해 우수한 기술 문서에 기술되어있다).

윤리 정책

모든 동물 실험은 광저우 취리히 주립 동물 병원의 지침과 규정에 따라 수행되었다.

프로토콜

1. TALEN 대상 사이트의 확인

1. TAL 이펙터 염기 Targeter 2.0 웹 사이트 (http://tale-nt.cac.cornell.edu)를 방문하여 "TALEN Targeter"를 선택합니다.
2. 표적 유전자의 순서를 입력합니다. pCAG-T7-TALEN 표현이 사용되는 생성하는 경우 (그림 1C)의 선택 "밀러 등., 2011"에 (최적의 스페이서의 길이가 대상이 될 수있는 대상 사이트를 예측하기 위해 "사전 아키텍처를 사용"15 ~ 20 BP)이 TALEN 아키텍처에 대한 이야기​​ RVDS (15 ~ 20)의 숫자.
3. "G의 변경"에서 "NN"을 선택 (구아노 별 NH의 RVDS도 사용할 수 있지만 아직 광범위하게 TALEN 어셈블리에 대한 테스트).
4. 선택 사항 : 다른 설정과 옵션에 대한 웹 사이트의 지시에 거기에서 제공하는 링크를 따르십시오.
5. 잠재적 인 타겟 사이트와 TEXTFILE이 될 수있는, 생성된다보다 편리하게 볼 수있는 스프레드 시트 프로그램으로 가져올. 골든 게이트 어셈블리의 TALEN 쌍 (들)을 선택합니다.
6. 선택 사항 : 순서 공공 데이터베이스 회계 및되지 않을 수 있습니다 가능한 단일 염기 다형성 (SNP를)을 감지하는 미세 주입에 사용되는 마우스의 변형에 대한 관심의 게놈 영역은 잠재적으로 결합 핵산 분해 효소를 방지 할 수 있습니다.
7. 옵션 : 추가 디자이너 클레아 관련 온라인 리소스 표 3을 참조하십시오.
8. ZFN 및 TALEN 건설에 필요한 대부분의 플라스미드 Addgene에서 얻을 수 있습니다 :
   http://www.addgene.org/special-collections/
   골든 게이트 TALEN 키트 및 포유류 TALEN 표현 구문에 대한 Addgene ID는 표 2에 제공된다.
   대안 적으로, 징크 핑거 도메인과 같은 특정 기능 모듈은 유전자 합성 서비스 제공 업체에서 주문할 수 있습니다.

2 "jove_title". 골든 게이트 TALEN 회의

이 섹션에서는 Cermak 등. ¹³ 전체 길이 TALENs 두 개의 연속 골든 게이트 복제 단계 (그림 1)를 사용하여 구성되어 발행 프로토콜을 사용하여 TALENs의 조립에 대해 설명합니다. 이 접근법은 최종 발현 구성체로 (12) 및 (31) 사이의 임의의 수 RVDS의 혼입을 허용한다. 조립 프로토콜은 난자의 미세 주입 다음과 같은 왕성한 활동 TALENs을 표현 생성의 mRNA (그림 1C)을 위해 설계 대상 벡터에 적응하고있다. 또한 (수립하고 플라스미드 라이브러리를 유지하는 골든 게이트 TALEN 키트의 온라인 프로토콜을 참조하십시오 http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/ )를.

