Murini trapianto di cornea: Un modello per studiare la forma più comune di trapianto di organi solidi

Riepilogo

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Abstract

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Introduzione

Il trapianto corneale è uno dei tipi più comuni di successo e trapianti eseguiti negli esseri umani. Le ragioni per cui si esegue questa chirurgia sono il risultato di lesioni, malattie infettive ^1, o di altre forme di malattie della cornea non infettive ^2. I dati della Eye Bank Association of America indicano che più di 46.000 sono stati eseguiti nel 2011 (si veda il sito Web all'indirizzo: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). L'indicazione del suo successo è che i tassi di fallimento di un anno per gli innesti corneali allogenici vanno dal 10 al 15% a 5 anni e il successo è superiore al 70% ^3-8. Come molti studi hanno dimostrato, il successo di alloinnesti corneali è direttamente legato al fatto che l'occhio è un sito immunologicamente privilegiato. I fattori responsabili dello stato cornee come sito privilegio immunitario comprendono la mancanza di entrambi i vasi sanguigni e linfatici nella cornea, una relativa assenza di cellule presentanti l'antigene, fattori prodotta dalla cornea che Abbateres funtions effettrici del sistema immunitario ^9-15, bassa espressione di MHC antigeni ^16, e l'espressione di FasL ^17-20.

Tuttavia, nonostante questi fattori predisponenti questi innesti di successo, essi vanno incontro a rigetto ^3-7. Di conseguenza, la comprensione quei meccanismi che mediano questo rifiuto e testare varie terapie per prevenire il rigetto è di importanza critica. A tal fine, si descrive qui un modello murino di trapianto di cornea, che è stato in uso per oltre 20 anni per studiare il trapianto di cornea in un ambiente controllato sperimentale. Poiché risposte trapianto coinvolgono diversi fattori che lavorano in concerto che sarà definitiva determinare se il tessuto trapiantato riesce o riesce, non è possibile comprendere l'importanza di tali elementi in qualsiasi modello in vitro. Di conseguenza, gli studi su animali intatti sono necessari per determinare quali sono i fattori importanti per il successo o il failure del tessuto trapiantato.

Mentre altre specie di animali sono stati utilizzati per studiare trapianto di cornea, il modello murino ha diversi vantaggi rispetto all'utilizzo di altre specie. Il primo è l'esistenza di molti ceppi di topi che esprimono alcuni transgeni o sono stati dei geni-bersaglio a non avere l'espressione di specifici fattori immunologici la cui funzione nel trapianto può essere meglio studiata. In aggiunta, ci sono molti reagenti (entrambi i fattori ricombinanti e anticorpi che neutralizzano i fattori) che sono specifici per i topi e che non esistono per molte altre specie di animali. A causa dell'esistenza di questi fattori, questo modello è stato ampiamente utilizzato per identificare i fattori rilevanti che partecipano acute risposte trapianto allogenico corneali ^{15, 17,18,20 -29.} Inoltre, molti dei fattori coinvolti nel trapianto di cornea sono anche noti per essere funzionale nel trapianto di altri tessuti.

Protocollo

NOTA: Tutti gli animali utilizzati in questa procedura sono trattati in conformità con l'Associazione per la Ricerca e la Visione e la dichiarazione di Oftalmologia per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, nonché le linee guida stabilite dalla commissione di sorveglianza degli animali a Saint Louis University.
NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici e le soluzioni sono sterilizzate prima di un intervento chirurgico per limitare l'infezione microbica degli occhi. Va notato che, mentre gli animali fanno vivere il dolore da questa procedura, non impieghiamo analgesici. La ragione di questo è perché tutti gli analgesici sono anti-infiammatori e da risposte trapianto di cornea coinvolgono l'infiammazione, l'uso di farmaci anti-infiammatori potrebbero compromettere la nostra capacità di determinare quali fattori sono coinvolti nel fallimento del trapianto di cornea.

1. Anestesia

1. Mettere i topi donatori e beneficiari in anestesia generale con iniezioni IP di ketamina (86.98 mg / kg) e xilazina (13,04 mg / kg).
2. Tenere il mouse recipiente sotto anestesia durante tutta la procedura che richiede in genere 30 minuti a un ora. Di conseguenza, monitorare costantemente il mouse per eventuali segni di riprendere conoscenza.
3. Applicare puralube pomata per l'occhio che non sottoporsi ad intervento chirurgico dopo che l'animale è anestetizzato per prevenire la secchezza.

