Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

Riepilogo

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Abstract

La sclerosi multipla è una malattia infiammatoria demielinizzante del sistema nervoso centrale caratterizzata dalla formazione di placche contenenti oligodendrociti perso, la mielina, gli assoni, e neuroni. Rimielinizzazione è un meccanismo di riparazione endogena quale nuova mielina è prodotta successivamente alla proliferazione, il reclutamento e la differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti in oligodendrociti-mielina, ed è necessario per proteggere gli assoni da ulteriori danni. Attualmente, tutti terapie per il trattamento della sclerosi multipla bersaglio componente immunitaria aberrante della malattia, che riducono recidive infiammatorie ma non impedisce la progressione verso irreversibile declino neurologico. E 'quindi indispensabile che le strategie-rimielinizzazione promuovere essere sviluppati che possono ritardare la progressione della malattia e forse invertire sintomi neurologici. Esistono diversi modelli animali di demielinizzazione, compresa l'encefalomielite autoimmune sperimentale e curprizone; Tuttavia, ci sono limitazioni nel loro utilizzo per lo studio rimielinizzazione. Un approccio più robusto è l'iniezione focale di tossine nel sistema nervoso centrale, compreso il lisolecitina detersivo nella materia bianca midollo spinale di roditori. In questo protocollo, abbiamo dimostrato che la procedura chirurgica coinvolti nell'iniettare lisolecitina nella sostanza bianca ventrale dei topi è veloce, conveniente, e non richiede materiali aggiuntivi rispetto a quelli disponibili in commercio. Questa procedura è importante non solo per studiare gli eventi normali coinvolti nel processo remyelination, ma anche come strumento di pre-clinico per lo screening candidati terapie-rimielinizzazione promozione.

Introduzione

La sclerosi multipla (SM) è una malattia demielinizzante cronica del sistema nervoso centrale (SNC), caratterizzata da infiltrazione di cellule immunitarie e placche contenenti perso mielina, oligodendrociti e neuroni, gli assoni. La maggior parte dei pazienti hanno un decorso della malattia consiste di ricadute infiammatorie accompagnati da una vasta gamma di sintomi neurologici, seguiti da periodi di remissione. Oltre la metà di questi pazienti eventualmente passare a una fase progressiva secondaria con ricadute evidenti ma continuo declino neurologico. Si ritiene che questo progressivo deterioramento è causa di danni assonale e perdite, contribuito in parte da demielinizzazione cronica. Strategie per ripristinare perso mielina sono quindi considerati un approccio terapeutico promettente per ritardare la progressione della malattia e forse invertire sintomi neurologici.

Rimielinizzazione è una risposta di riparazione endogena nel sistema nervoso centrale in cui le nuove guaine di mielina sono generate da cellule precursori degli oligodendrociti reclutate(OPC) che si differenziano in oligodendrociti-mielina. Rimielinizzazione è stato dimostrato in modelli animali di essere abbastanza robusto ^1-3, però, la sua efficacia diminuisce con ⁴ anni. Infatti, remyelination si verifica negli esseri umani, anche se è incompleta nella maggior parte dei pazienti con SM ^5. Tutti i farmaci attualmente disponibili per la SM si rivolge principalmente la componente immunitaria anomala della malattia e, mentre efficaci nel ridurre le ricadute, non marcatamente ritardare la progressione della malattia. La prossima generazione di strategie terapeutiche per la gestione della SM integrerà progressi nella immunomodulazione con la valorizzazione di rimielinizzazione endogena, al fine di evitare che sia ricadute e la progressione ^6.

Un metodo per studiare de- e remyelination nel SNC comporta l'iniezione diretta del lisofosfatidilcolina detergente (lisolecitina) nel midollo spinale sostanza bianca ^1,3,7. Questa procedura produce un demyelinat ben caratterizzatoing lesioni costituito principalmente da macrofagi / microglia infiltrazione e l'attivazione ^8,9, astrogliosi reattiva, perturbazione dell'omeostasi assonale / danno assonale, e OPC proliferazione e la migrazione ^10. La lesione evolve prevedibilmente nel corso del periodo di alcune settimane ed è finalmente in grado di completamente rimielinizzanti. Questo metodo è stato particolarmente utile per studiare la coreografia degli eventi coinvolti nella de- e rimielinizzazione. Inoltre, è stato adottato come strumento di test pre-clinica di terapie candidati per accelerare riparazione dopo un insulto demielinizzante.