1. 1 일 - 골든 게이트 반응 # 1 - pFUS 벡터에 RVD 배열의 조립
   1. 선택 사항 : P 디자인 각 TALEN의 페어rotocol 한 각 금문교 반응에 피펫 팅 방식을 생성하는 TALEN_Voytas_Pipetting 스프레드 시트로 ( '내지 3'초기 T, 5 등)이 목표 위치의 DNA 서열을 입력 (또는 어셈블리를 사용하는 모든 플라스미드 농도를 입력 ). 스프레드 시트는 2.5.2 절에서 시퀀싱 결과의 정렬을 위해 사용할 수있는 모든 RVDS의 예상 DNA 시퀀스를 제공합니다.
   2. 모든 고유 TALEN는 프로토콜 1의 설계의 경우 :
      TALEN 길이는 12-21 (표준)를 선택 반복 변수의 디 - 잔류 물 (RVDS) 1-10 및 대상 벡터 pFUS_A 경우. 나머지 RVDS와 섹션 2.3.3에서 최종 조립에 추가됩니다 마지막으로 반복, 선택 RVDS 11 ~ 14과 대상 벡터 pFUS_B4 (그림 1A)를 포함하여 15 RVDS (와 TALEN 예 : pFUS_B 대상 벡터를 선택합니다.
      TALEN 길이가 22 ~ 31 인 경우, 사용 RVDS 1-10 및 대상했습니다ctor에 pFUS_A30A. RVDS 11-20 및 대상 벡터 pFUS_A30B을 선택합니다. 나머지 RVDS 24 RVDS는 RVDS 21-23 및 대상 벡터 pFUS_B3을 선택과 TALEN 예 : pFUS_Bdestination 벡터를 선택합니다.
   3. 이상 21 RVDS, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B, 그리고 나머지 RVDS 각 pFUS + RVD 조합 별도로, 즉 1-10 + pFUS_A하고 나머지 RVDS + 각각의 pFUS_B 벡터 또는 TALEN에 골든 게이트 반응 # 1을 설정 + 각각의 pFUS_B 벡터. 20 μL 총 반응 부피에 각 RVD 벡터의 150 NG, pFUS 벡터의 150 NG, 1 μL BsaI, 1 μL의 T4의 DNA 리가 아제, 2 μL 배 T4의 DNA 리가 아제 버퍼, 및 H ₂ O를 사용합니다. (T4 리가 버퍼의 반복 해동 / 냉동 반응의 효율성을 줄일 수 있기 때문에 골든 게이트 어셈블리의 각 라운드에 대한 T4 리가 버퍼의 신선한 분주을 사용하는 것이 좋습니다.)
   4. 열 자전거 타는 사람에 골든 게이트 반응을 놓습니다.
      프로그램 :
      37 ° C에서 5 분
      16 ° C에서 10 분
      10 회
      50 ° C에서 5 분
      80 ° C에서 5 분
   5. 각 믹스에 1 ㎕의 10 mM의 ATP 1 μL 플라스미드 - 안전 클레아 제를 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. 이 치료는 변형 된 박테리아의 생체 상동 재조합에 의해 대상 벡터로 복제 할 수있는 선형 불완전 결찰 제품을 제거합니다.
   6. E.에게 변환 개인 결찰 반응과 대장균 (예 : XL1 - 블루 또는 DH5α 같은 α-보완을 촉진 electrocompetent 또는 화학적으로 유능한 대장균 여기 이후의 변환에 사용될 수있다).
   7. X-걸과 IPTG와 스펙 티노 마이신 접시에 박테리아 (50 ㎍ / ㎖) 판 블루 / 화이트 식민지 선택을 위해 (40 μg이 / 각 ML).
2. 2 일 - 올바른 pFUS-RVDS 총회의 확인
   1. 프라이머 pCR8_F1 및 pCR8_R1과 식민지 PCR을 사용하여 (프라이머 서열 표 1 참조) 화면 1-3 흰색각 플레이트에서 식민지. 올바른 pFUS-RVDS 어셈블리는 일반적으로 결합 된 복제 된 모든 RVDS (10 RVDS 예 : 주변에 1.1 KB)의 길이에 해당하는 밴드를 보여 작은 덜 눈에 띄는 밴드 (그림 1B)의 "사다리".
      PCR 프로그램 :
      95 ° C에서 3 분
      95 ° C 30 초
      55 ° C 30 초
      72 ° C에서 1 분 45 초
      30 ~ 35 회
      72 ° C에서 10 분
   2. 사용 (50 ㎍ / ㎖의 스펙 티노 마이신과 2-5 ml의 LB) 하룻밤 문화를 시작하는 클론을 확인했다.
3. 3 일 - 골든 게이트 반응 # 2 - TALEN 발현 벡터에 RVD 배열
   1. (RVDS pFUS_A 및 pFUS_B 또는 pFUS_A30A, pFUS_A30B 및 pFUS_B 하나의 수에 따라) pFUS-RVD 어셈블리를 분리하기 위해 "minipreps"를 수행합니다.
   2. 선택 사항 : 프라이머 pCR8_F1, pCR8_R1을 (프라이머 서열 표 1 참조)를 사용하여 시퀀스 개별 pFUS 벡터. 시퀀싱은 F에서 수행 될 수있다원고 판 TALEN는 생성 (2.5.2 절); 그러나, 더 이상 TALENs의 완료를위한 생어 시퀀싱을 사용하지 못할 수도 있습니다 모든 RVDS의 읽습니다.
   3. 각각의 단일 TALEN에 골든 게이트 반응 # 2를 설정합니다. 각 pFUS 벡터의 150 NG, RVD 시퀀스의 설계 및 L의 EFT TALEN 75 NG를 사용에 따라 PLR-HD, PLR-NG, PLR-NI, PLR-NN (마지막으로 "반 반복")의 150 NG pCAG-T7-TALEN-ELD-목적지의 오른쪽 TALEN 75 NG pCAG-T7-TALEN-KKR - 목적지 (또는 그 반대)를 사용하십시오. 1 μL Esp3I, 1 μL의 T4의 DNA 리가 아제, 2 ㎕의 10 배 T4 DNA 리가 아제 버퍼를 추가, H ₂ O 20 μL 총 반응 부피.
   4. 열 자전거 타는 사람에 골든 게이트 반응을 놓습니다.
      프로그램 :
      37 ° C에서 5 분
      16 ° C에서 10 분
      10 사이클
      37 ° C에서 15 분
      80 ° C에서 5 분
   5. E.를 변환 2.3.4 절에서 반응을 사용하여 대장균.
4. <강한> 4 일 - 올바른 TALEN 총회의 확인
   1. 식민지 프라이머 TAL_F1와 PCR 및 TAL_R2하여 각 판의 화면 1-3 흰색 식민지 (프라이머 서열 표 1 참조). 올바르게 조립 TALENs는 길이 (도 1D,이 대역은 "사다리 효과"성공적인 어셈블리의 강력한 표시기를 나타낸다 검출하기 어려울 때가있다) 혼입 RVDS의 총 수에 대응하는 PCR 생성물을 나타낸다.
      PCR 프로그램 :
      95 ° C에서 3 분
      95 ° C 30 초
      55 ° C 30 초
      72 ° C에서 3 분
      30 ~ 35 회
      72 ° C에서 10 분
   2. 사용 밤새 세균성 문화 (2 ~ 5 ㎖를 100 ㎍ / ㎖의 암피실린과 LB)을 시작하는 정확한 클론을 확인했다.
5. 5 일 - 올바른 TALEN 총회의 확인
   1. pCAG-T7-TALEN 플라스미드를 분리하기 위해 "minipreps"를 수행합니다.
   2. 순서는 자체에서 수행되지 않은 경우ction의 2.3.2를 사용 프라이머 TAL_Seq_5-1과 TAL_R2 전체 길이 TALEN에 올바른 RVD 어셈블리를 결정하기 위해 (프라이머 서열 표 1 참조).