2. innesto corneale

1. Ottenere il bottone corneale del donatore.
   1. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, conseguire un'adeguata midriasi mediante somministrazione di un paio di gocce oculari di 1% e 2,5% tropicamide fenilefrina cloridrato.
   2. Posizionare la testa dell'animale donatore orizzontalmente su una tavola posta su un robusto supporto mobile. Fissare la testa con una striscia di nastro sul collo per assicurare che l'occhio è in posizione orizzontale durante l'intera operazione.
   3. Utilizzando un trapano 2 mm di diametro, la cui punta è stato tinto con blu metile, fuorilinea il sito del trapianto della cornea centrale.
   4. Con una lama affilata, penetrare nella cornea e Healon iniettare nella camera anteriore di approfondire per ridurre la possibilità di danni all'endotelio donatore e lente sottostante.
   5. Accise l'innesto del donatore con Vännäs forbici e riporre in un piatto contenente soluzione salina bilanciata Hanks 'fino al momento dell'uso.
   6. Dopo l'innesto del donatore è stato il rimosso, eutanasia il mouse donatore tramite CO ₂ inalazione.
2. Preparare il letto trapianto.
   1. Ripetere la stessa procedura descritta al punto 2.1.1 tramite 2.1.2 per il destinatario.
   2. L'utilizzo di un trapano di diametro 1,5 mm delineare il sito ricevente del trapianto.
   3. Con una lama affilata, penetrare nella cornea e Healon iniettare nella camera anteriore di approfondire per ridurre la possibilità di danni alla lente sottostante.
   4. Rimuovere il pulsante corneale centrale delineato dal destinatario utilizzando Vännäs forbici e scartare.
3. Sutura deltrapianto
   1. Posizionare la cornea del donatore nel trapianto letto nella cornea del ricevente. Assicurarsi che un'adeguata Healon è sotto la cornea del donatore per proteggere le cellule endoteliali del donatore venga danneggiato da contatto diretto con lente.
   2. Utilizzando Super Fine microforceps a punta, posizionare il primo morso di 11-0 in nylon sutura nel lato dei donatori, attraverso il donatore con il 90% della profondità del tutto spessore a lato del destinatario, quindi legare.
   3. Una volta che la cornea è ancorato al suo posto, eseguire punti staccati midcardinal tale che la cornea ha da 8 a 10 punti di sutura totale e la cornea del donatore è rivestito in modo sicuro con e allegato al destinatario letto trapianto di cornea.
4. Approfondire la camera anteriore
   1. Approfondire la camera anteriore iniettando HBSS o bolla d'aria nella camera anteriore e controllare delicatamente l'integrità del trapianto di cornea per perdite con una spugna di cellulosa.
      NOTA: Se la camera anteriore non può essere riformato allora c'è un'alta probabilità di cataract che renderà le future valutazioni della cornea trapiantata molto difficile e anche potenzialmente portare ad una disfunzione dell'endotelio corneale del donatore e quindi il fallimento del trapianto.
5. Valutazione finale
   1. Osservare l'occhio per determinare che la pupilla è rotonda e la profondità della camera anteriore è normale.
      NOTA: Se l'alunno non è tutto ciò indica che durante la sutura l'iride è stato danneggiato e, quindi, l'innesto è considerato un guasto tecnico.
   2. Applicare una pomata antibiotica per gli occhi. Opzionale: Chiudere il coperchio occhio con una sutura di seta 7-0.
   3. Osservare i topi fino a quando sono completamente sveglio e poi individualmente li ospitano per un minimo di due giorni post-operatorie.

3. Sutura di rimozione

1. Nei casi in cui viene utilizzato coperchio sutura, anestetizzare topi come descritto sopra e rimuovere la sutura coperchio a 48 ore.
2. Anestetizzare topi il giorno 7 dopo l'intervento. Rimuovere il sutures garantire il trapianto di cornea. Una volta che i punti di sutura vengono rimossi e l'animale si è completamente risvegliato, restituirlo alla sua gabbia.