Protocollo

NOTA: Gli animali utilizzati in questa procedura sono stati accuditi in conformità con il Consiglio canadese Animal Care (CCAC) le linee guida. Etica sono stati approvati dal Comitato dell'Università di Calgary Animal Care.

1. Preparare una siringa per iniettare

1. Sciogliere Lysolecithin a una soluzione all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH 7,4) e conservare a -20 ° C in piccole aliquote (75 microlitri). Scongelare una fiala di RT.
   NOTA: se lisolecitina è disciolto, sonicare il tubo in ultrasuoni (40 kHz) per circa 30 minuti per formare una soluzione uniforme.
2. Maneggiare il capillare di vetro pre-tirato con estrema cautela per evitare di danneggiare la punta delicata. Svitare il dado di una siringa da 10 microlitri iniezione e infilarlo sull'estremità piatta del capillare seguito da 2 ghiere, assicurando che le estremità di accoppiamento dei puntali allineano e il capillare è aderente nella boccola conica (figura 1). Sciacquare la siringa con isopropalcool ile e rimuovere il pistone. Una volta asciutto, avvitare il gruppo ago mano stretta sulla siringa iniezione.
3. Applicare l'ago hub metallo siringa di attivazione. Pierce un disco di gomma con l'ago e farlo scorrere fino alla base. Riempire la siringa di attivazione con lisolecitina. Deprimere delicatamente la siringa di attivazione fino a quando il liquido è visibile sulla punta dell'ago. Questo assicura bolle d'aria non saranno introdotti nella siringa iniezione.
4. Inserire l'ago hub metallo della siringa di attivazione nella siringa iniezione. Fare una tenuta ferma con il disco di gomma, lentamente deprimere la siringa adescamento fino a quando il capillare si riempie per la punta con la soluzione. Rimuovere accuratamente la siringa di attivazione premendo contemporaneamente per riempire il cilindro della siringa iniettare senza introdurre bolle d'aria. Inserire lo stantuffo nella siringa iniezione e garantire soluzione fluisce dalla punta del capillare come lo stantuffo viene premuto delicatamente.
   NOTA: Se le bolle d'aria sono visibili nel tappoIllary o iniettando siringa, la preparazione siringa deve essere ripetuta dall'inizio. Fluido continuo nell'apparato iniezione è fondamentale per garantire volumi di iniezione accurati.
5. Attaccare la siringa iniettare completato al braccio di un micromanipolatore stereotassica. Questo apparato completato sarà in grado di iniettare 15-20 animali prima di dover essere ricaricata.
6. Eliminare il lisolecitina rimanente dalla siringa di attivazione. Ritirare e deprimere alcool isopropilico più volte, e staccare l'ago hub di metallo. Attendere alcune ore per l'alcool isopropilico rimanga nella siringa priming evapori prima di riempire di nuovo.

2. Preparare animali per la procedura chirurgica

NOTA: Questa procedura è descritta per femmine C57BL / 6 topi, di età compresa tra 8-10 settimane.

1. Anestetizzare l'animale con una iniezione intraperitoneale di ketamina (200 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) o per la cura degli animali regolamenti istituzionali. Piano per ilanimale ad essere sotto anestesia per circa 1 ora se si utilizza l'anestesia iniettabile.
2. Prova che l'animale è profondamente anestetizzato con fermezza pizzicare il piede. Un animale adeguatamente anestetizzato non risponderà al pizzico.
3. Utilizzando Clippers, radere un cm ² zona 2-3 sul lato dorsale dell'animale, vicino alle orecchie. Fare attenzione a non danneggiare le orecchie.
4. Pulire la zona pulita con il 70% di etanolo applicato ad un tampone di garza. Assicurarsi che tutti i capelli tagliati è stato rimosso dalla zona. Disinfettare la zona con iodio.
5. Applicare vaselina per gli occhi contro l'essiccamento durante tutta la procedura.
6. Mantenere l'animale in una camera di recupero riscaldata fino al momento di iniziare la procedura.

3. Eseguire l'intervento chirurgico

NOTA: Assicurare un'adeguata tecnica asettica per tutte le fasi della procedura. Ciò include l'uso corretto dei guanti, retine per capelli, maschere e tende. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati prima di venire in Contact con l'animale.