3. 핵산 분해 효소 mRNA의 합성

1. DNA 템플릿의 생성
   1. 높은 품질의 미디 또는 mRNA의 합성 pCAG-T7-TALEN 플라스미드 maxipreps를 준비합니다.
   2. 우선적으로 절단하여 다운 스트림 및 뉴 클레아 STOP 코돈에 근접 (pCAG-T7-TALEN 벡터에 대한이 SacI에 사용) 제한 효소를 사용하여 TALEN 또는 ZFN mRNA의 합성 플라스미드의 10 μg을 선형화. mRNA의 합성 플라스미드는 일반적으로 핵산 분해 효소 코딩 서열의 상류 T7 또는 SP6 파지 프로모터 있습니다.
   3. 완전한 소화를 확인하기 위해 0.7 ~ 1 % 아가로 오스 겔에 소화 플라스미드의 200-500 NG를 실행합니다.
   4. temperatur를 방에서 1 시간 동안 0.1 체적 아세트산 나트륨 및 3 부피의 에탄올로 DNA를 침전시켜 소화 플라스미드로부터 염을 제거전자. 에탄올, 공기가 RNase가없는 물을 적절한 양의 펠릿에 resuspend 건조 제거, 또 다른 5 분, 200 70 μL % 에탄올로 스핀을 펠렛을 씻어 10 분 동안 14,000 XG 이상에서 원심 분리하여 DNA 펠렛. 선형화 된 플라스미드의 정제는 컬럼 기반의 시스템, 예를 들면 제품, QIAquick PCR 정제 키트를 사용하는 것도 가능하다.
   5. 선형 템플릿의 농도를 결정하고 시험 관내 전사의 설정 1 μg을 사용합니다.
2. mRNA의 합성 및 폴리아 데 닐화
   1. pCAG-T7-TALEN의 시험 관내 전사의 경우 플라스미드 mMESSAGEmMACHINE T7 울트라 키트를 사용합니다. 핵산 분해 효소가없는 물 20 μL, 10 μL T7 배 NTP / ARCA, 2 ㎕의 10 배 T7 반응 버퍼, DNA 템플릿의 1 μg, 2 μL의 T7 효소 믹스 : 얼음의 각 TALEN의 전사 반응을 설정합니다. 반응을 혼합하고 37 ℃에서 1 ~ 2 시간 동안 배양
   2. 전체 20 μL의 transcrip를 사용핵산 분해 효소가없는 물 36 μL, 20 μL 배 EPAP 버퍼, 10 ㎕의 25 mM의 MnCl2, 10 ㎕의 10 mM의 ATP : 얼음에 폴리아 데 닐화 반응을 설정하는 기의 반응 혼합물. 믹스와 (각각 왼쪽과 오른쪽 클레아 제에 대한) 제어 샘플 L1과 R1으로 반응 혼합물의 2.5 μl를 제거합니다. E-PAP 효소의 4 μl를 추가하고 37 ℃에서 45 ~ 60 분 동안 반응을 품어 제어 샘플 L2와 R2로 반응 혼합물의 또 다른 2.5 μl를 제거합니다.
3. mRNA의 정화
   1. mRNA의 정화 (버퍼 교환 및 비법 인 뉴클레오티드의 제거)에 NucAway 스핀 열을 사용합니다. 열의 바닥에 건조 겔을 해결하기 위해 열을 누릅니다. RNase가없는 미세 주입 버퍼 (1 MM 트리스 - 망할 CIA, 0.1 EDTA, pH를 7.5) 650 μL와 가성 열입니다. 모자, 소용돌이, 공기 방울을 누른 실온에서 15 분 동안 수화물.
   2. 컬렉션 튜브와 스핀에 열을 놓습니다750 XG에서, 4 ° C에서 2 분 초과 틈새 액체를 제거합니다. 1.5 ㎖의 용출 관에서 포집 관과 장소 열을 버리십시오.
   3. 750 XG, 2 분 동안 4 ° C에서 열 스핀에 3.2.2에서 완전한 반응 혼합물을 적용합니다. 핵산 분해 효소의 mRNA는 이제 미세 주입 버퍼에 용해됩니다. 정제 된 샘플 L3 및 R3의 2.5 μl를 제거합니다.
   4. -80 ° C에서 보관 mRNA의 미세 주입 분량 씩이 준비 될 때까지이.
4. mRNA의 젤 전기
   1. 10 % SDS 용액 또는 RNaseZAP를 사용하여 RNA 분해 효소의 오염을 제거하는 젤 챔버를 청소합니다.
   2. 1xTBE 실행 버퍼에서 1 % 아가로 오스 겔을 준비한다.
   3. NorthernMax 포름 알데히드 부하 염료의 전 3 권 각 RNA 샘플 L1/R1, L2/R2, L3/R3를 혼합하고 65 ℃에서 15 분 동안 품어
   4. 로드 샘플 및 젤의 RNA 크기 사다리 (예를 들어 RNA 밀레니엄 크기 마커)로딩 염료 겔의 끝에 도달 할 때까지의 1X TBE 10 V / cm에서 젤을 실행.
   5. 실온에서 교반하면서 30 ~ 60 분 동안 SYBR 그린 용액 (Invitrogen 사)를 사용하여 겔을 염색.
   6. 이미지 젤 L2/R2 및 L3/R3로 L1/R1의 크기를 비교한다. 샘플 L2/R2 및 L3/R3 (그림 2)에서 성공 폴리아 데 닐화를 나타내는 L1/R1에 비해 증가 된 크기의 밴드를 표시해야합니다.
   7. 분광 광도계를 사용하여 mRNA의 농도를 결정합니다.
   8. 1:1의 비율로 왼쪽과 오른쪽 클레아 핵산 분해 효소의 mRNA를 혼합하여 microinjections에 대한 mRNA의 분취 량을 준비합니다. 우리는 미세 주입 버퍼로 희석하여 200 NG / μL의 총 농도 (각 클레아 제 100 NG / μL)로 분주을 준비하는 것이 좋습니다. C. ° -80에서 보관 mRNA의 분주

