쥐의 각막 이식 : 고체 장기 이식의 가장 일반적인 형태를 연구하기위한 모델

요약

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

초록

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

서문

각막 이식은 인간에서 수행 이식의 가장 성공적이고 일반적인 유형 중 하나입니다. 이 수술을 행하는 이유는 부상 ^한 감염성 질환, 또는 비 - 감염성 질환 ^각막이 다른 형태의 결과이다. 미국의 안구 은행 협회 숫자는 46,000 이상이 (: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html에서 웹 사이트 참조) 2011 년에 수행 된 것을 나타냅니다. 성공의 표시는 동종 각막 이식 1 년 고장율 10-15%과 성공이 70 % ^3-8 초과 5 년 범위 것입니다. 많은 연구가 도시 한 바와 같이, 각막 동종 이식의 성공은 직접 눈 면역 특권 사이트 것과 관련되어있다. 면역 특권 사이트와 각막 상태에 책임 요소는 suppres 각막 의해 생성 각막 모두 혈액 및 림프 혈관 부족, 항원 제시 세포의 상대적인 부재, 요소를 포함면역 이펙터 funtions에게 ^9-15이야, MHC의 낮은 발현은 ¹⁶ 항원 및 FasL의 ^{17 ~ 20의} 발현.

그러나 성공이 이식을 걸리기 이러한 요인에도 불구하고, 그들은 거절 ^3-7를 받아야 않습니다. 따라서,이 거절을 매개 이러한 메커니즘을 이해뿐만 아니라 거부를 방지하기 위해 다양한 치료법을 테스트하는 것은 매우 중요하다. 이를 위해, 우리는 여기에 통제 된 실험 환경에서 각막 이식을 연구하기 위해 20 년 이상 사용되었습니다 각막 이식의 쥐 모델을 설명합니다. 이식 응답은 궁극적가 이식 된 조직이 실패 또는 성공 여부를 확인할 수 콘서트에서 일하는 많은 다른 요소들을 포함하기 때문에, 어느 하나의 시험 관내 모델에서 이들 요소의 중요성을 이해하는 것은 불가능하다. 따라서, 그대로 동​​물을 사용하는 연구가 성공 또는 failu 중 하나에 중요한 요인이 무엇인지를 결정해야한다이식 조직의 재.

동물의 다른 종 각막 이식을 연구하는 데 사용되었지만, 다른 종을 사용하는 것에 비해, 뮤린 모델은 몇 가지 장점을 갖는다. 첫 번째는 특정 유전자를 발현 또는 기능 이식의 더 나은 연구 할 수있는 특정 면역 인자의 발현을 부족한 유전자를 대상으로 한 마우스의 여러 변종의 존재입니다. 또한, 동물의 많은 다른 종의 존재하지 않는 마우스에 대한 특정 많은 시약 (요인을 중화 재조합 요인과 항체 모두)이 있습니다. 때문에 이들 인자의 존재,이 모델은 급성 각막 동종 이식 반응 ^{15 17,18,20 -29} 관련된 관련 요소를 식별하는 데 광범위하게 사용되어왔다. 또한, 각막 이식과 관련된 많은 요인은 다른 조직 이식 기능적 것으로 알려져있다.

프로토콜

참고 :이 절차에 사용 된 모든 동물 비전 연구 협회와 안과 문 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한뿐만 아니라 세인트 루이스 대학의 동물 감독위원회에 의해 아래로 설정 한 지침에 따라 처리됩니다.
참고 : 모든 수술 장비 및 솔루션은 눈의 세균 감염을 제한하기 위해 수술 전에 소독한다. 그것은 동물이 과정에서 약간의 통증을 경험 수행하면서, 우리는 진통제를 사용하지 않는다는 것을 주목해야한다. 모든 진통제는 소염이고 각막 이식 염증 반응을 수반하기 때문에, 항염증제의 사용은 각막 이식 실패에 관여하는 요인이 무엇인지를 결정하는 능력을 손상 때문에 이것에 대한 이유이다.

1. 마취

1. 케타민 ((86)의 IP 주사하여 전신 마취 하 기증자와받는 사람 마우스를 놓습니다.98 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (xylazine) (13.04 ㎎ / ㎏).
2. 일반적으로 시간에 30 분 걸리는 절차 전반에 걸쳐 마취받는 사람 마우스를 유지합니다. 결과적으로, 지속적으로 의식을 회복의 징후가 마우스를 모니터링 할 수 있습니다.
3. 동물 건조를 방지하기 위해 마취 후에 수술을하지 않습니다 눈에 puralube 연고를 적용합니다.