1. Spostare l'animale ad un telaio stereotassico, lato dorsale up, elevata a metà sezione per asciugamani di carta piegati esagerare la curvatura della colonna vertebrale. Fissare le braccia e la coda con nastro adesivo chirurgico e fissare la testa con un morsetto dente. Barre stabilizzatrici orecchio non sono necessari per questa procedura.
2. Utilizzare un bisturi per fare un tre centimetri incisione mediana, iniziando appena sotto le orecchie e taglio in direzione caudale.
3. Individuare il divario tra le 2 grandi strutture adipose e utilizzare una pinza sottile in ogni mano per tirare questi pezzi. Stendere divaricatori per aprire il campo operatorio.
4. Sotto un microscopio operatorio, individuare il processo conseguenza di spicco della vertebra T2 (Nota: questa funzione è caratteristica del ceppo C57BL / 6 del mouse). Eseguire una dissezione smussa con forbici primavera chiusi attraverso la muscolatura sovrapposizione per visualizzare meglio T2. Utilizzando le pinze, sentire per le superfici dure di T3 e T4 per confermare il corretto posizione anatomica.
5. Utilizzando forbici primavera, tagli laterali poco profonde (2-3 mm di profondità) del tessuto connettivo tra T3 e T4. Grazie alla distanza naturale tra vertebre nella parte toracica superiore della colonna vertebrale del mouse, una laminectomia non è necessario rivelare il midollo spinale. Essere consapevoli che troppo profondo un taglio trafiggerà e danneggiare il cavo.
   NOTA: Una piccolo grado di sanguinamento è comune durante questa fase. In questo caso, tenere una lancia spugna nella zona fino a quando i sussidi sanguinamento (30-60 sec).
6. Visualizza il midollo spinale. Sarà coperto con uno spesso strato di dura visibile se questo strato meningea non è stato ancora tagliato, esponendo il cavo. Un vaso di sangue di primo piano corre caudale / rostrale attraverso la linea mediana approssimativa del midollo spinale.
   NOTA: Questo vascolare non deve essere utilizzato come punto di riferimento per la linea mediana. Invece, illuminazione adeguata dovrebbe rivelare i limiti della materia grigio-bianco che fiancheggiano colonna dorsale, e questi dovrebbero essere usati per stimare la linea mediana.
7. Se la durarimane intatto, fare graffi laterali dolci con un ago di metallo G 32 fino a quando non viene cancellato. L'obiettivo è quello di rimuovere la dura, mentre non tagliare le meningi sottostanti rimanenti, che non sono così spesse e più difficile da vedere.
   NOTA: Rilascio di liquido cerebrospinale indica una violazione del arachnoid e mentre questo può avvenire senza danni meccanici al tessuto, liquido cerebrospinale accumulato deve essere rimosso con una lancia spugna per visualizzare meglio la superficie del cavo.
8. Spostare la siringa per iniezione in posizione e abbassare lentamente fino alla punta del capillare appena tocca appena il midollo spinale immediatamente laterale di entrambi i lati della linea mediana. Bloccare il braccio in posizione.
9. Utilizzare le misure graduate del braccio stereotassica direzione Z per fare una misura della posizione della linea di base. Da questa lettura, sottrarre 1,3 millimetri. Con un movimento rapido e superficiale verso il basso per perforare il tessuto e abbassare accuratamente il capillare fino al raggiungimento della nuova misurazione. Opzionale: se lo si desidera,lesioni della colonna dorsale possono essere prodotti dallo stesso movimento foratura sulla linea mediana e una profondità di 0,3 mm (vedi la discussione per ulteriori informazioni).
   NOTA: Questi valori sono specifici per l'iniezione tra T3 e T4. Se optando per eseguire l'iniezione in qualsiasi altro luogo nel midollo spinale, questi valori devono essere derivati ​​da qualsiasi atlante del cervello del mouse disponibili.
10. Utilizzare il micromanipolatore per deprimere lisolecitina nella sostanza bianca del midollo spinale ventrale. Effettuare 1 rotazione del micromanipolatore ogni 5 secondi per 2 minuti, risultando in un volume finale di 0,5 ml. Lasciare il capillare sul posto per 2 minuti supplementari per impedire il riflusso di soluzione, e poi rimuovere con attenzione il capillare.
11. Legare un singolo sutura nel tessuto muscolare / adiposo sovrapponendo la colonna vertebrale. Utilizzare una sutura non interrotta per chiudere la pelle. Applicare più di iodio al sito di incisione.
12. Posto l'animale in una camera di recupero Scaldare fino recupera, per poi tornare alla sua gabbia. Applicare analgesici post-operativamente secondo le norme per la cura degli animali istituzionali. Ulteriori cure post-operatorie di solito non è necessaria in quanto gli animali sono completamente ambulatoriale e in grado di auto-alimentazione e il bere non appena il recupero dall'anestesia.
13. Ripetere la procedura per gli altri animali.
    NOTA: Con competenza, l'operazione può essere completato in 10-15 min per animale, in particolare con l'aiuto di una seconda persona legatura suture. Lo stesso capillare di vetro può essere utilizzato per circa 15-20 ambulatori prima della punta diventa smussata e deve essere sostituito. Ambulatori di controllo possono essere eseguite in modo identico come descritto, con una iniezione di PBS nel midollo spinale anziché lisolecitina. Si sconsiglia la pulizia dei capillari per un uso futuro.