4. 배아 분리 및 미세 주입

1. 배아 격리. 이 프로토콜은 성공적으로 C57BL/6J 및 BDF1 변형에 사용 된s 및 대부분 흔히 그러한 FVB 또는 CBF1 같은 마이크로 인젝션 실험에 사용 된 다른 균주에 적용 할 수있다. 쥐가 음식과 물을 임의로와 온도 및 습도 조절 시설에 12 시간 - 12의 시간의 명암주기에 따라 보관되어 있습니다.
   1. Superovulate 기증자 여성은 태아의 수율을 증가시킵니다. (4 주 오래 된) 16 명의 여성을 48 시간 후 5 IU 인간 chorionic gonadotropin (hCG)의 IP를 주입 한 다음 5 IU 임신 한 암말의 혈청 성 성선 자극 호르몬 (PMSG)의 복강 내 (IP) 주입에 의해 교배되어 있습니다.
   2. 16 사육 시대 (2-8개월)에 16 과배란 여성 메이트 즉시 hCG의 주입 후 남성.
   3. 이러한 CO ₂ 흡입으로 승인 안락사 프로토콜을 사용하여 여성을 제물로 바친다.
   4. 수정 된 난자를 복구 할 수 있습니다. 난 모세포는 다음날 아침 난관에서 수집하고 M2 매체에 용해 된 0.1 % 소 히알루에서 3 ~ 5 분 처리에 의해 남아있는 난구 세포에서 해제됩니다. 상대의 성능과 사용되는 균주에 따라 배아 수익률은 다를 수 있습니다. BDF1은 각각 300 ~ 400 수정 된 난자를 얻을 수있는 반면 16 C57BL/6J 암컷은 보통 150 ~ 250을 생산하고 있습니다.
2. 배아 미세 주입
   1. 핵산 분해 효소의 mRNA를 주입한다. 전핵 단계의 난자는 일반적으로 이른 오후에 주입된다. 세포질 mRNA의 마이크로 인젝션는 20X 대물 렌즈를 이용하여 노멀 스키 DIC와 함께 배아 미세 조작기뿐만 아니라 사출 유닛을 탑재 도립 현미경을 사용하여 미네랄 오일 아래 M2 배지에서 수행된다. 우리는 10 NG / μL의 농도 (총 20 NG / μL)에 TALEN의 mRNA의 주입을 시작하는 것이 좋습니다.
   2. 유지 모세관으로 난자를 대기음 pronuclei과의 접촉을 피하고 배아의 세포질에서 클레아 제의 mRNA를 주입. 주입은 세포막 부근 얕은해야한다. 주입 부피는 낮게 유지되어야하고, 미세 주사 바늘 위트해야세포질 팽만의 첫 징후에 hdrawn. 미세 주입 시리즈는 일반적으로 100 ~ 300 난자 구성됩니다. 일반적으로 태아의 이상 80~90% 즉시 용해하지 않고 주사를 생존해야합니다.
   3. 미세 주입 후, 37 ° C에서 M16 (시그마) 배지에서 1 시간 동안 배아를 배치하고 5 % CO _2와 pseudopregnant 수양 어머니로 남아있는 배아를 전송합니다.