4. Valutazione clinica

1. Controllare l'occhio per indicazioni di complicazioni procedurali che comprendono, cataratta (opacità del cristallino), ifema (sangue nella camera anteriore), una camera anteriore che non è di profondità adeguata, o significativo l'opacità della cornea. Prendere in considerazione quelli che dimostrano queste complicazioni come "compromesso" e l'eutanasia da CO ₂ inalazione.
   1. Eseguire tutti gli esami sui topi non anestetizzati. Tenere il mouse con una mano trattenendo così il mouse in modo che l'altra parte può proptose l'occhio per consentire una migliore vista dell'occhio. Una volta che le osservazioni sono stati completati, rispedire l'animale verso la sua gabbia.
2. Avere un osservatore non hanno familiarità con i gruppi di trattamento valutare cornee trapiantate 2 o 3 volte a settimana per i segni di trapianto di corneaepisodi di rigetto o di fallimento del trapianto di cornea. Utilizzare il microscopio operatorio o un biomicroscopio con lampada a fessura orizzontale per queste osservazioni.
   1. Valutare ogni cornea opacità usando una scala da 0 a 5. La scala è definito come segue:
      1. Assegnare un punteggio da 0 a quelle cornee che non hanno segni di opacità.
      2. Assegnare un punteggio di 1 a quelle cornee che mostrano il minimo l'opacità superficiale.
      3. Assegnare un punteggio di 2 a cornee che visualizzano l'opacità mite e più in profondità, ma la pupilla e l'iride sottostante sono ancora distinguibile.
      4. Assegnare un punteggio di 3 cornea da visualizzare stromale opacità in cui il diaframma non possono essere viste in dettaglio con l'eccezione dei margini pupilla.
      5. Assegnare un punteggio di 4 a cornea da visualizzare densa opacità stromale e se non strutture sottostanti possono essere visualizzati.
      6. Assegnare un punteggio di 5 a cornea da visualizzare per l'opacità completa ed intensa edema stromale, con la pupilla e l'iride completamente oscurata.
   2. Inoltre valuta ogni cornea per il grado di infiltrazione dei vasi sanguigni (neovascolarizzazione) utilizzando una scala di valutazione da 1 a 8. Per eseguire ciò, visualizzare la cornea come costituito da 4 quadranti uguali e determinare la quantità di vasi sanguigni in ciascuno di questi quadranti con punteggio che spaziano volontà da 0 (nessun vasi) a 2 per esteso vascolarizzazione di quel quadrante. Aggiungere i singoli punteggi di ogni quadrante per calcolare il punteggio finale neovascolarizzazione.
   3. Classificare cornee come acutamente rifiutati se hanno un punteggio di 3 per due osservazioni consecutive per tempo i punti fino a 5 settimane.
   4. Classificare i topi le cui cornee erano chiari a 5 settimane, ma sviluppare opacizzazione a volte> 45 giorni dopo l'attecchimento, con un punteggio di 3 per due momenti consecutivi, ad avere subito in ritardo termine rigetto corneale. Utilizzare le curve di Kaplan-Meier di sopravvivenza per analizzare la sopravvivenza del trapianto.

5. Manipolazione del Modello

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Preparazione delle singole cellule dalla milza.

1. Per preparare singole cellule, prima eutanasia il mouse donatore. Quindi, rimuovere la milza.
2. Posizionare la milza in un colino cellulare e interrompere con un pistone della siringa da una siringa da 3 ml.
3. Lavare le cellule e risospendere in 10 ml di soluzione salina bilanciata Hanks.
4. Rimuovere 10 ml di sospensione cellulare e aggiungere 10 ml di 0,4% trypan blu e mescolare. Aggiungere che emocitometro e contare le cellule nella griglia centrale. Il numero di cellule nel tubo è il numero di celle 10 x ⁴ x 2 (fattore di diluizione in blu tripan) x 10 (volume nel tubo).

Iniezione nella camera anteriore.

1. Anestetizzare topi come precedentemente descritto.
2. Eseguire iniezioni usando un microscopio da dissezione. Per ogni iniezione intracameral, utilizzare 10 ⁶ cellule della milza di un volume di 0,005 ml e una siringa microlitro 0,25 ml con ago 33 G.
   NOTA: altre manipolazionidel modello può essere effettuata trattando gli animali con reagenti che agiscono sia come antagonisti o agonisti per determinare il ruolo che un determinato fattore può giocare dopo l'intervento chirurgico ortotopico allogenico corneale.

Risultati

Il modello murino di trapianto di cornea è stato utilizzato da oltre 20 anni con successo per caratterizzare i meccanismi di entrambi corneale rigetto del trapianto corneale ^19-23 e accettazione ^{13, 15,16,18, 24-27.} Questo modello è stato utilizzato per stabilire l'importanza di FasL nella cornea del trapianto di accettazione, in quanto gli animali che non hanno FasL non erano in grado di accettare trapianti corneali ^15. E 'stato anche utilizzato per dimostrare che la crescita ...

Discussione

Il modello murino di trapianto di cornea qui descritta consente al ricercatore di studiare rigetto corneale umano in un modello che è predittivo di quali fattori sono più associati sia con il rifiuto ^{15,17,18,20, 26-30} e ^21-25 accettazione di cornea trapianti. A differenza di trapianto di cornea umana, in cui i pazienti sono indicati sia per il trattamento steroideo topico o sistemico sia per trattare o prevenire il rigetto ^31, questo modello è in genere utilizzato per determinare que...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Surgical Microscope	Zeiss	Rebuilt
1 ml Syringe	BD	305122
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309602
Vannus Scissors	Stortz	E-3387
11-0 Sutures	Alcon	717939M
Trephine 2.0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1.5 mm	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Forceps	FST	11251-20
7-0 Sutures	Alcon	8065
2.5% Phenylephrine HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% Tropicamide	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton Syringe	Hamilton	7654-01
33 gauge needle	Hamilton	90033
Cell Strainer (100 μm nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometer	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154