2. 각막 이식술

1. 기증자의 각막 버튼을 얻었다.
   1. 동물이 완전히 마취되면, 1 % tropicamide와 2.5 % 페닐에 염산염의 눈에 몇 방울의 투여에 의한 적절한 산동을 얻을 수 있습니다.
   2. 수평 튼튼한 이동 지원에 배치 보드에 공여 동물의 머리를 놓습니다. 눈 전체 동작 걸쳐 수평 위치에 있도록 목 걸쳐 테이프의 스트립을 고정 헤드.
   3. 아웃, 선단 메틸 블루로 염색 하였다 2mm 직경 트레를 사용하여,중앙 각막 이식 사이트 라인.
   4. 날카로운 블레이드로, 각막을 침투 도너 내피 기본 렌즈의 손상의 가능성을 줄일를 깊게하는 전방 내로 주입 결과 Healon.
   5. vannas 가위와 기증자 이식을 절제하고 사용까지 행크스 '균형 염 용액을 포함하는 접시에 놓습니다.
   6. 공여자 이식편을 제거 한 후, CO ₂ 흡입 통해 도너 마우스를 안락사.
2. 이식 침대를 준비.
   1. 수신자 2.1.2 통해 2.1.1에 설명 된 것과 동일한 단계를 반복한다.
   2. 1.5 mm 직경 트레를 사용하여 수신자 그래프트 사이트를 개요.
   3. 날카로운 블레이드와, 각막을 침투 기본 렌즈에 손상의 가능성을 줄일를 심화하기 위해 전방에 결과 Healon를 주입.
   4. vannas 가위를 사용하여받는 사람의 설명 중심 각막 버튼을 제거하고 폐기합니다.
3. 봉합이식
   1. 받는 사람의 각막에 침대 이식을 통해 기증자의 각막을 놓습니다. 적절한 결과 Healon 렌즈와 직접 접촉에 의한 손상으로부터 기증자의 내피 세포를 보호하기 위해 기증자의 각막 아래에 있는지 확인합니다.
   2. 슈퍼 뾰족한 microforceps를 사용하여 한 묶어,받는 사람의 편에 전체 두께의 90 % 깊이와 기증자를 통해, 기증자 측에 11-0 나일론 봉합사의 첫 번째 바이트를 배치합니다.
   3. 각막 제자리에 고정되면, 각막 8~10 총 봉합사를 가지며 공여 각막 안전하게 줄 지어 수신자 각막 이식 침대에 부착되도록 midcardinal 단속 봉합을 수행한다.
4. 전방 심화
   1. 전방에 HBSS 또는 공기 방울을 주입하여 전방 깊어 부드럽게 셀룰로오스 스폰지로 누출 각막 이식의 무결성을 확인합니다.
      주 : 전방을 개질 할 수없는 경우 (c)의 높은 확률이 존재이식 된 각막의 미래 평가가 매우 어려운 것 또한 잠재적 기증자의 각막 내피 세포의 기능 장애 때문에 이식 실패로 이어질 것입니다 ataract.
5. 최종 평가
   1. 동공은 원형이며, 전방의 깊이가 정상이 있는지 결정하기 위해 눈을 관찰한다.
      참고 :이 조리개를 봉합 중에 손상되었음을 나타냅니다 따라서 이식은 기술적 인 문제로 간주됩니다 둥근 눈동자가 아닌 경우.
   2. 눈에 항생제 연고를 적용합니다. 옵션 : 7-0 실크 봉합사로 눈 뚜껑을 닫습니다.
   3. 그들이 완전히 깨어 후 개별적으로 수술 후 이틀 최소를 수용 할 때까지 쥐를 관찰한다.

3. 봉합 제거

1. 뚜껑 봉합사가 사용되는 이러한 경우에, 전술 한 바와 같이 마우스를 마취하고 48 시간에 뚜껑 봉합사를 제거.
2. 수술 후 7 일째에 쥐를 마취. sutur 제거ES 각막 이식을 확보. 봉합사를 제거하고, 동물이 완전히 깨어 나면, 케이지로 복귀.