5. 외과 배아 전송

1. pseudopregnant 배아받는 사람 (수양 어머니에게) mRNA의 미세 주입 하루 전에 준비한다. 강력한 비근 교계 변형, CD-1, 잘 역할 등의 적합의 (3-6 개월) 중년 여성. 어느 수술이나 유전과 vasectomized 남성 ⁽²⁸⁾ 이전의 일에 암컷을 교배하여 pseudopregnancy을 유도한다. 명확한 교미 마개를 가진 0.5 DPC의 여성은 태아의받는 사람으로 사용됩니다. 사용하지 않은 여성에 pseudopregnancy은 약 3 꼬마 후에 사라자신의 반복 사용을 허용 KS.
2. 케타민을 복강 주사로 0.5 DPC 수양 어머니 여성을 마취시키다, 자일 라진 (각각 120 ㎎ / ㎏, 16 ㎎ / ㎏). 이 제제 보장 ~ 30 분 수술 허용 시간은 5 ~ 10 분의 예상 작업 시간을 충분 이상입니다.
3. 따뜻한 표면에 그것의 복부에 마취 동물을 배치하고 70 % 에탄올이나 클로르헥시딘과 알코올의 혼합물로서 적절한 소독제와 절개의 영역을 소독.
4. 동물의 뒷면에있는 피부를 절개하고 멸균 가위로 복강을 엽니 다.
5. 시각화 및 난소에 부착 된 지방 패드 당겨 자궁 경적을 구체화. 따뜻한 0.9 % NaCl 용액을 사용하여 촉촉한 장기 보관하십시오. 수술 부위는 멸균 드레싱 드리 워진 또는 지역 동물 지침을 준수하기 위해 면도해야 할 수 있음을 유의하십시오.
6. 불독 클램프 난소 지방 패드를 클리핑하여 생식 기관을 무력화.
7. 조심스럽게 시계 제조 집게로 팽대부의 상류 난관을 잡고 난관 벽에 작은 구멍을 만들기 위해 30 G 피하 주사 바늘을 사용합니다.
8. 바늘을 철수 부드럽게 모세관 홀더의 마우스 피스로 불고 팽대부에서 배아의 배치를 허용하는 구멍으로 배아를 포함하는 얇은 유리 모세관을 삽입. 배아는 팽대부에 증착되면 모세 혈관을 철회하고 다시 체강의 생식 기관을 대체합니다.
9. 멸균 봉합 (Prolene으로 6-0)의 일련의 복강을 닫습니다.
10. 개구부의 크기에 따라 1-2 창상 클립 (Autoclip 9mm)를 사용하여 피부를 닫는다.
11. 작업이 자신의 홈 케이지에 동물을 반환하고 마취의 효과가 닳아 때까지 감독 다음과 같습니다.
12. 스트레스를 최소화 (2-4 동물 / III 형 케이지) 가능하면 안정적인 사회 집단의 쥐를 수용하기 위해.
13. 수술 후 진통제 적용Dafalgan의 형태의 수술 후 3 일 동안 식수 (해열 200 ㎎ / ㎏ BW)에 추가됩니다.

6. PCR 및 T7 효소 또는 제한 효소 분해에 의해 설립자 분석

1. 핵산 분해 효소 결합 부위 주변에 200-700 BP 사이의 영역을 증폭하는 디자인 프라이머. 거리 앞으로 프라이머 - 뉴 클레아 스페이서 영역 및 클레아 제 스페이서 지역 리버스 프라이머는 아가로 오스 겔에 소화 제품에 대한 두 개의 밴드의 검출 (예는 그림 3과 4 참조)을 허용하기에 충분히 달라야합니다.
2. 최적의 조건으로 PCR을 실행합니다. 아가로 오스 겔에 PCR 증폭 물 크기를 확인합니다.
3. 선택 사항 : PCR 믹스에서 염 및 핵산을 제거하는 제품, QIAquick PCR 정제 키트와 함께 예를 들어 순화 PCR 제품. 다양한 제한 효소는 적절한 제한 효소 완충액 및 정제 보완 PCR 샘플에서 활성이 필요하지 않다. 우리는 또한 했습이QiagenTaq PCR 버퍼 에서야 사용 T7 효소는 NEBuffer 2 보완.
4. 1. T7 효소 분석법. NEBuffer 2의 2 μL와 PCR 제품의 17 μl를 혼합하고 heteroduplex 형성을 실행한다 (그림 3B) 열 순환기의 프로그램 :
      95 ° C에서 2 분
      95 ° C에서 85 ° C (-4 ° C / 초)
      85 ° C에서 25 ° C까지 (-0.1 ° C / 초)
      4 ° C 유지.
      각 샘플에 T7 효소 1 μl를 추가하고 20 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. (CEL 1 클레아 제에 의존 측량 분석 (Transgenomic)는,도. 제조업체의 지침을 참조하십시오 여기에 사용할 수 있습니다.)
   2. PCR 제품의 제한 다이제스트. 배 제한 효소 버퍼 2 μL 및 제한 효소 1 ㎕ 씩 PCR 제품의 17 μl를 섞는다. 1 시간 이상 적당한 온도에서 소화.
5. 샘플 DNA 로딩 염료를 추가하고 구별 소화를 검출하는 2 % 아가 로즈 겔상에서 실행할야생 형 동물과 돌연변이 대립 유전자를 운반하는 창업자를위한 패턴. 예상되는 결과에 대한 그림 3과 4를 참조하십시오.
6. 클론의 PCR을 pGEM-T Easyor에 TA-복제가 직접 차세대 시퀀싱을 사용하여 PCR 제품의 혼합물을 시퀀스 예 생어 시퀀싱 돌연변이 대립 유전자 (긍정적 설립자의 제품.

결과

우리는 포유 동물 세포에서 TALENs의 표현뿐만 아니라 T7 파지 프로모터 (그림 1C)에서 체외 mRNA의 합성을 허용 Cermak 등. ^(13)에 의해 발표 된 골든 GateTALEN 어셈블리와 호환 대상 플라스미드를 건설했다. 이 플라스미드 FokI 동종이 량체에 대해 오프 대상 영향을 줄이기 위해 FokI는 ^25,29를 이종 첫 번째 세대에 비해 분열 활동을 강화하는 것으로 나타났다 이종이 FokI 도메인 (ELD 또는 KKR 돌연변이)를 수행한다. 골든 게이트 조립 반응 # 1과 # 2는 일반적으로 매우 효율적이며, 모든 흰색 식민지, 식민지 PCR로 분석 할 때, 복제 RVDS (그림 1B와 1D)의 특정 번호에 대한 예상 패턴을 보여줍니다.

체외 합성의 mRNA의 젤 분석 (그림 2) 분석의 모든 샘플에 대한 거의 또는 전혀 얼룩으로 하나의 구별 밴드를 공개한다. 성공적인 폴리아 데 닐화를 나타내는 샘플 L1/R1 및 L2/R2, L3/R3, 사이에 명확한 크기의 변화가 있어야합니다.

설립자 동물은 효소를 사용하여 하나 T7 엔도 뉴 클레아 제 소화에 이어 유전자형 PCR (도 3) 또는 제한 다이제스트를 사용 NHEJ 유도 돌연변이 대립 유전자에 대해 스크리닝 할 수 클레아 쌍의 스페이서 영역 내의 클리브 야생형 서열 (도 4)이. T7 엔도 뉴 클레아 제 분석은 상관없이 주입 클레아 쌍의 스페이서 영역 내의 특정 게놈 서열의 돌연변이 모든 종류에 적용될 수있다; 그러나 heteroduplex PCR 제품에서 DNA 가닥 사이에만 불일치를 검출한다. 따라서, 설립자가 동일한 두 변이 대립 유전자를 운반하는 드문 경우에, PCR 제품은 T7 소화 패턴을 보여주지 않을 것입니다. 특정 제한 부위가 NHEJ 의해 제거 될 클레아 스페이서 영역 내에 위치 할 때 그러한 구별은 항상 그러나 가능삽입 / 삭제 (그림 5) 유도. 여기에, 소화되지 않은 밴드는 돌연변이의 존재를 표시하고 모든 소화 제품의 부재는 강하게 (그림 (b)에 별표로 표시) 대상 유전자의 두 대립 유전자의 돌연변이를 운반하는 창업자을 제안합니다.

그림 1. pFUS 벡터에 RVD 배열의 이종이 pCAG-T7-대상 벡터에 TALEN RVDS의 골든 게이트 복제.) 조립. 다음 예는 각각의 이야기 배열은 각각 15 RVDS 17 RVDS를 포함와 TALEN 쌍에 대해 표시됩니다 (이상 21 RVDS보다 이야기 배열에 세 pFUS-RVDS 어셈블리가 표시되지 요구된다). 화살표는 pFUS 특정 식민지 PCR 반응. B) PCR 제품에 대한 프라이머를 나타냅니다올바른 pFUS의 어셈블리에서 증폭 일반적으로) 밴드가 복제 된 모든 RVDS (10 RVDS 용 등 약 1.1 KB) 및 적법 RVD 배열의 반복 특성으로 작은 덜 눈에 띄는 밴드의 "사다리". C의 결합 길이에 대응 보여 최종 조립 pFUS-RVD 배열과 각각 FokIELD 및 FokIKKR 변형과 이종이 TALEN 발현 벡터에 마지막 반복 (PLR)를 포함하는 플라스미드. (N과 C로 주석) TALEN 백본 T7 파지 프로모터에 허용하는 동안 CAG (CMV 초기 증강 요소 / 닭 베타 - 액틴) 프로모터가 형질 전환 된 포유류 세포에서 높은 발현 수준을 보장 밀러 등. ^(23)에 의해 발표 된 아키텍처와 유사 체외 mRNA의 합성 (클레아 제 STOP 코돈의 하류 벡터의 선형화를위한 SacI에 사용). D) C에서 화살표로 표시된 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR)가 제대로 조립 TALENs을 식별 할 수 있습니다. 전체 lengt에"사다리 효과"성공적으로 어셈블리의 강력한 지표를 나타낸다 H PCR 제품은 종종 덜 눈에 띄는입니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2. . 아가로 오스 겔 전기 영동을 사용하여 시험 관내 합성 핵산 분해 효소의 mRNA의 품질 관리가 ZFN의의 mRNA는 예로 표시됩니다 (L, ZFN을 왼쪽, R, 우측 ZFN). 샘플 전에 폴리아 데 닐화에 mRNA를 보여 L1/R1, mRNA와 L3/R3 폴리아 데 닐화 샘플 L2/R2 쇼 정제 폴리아 데 닐화의 mRNA를 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

콘텐츠 폭 FO = "6 인치": SRC = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg"SRC = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg"폭 = "600"FO 고도는 = "그림 3" />
그림 3. 대상 현장의 핵산 분해 효소에 의한 돌연변이를 들고 설립자 동물의 식별에 사용 T7 효소 분석의 예. A) TALEN 쌍이 마우스 프리온 단백질 유전자 (PRNP의 코딩 영역 내에서 절단하도록 설계되었다 TALEN 표적 서열)은 요청에 따라 제공 될 수있다. PCR 생성물을 PCR 생성물이 연속적으로 형성 및 T7 엔도 뉴 클레아 제 소화를 heteroduplex 행 하였다 상류 110 BP 위치한 정방향 프라이머 (F) 및 역방향 프라이머 (R) TALEN 절단 부위. B의 하류 250 BP)를 이용하여 생성된다. C) 하나의 설립자의 대상으로 게놈 영역 내에서 TALEN에 의한 돌연변이 유발은 소화 (250)의 제품 및 110 bps의 전체 길이 PCR 제품의 존재에 의해 드러났습니다.50930/50930fig3highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 대상 현장의 핵산 분해 효소에 의한 돌연변이 마우스 Rosa26 궤적 ²⁹ 대상 인트론 (1)의 내부를 XbaI 제한 사이트. ZFN의 특정을 들고 설립자 동물의 식별에 사용되는 PCR 제품의 제한 다이제스트의 예.) 설립자는 사용하여 PCR 유전형에 의해 상영되었다 앞으로 프라이머 (F)는 500 상류 BP와 역방향 프라이머 (R) 절단 부위. B의 하류 250 BP)를 XbaI과 PCR 제품의 소화가 별표로 표시 양방향 대립 유전자 돌연변이 생쥐 ()를 나타내는 소화 패턴을 보여, 모노 위치 - 대립 유전자의 돌연변이 (소화 소화되지 않은 밴드, 예를 들어 동물 2)잠재적 인 양 대립 유전자 변형 생쥐의 중량 및 마우스 (완전 소화, 예를 들어 동물 21). C) 연속 3 (동물 24) 별개의 삽입 / 삭제에 나타납니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