4. 임상 평가

1. (전방에있는 혈액) 백내장 (렌즈의 흐림), 전방 출혈을 포함하는 절차 적 합병증의 지시 사항에 대해 눈, 적절한 깊이, 또는 각막의 중요한 불투명이 아닌 전방을 검사합니다. "손상"이러한 합병증을 보여 그 사람들을 고려하고 CO ₂ 흡입을 안락사.
   1. unanesthetized 쥐에 모든 검사를 수행합니다. 다른 한편으로는 눈에 더 잘 볼 수 있도록 눈을 proptose 할 수 있도록 한 손 따라서 마우스를 억제하여 마우스를 잡습니다. 관찰이 완료되면, 그 케이지에 동물을 반환합니다.
2. 치료 그룹에 익숙하지 않은 관찰자는 각막 이식의 흔적을 각막을 2 ~ 3 회 이식 평가했다거부 에피소드 또는 각막 이식 실패. 수술 현미경이 관찰을위한 수평 세극등 생체 현미경 하나를 사용하십시오.
   1. 다음과 같이 규모가 정의 5. 10-0의 규모를 사용하여 불투명도마다 각막을 평가 :
      1. 불투명의 흔적이없는 사람들 각막 0의 점수를 할당합니다.
      2. 최소한의 표면 불투명도를 보여 그 각막 1의 점수를 할당합니다.
      3. 온화하고 깊은 불투명도를 표시하지만 기본 동공과 홍채가 여전히 뚜렷한이다 각막 2의 점수를 할당합니다.
      4. 홍채는 동공 마진 제외 상세히 볼 수없는 특징 간질 불투명도를 표시 각막 3의 점수를 할당한다.
      5. 조밀 한 기질 불투명도를 표시하고 어떤 기본 구조를 볼 수 없습니다 경우 각막 4의 점수를 할당합니다.
      6. 완전히 가려 동공과 홍채와 완전한 불투명도 및 집중적 인 간질 부종을 표시 각막 5의 점수를 할당합니다.
   2. 또한, 혈관의 침윤 (혈관 신생)이를 위해 1 내지 8의 평가 척도를 이용하는 정도마다 각막 평가 4 동일한 사분면 이루어진으로 각막을 확인하고 이들 사분면 각각에서 혈관의 양을 결정 그 사분면의 광범위한 혈관에 대한 2 0 (선박)에서 그 의지의 범위를 점수. 최종 신생 혈관 점수를 계산하기 위해 각 사분면에서 개별 점수를 추가합니다.
   3. 그들은 오주 포인트 최대 시간 동안 두 개의 연속적인 관찰 3의 점수가있는 경우로 급성 거부 각막을 분류.
   4. 누구의 각막 오주에서 분명했다 쥐를 분류하지만받은 말기 각막 이식 거부 반응이있는 것으로,> 사십오일 연속 2 시점 3의 점수, 생착을 게시 시간에 혼탁을 개발한다. 이식편 생존을 분석하는 카플란 - 마이어 생존 곡선을 사용한다.

모델 5. 조작

에서 왼쪽 : 40px; ">

비장에서 단일 세포의 준비.

1. 하나의 세포를 준비하려면, 먼저 기증자 마우스를 안락사. 그런 다음, 비장을 제거합니다.
2. 셀 스트레이너에 비장을 배치하고는 3 ML의 주사기에서 주사기 플런저 방해.
3. 행크스 균형 소금 용액 10 mL의 세포에 resuspend을 씻으십시오.
4. 세포 현탁액 10 μl를 제거하고 0.4 % 트리 판의 10 μL에 파란색을 추가하고 혼합한다. 중앙 그리드의 세포를 혈구에 그를 추가하고 계산합니다. 튜브의 셀의 수는 세포 수 × ¹⁰⁴ × 2 (트립 판 블루 희석 계수) (10) (튜브의 부피) ×이다.

전방에 주입.

1. 전술 한 바와 같이 쥐를 마취.
2. 해부 현미경을 사용하여 주사를 수행합니다. 각각의 전방 내 주입의 경우, 10 ⁶ 0.005 ml의 볼륨에 비장 세포와 33 G 바늘 장착 된 0.25 ML의 마이크로 리터 주사기를 사용합니다.
   참고 : 다른 조작모델의 특정 요인 동소 각막 이식 수술 후 재생 될 수 역할을 결정하거나 길항제 또는 작용제로서 작용 시약으로 동물을 처리함으로써 수행 될 수있다.

결과

각막 이식의 쥐 모델을 성공적으로 각막 이식 거부 ^19-23 각막 이식 수용 ^{13, 15, 16, 18, ​​24 ~ 27} 두의 메커니즘을 특성화하기 위해 20 년 이상 사용되어왔다. 이 모델은 FasL의 결여 즉 동물에서 각막 이식에서 수용 FasL의 발현의 중요성을 설정하는 데 사용 된 각막 동종 이식 ^(15)을 받아 들일 수 없었다. 이는 또한 혈관 내피 성장 인자 수용체 1 모르 처리 크게 각막 이식 생존 <...

토론

여기에 설명 된 각막 이식의 쥐 모델 요인이 가장 모두 거부 ^{15,17,18,20, 26 ~ 30} 각막의 수용 ^21-25과 관련된 무엇을 예측하는 모델에서 각막 이식 거부 반응을 연구하기 위해 연구자 수 있습니다 동종 이식. 환자를 치료하거나 예방하거나 거부 ^(31)에 어느 국소 또는 전신적 스테로이드 치료를 부여하는 각막 이식, 달리이 모델은 일반적으로 치료의 부재에서 거부 동종 관련된 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Surgical Microscope	Zeiss	Rebuilt
1 ml Syringe	BD	305122
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309602
Vannus Scissors	Stortz	E-3387
11-0 Sutures	Alcon	717939M
Trephine 2.0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1.5 mm	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Forceps	FST	11251-20
7-0 Sutures	Alcon	8065
2.5% Phenylephrine HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% Tropicamide	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton Syringe	Hamilton	7654-01
33 gauge needle	Hamilton	90033
Cell Strainer (100 μm nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometer	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154