프라이머의 이름	'3'시퀀스 5
pCR8_F1	ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1	cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1	ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2	ggcgacgaggtggtcgttgg
TAL_Seq_5-1	catcgcgcaatgcactgac

표 1. 골든 게이트 TALEN 어셈블리 내에서 식민지의 PCR 및 시퀀싱에 사용되는 프라이머 시퀀스프로토콜입니다.

플라스미드 / 컬렉션	기부자	Addgene ID	댓글
골든 게이트 TALEN 및 TAL 이펙터 키트 2.0	Voytas 실험실	1000000024	골든 게이트 TALEN의 조립에 필요한 모든 플라스미드를 포함
pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD 대상 벡터	Pelczar 실험실	40131, 40132	부가 기능에 대한 포유 동물 세포의 체외 mRNA의 합성 TALEN 식에 대한 플라스미드

표 2. 골든 게이트 TALEN 조립에 필요한 플라스미드 플라스미드 컬렉션 Addgene (에서 얻을 수 있습니다 www.addgene.org ).

온라인으로자원	댓글
http://tale-nt.cac.cornell.edu	TALEN의 디자인; TALEN 오프 대상 예측
http://zifit.partners.org/ZiFiT/	TALEN, OPEN ZFN, 코다 ZFN, CRISPR/Cas9의 디자인
http://www.genome-engineering.org	TALEN, CRISPR/Cas9의 디자인; CRISPR/Cas9 오프 대상 예측
http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html	TALEN의 조립 순서의 결과를 확인하는 시퀀스
http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html	모듈 조립 ZFN 설계
www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware	모듈 조립 ZFN 설계

표 3. ZFN, TALEN 및 CRISPR/Cas9 설계를위한 온라인 리소스.

토론

디자이너 클레아 제 중심의 게놈 편집 방법은 크게 각각의 게놈 ^{(10, 12)의} 목표 수정에 순종하는 종의 범위를 확장했다. 생쥐에서 유전자 표적으로 ES 세포에서 두 년 이상을위한 표준 기술이다; 쥐의 ES 세포의 일부가 최근 성공 하였지만 그러나, 마우스 이외의 종에서 ES 세포에 적응하기 어려운 입증되었다. 심지어 EUCOMM, KOMP, 또는 ZFN 및 TALEN는 높은 정밀도와이 될 수 있습니다 수정의 스펙트럼에 대한 유연성을 제공하여 NorCOMM ³ 게놈 편집과 같은 컨소시엄에 의해 제공 "기성"유전자 타겟 마우스 ES 세포 클론의 가용성 마우스 게놈에 도입했다. 클레아 제 - 매개 변이를 들고 설립자 동물은 항상 ES 세포의 배반포 주사에서 발생하는 키메라의 경우에는 해당되지 않습니다 높은 세균 줄 능력 ^4-6,20,21 될 것으로 보인다. 따라서, DES의 특정 경우의 미세 주입에igner의 클레아는 ​​표적으로 한 게놈 수정을 새로운 마우스 선 훨씬 빠르게 생성 될 수 있습니다.

ZFN 및 TALEN의 주사로 녹아웃 마우스의 성공적인 세대는 주입 된 핵산 분해 효소 쌍의 활동에 따라 크게 좌우됩니다. TALENs 유기체의 수의 유전자의 넓은 범위를 대상으로 높은 성공률을 보여왔다; 그러나, 최근의 연구는 TALEN 바인딩 시토신 메틸화 ^{(30, 31)에} 민감한 것이 좋습니다. 따라서, 새로 생성 된 핵산 분해 효소 쌍, 예를 들어 TALENs이 pCAG-T7 벡터에 클로닝 등 NIH-3T3 또는 신경과 같은 마우스 세포주에 일시적으로 형질 전환 할 수 있습니다 다소 마우스 배아의 염색질 상태를 모방-2A. 여기서, 뉴 클레아 제 활성은 종래의 mRNA 합성과 마이크로 인젝션에 제 5 절에 설명 된 T7 효소 분석 또는 PCR 생성물의 제한 다이제스트를 사용하여 추정 될 수있다. 우리는 점에서 관심의 게놈 영역의 염기 서열을 추천합니다세포주 및 마이크로 인젝션 실험에 사용 된 마우스 균주를 필자.

마우스의 수정란에서 다른 TALEN 또는 ZFN 쌍은 서로 다른 mRNA의 농도에서 최적으로 작동하기 때문에 미세 주입 핵산 분해 효소의 mRNA의 최적의 작업 농도는 실험적으로 결정해야 할 수 있습니다. 너무 높은이 배아 치사 될 수있는 반면 뉴 클레아 쌍에 따라, 너무 낮은 농도는없는 분열을 초래할 것입니다. 클레아 쌍에 따라, 우리는 2 NG / μL, 200 ㎍ / UL의 높은 최저 총 mRNA의 농도를 사용하여 성공을 거두었습니다. 이러한 효과는 세포 배양 및 배아의 생존과 목표 궤적의 변형 속도가 모두 경험적으로 결정해야합니다에 대한 핵산 분해 효소의 농도 최적의 실험에서 예측하기 어렵다.

고 활성 ZFN 또는 TALEN는 미세 주입 배아의 한 세포 단계를 넘어 자신의 표적 서열을 절단하기 때문에 돌연변이 유발의 복잡한 패턴을 일으킬 수 있습니다설립자의 D 모자이. 우리와 다른 사람 ^(4)는 하나의 창시자 (그림 5C)에 세 개 이상의 서로 다른 돌연변이 대립 유전자를 관찰했다. 이 시조에서 새로운 마우스 라인을 설정할 때 따라서, 자식은 신중하게 소화 분석은 정의되지 않은 돌연변이가 존재하는 경우에만 있다는 증거를 제공하기 때문에 유리한 돌연변이의 존재에 대한 염기 서열 검사를해야한다.

비판 중 하나는 자주 ZFN 및 TALEN 시스템에 대해 표명이 클레아도 대상 사이트와 유사하다 게놈에 다른 곳에서 현재 시퀀스를 쪼개기의 할 수있는 가능성이있다. 이러한 오프 대상 효과는 homodimeric의 FokI 도메인을 사용하여 초기 세대 시약으로 관찰되었으며, 이종 구조는 오프 대상 효과 ^25을 완화하도록 설계되었습니다. 잠재적 오프 - 타겟 위치는 ^{(32, 33)에} 실리 다소 예측과 PCR 및 시퀀싱에 의해 스크리닝 할 수있다. 분명한 장점 O오히려 F 세포주보다 마우스를 생성하고 ZFNs TALENs를 사용하여 선택 야생형 균주 몇개 backcrosses를 수행하여 원하는 게놈 수식에 링크 해제 대상 돌연변이를 제거 할 가능성이있다. 창시자 마우스의 다수 클레아 타겟 궤적 생성 및 실리코 오프 - 타겟 예측 PCR 제품의 차세대 깊은 시퀀싱 분석 유전자좌는 PCR 생성물의 분해 분석에 대안 정량적 판독을 제공 할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 설명하는 보조 생식 기술은 이러한 C57BL/6J 또는 B6D2F1 같은 미세 주입 실험에 사용되는 표준 마우스 종자에 최적화되어 있습니다. 이러한 이계 교배 균주 등 다양한 기원의 마우스는 원칙적으로 게놈 편집 방법에 사용할 수있는 특정 연구 질문에 대한 더 적합한 유전 배경을 제공 할 수 있습니다. 이러한 과배란 같은 보조 생식 기술의 성능은 predi이 될 수 있습니다변종 ^34-36의 번호를 cted하지만 클레아 미세 주입을위한 배아의 충분한 수를 얻기 위해 비표준 변종에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.

ZFN 및 TALEN 게다가, 이러한 RNA 유도 CRISPR/Cas9 시스템 ^9,37,38 새로운 디자이너 클레아 지금 게놈 편집 응용 프로그램에 도입되었습니다. 미세 주입하고 여기에 설명 설립자 동물의 분석을위한 모든 방법은 CRISPR/Cas9 게놈 편집의 미래 모드에 적용 할 수있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BsaI	NEB	R0535S or L
Esp3I	Thermo Scientific	ER0451
T4 Ligase	NEB	M0202S or L
Spectinomycin	Sigma	S0692-1ML
Ampicillin	Sigma	A0166
X-Gal	Sigma	B4252
IPTG	Sigma	I6758
Plasmid-Safe nuclease	Epicentre	E3101K
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAGEN Plasmid Midi Kit	Qiagen	12143
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit	Invitrogen	AM1345
NucAway Spin Columns	Invitrogen	AM10070
RNaseZAP	Sigma	R2020-250ML
NorthernMax Formaldyde Load Dye	Invitrogen	AM8552
RNA Millennium Markers	Invitrogen	AM7150
10x TBE buffer	Thermo Scientific	B52
T7 endonuclease	NEB	M0302S or L
pGEM-T EasyVector System I	Promega	A3600
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S-7563
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG)	Sigma	G4877
human chorionic gonadotropin (hCG)	Sigma	CG5
M2 embryo culture medium	Sigma	M7167
M16 embryo culture medium	Sigma	M7292
Mineral oil, embryo tested	Sigma	M8410
Ketamine	CentraVet	Ket 201
Xylazine	Sigma Aldrich	46995
Equipment/Tools
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200)	Nikon
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF)	Narishige
Embryo holding capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10
Embryo injection capillaries	Narishige	GD-1
Capillary puller (for example Sutter P97)	Sutter Instruments
Microforge (for example Narishige MF-900)	Narishige
Walton skin scissors	FST	14077-10
Surgical scissors	FST	14041-10
Surgical probe	FST	10140-03
Reflex wound clip system (9 mm)	FST	12031-09
Reflex wound clips (9 mm)	FST	12032-09
Dumont fine forceps 5	FST	11254-20
Moria curved forceps	FST	11370-31
Moria fine forceps	FST	11399-80
Dietrich bulldog clamp	FST	18038-45
C57BL/6J mice	Jackson Labs	strain code 000664
CD-1 mice	Charles River	strain code 000664