4. Tissue Processing and Analysis

1. Sacrificio degli animali con una overdose intraperitoneale di ketamina (500 mg / kg) e xilazina (25 mg / kg) in punti di tempo desiderati. Le lesioni di solito si evolvono nel follmaniera causa: 1-3 giorni, demielinizzazione attiva; 3-7 giorni, OPC reclutamento; 7-10 giorni, la differenziazione degli oligodendrociti; 10-21 giorni, rimielinizzazione attiva ^2,10,11.
2. Per preparare il tessuto per l'esame istologico, prima eseguire una perfusione transcardial ¹² con 20 ml di RT PBS seguita da 20 ml ghiacciata 4% paraformaldeide in PBS. Per la preparazione di resina tessuto embedded per sezionamento semi o ultrasottili, vedere il punto 4.9.
3. Rimuovere il midollo spinale con le forbici osso curve per tagliare attraverso ogni vertebre partire dalla fine cervicale della colonna vertebrale e lavorando al livello toracica inferiore. Fissare i midolli spinali O / N a 4% paraformaldeide in PBS a 4 ° C. Passare i cavi al 30% di saccarosio in PBS a 4 ° C per almeno 72 ore.
4. Identificare il sito di iniezione come una anomalia sulla superficie dorsale del midollo spinale. Tagliare un pezzo 3 millimetri di tessuto (con il sito di iniezione al centro) e allineare i pezzi in cryomolds contenenti temperatura ottimale di taglio (OCT) compound. Sospendere parte inferiore delle cryomolds in una miscela raffreddata di 2-metilbutano e ghiaccio secco fino PTOM è completamente congelato. Conservare a -80 ° C fino al momento di sezione.
5. Sezione midollo spinale su un criostato ad una larghezza di 20 micron su vetrini da microscopio e lasciare asciugare O / N prima di riporre i vetrini a -20 ° C.
6. Rileva posizione della lesione e le dimensioni utilizzando un eriocromo cianinico macchia istologica della mielina ^13. Eseguire tutti i passaggi a RT. Diapositive asciugare per 30 min. Collocare i vetrini in agente per 1 min seguito da reidratazione in soluzioni graduate etanolo (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, acqua) compensazione per 1 min ciascuna.
   1. Collocare i vetrini in eriocromo soluzione Cyanine per 15 minuti, seguita da un 1 min di lavaggio con acqua. Differenziare in idrossido di ammonio 0,5% per 10 sec, seguito da un 1 min lavata con acqua. Disidratare in soluzioni di etanolo graduate (ordine inverso come descritto sopra) per 1 min ciascuna, coprioggetto con mezzo di montaggio, e l'immagine su un luminoso mi-campocroscope.
7. Utilizzare immunoistochimica per visualizzare assoni e mielina. Diapositive asciugare per 30 min. Disidratare con etanolo graduata (acqua, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) per 2 min a ciascuna RT, allora ordine inverso nuovo in acqua. Questo passaggio si traduce in una maggiore risoluzione dei singoli anelli mielina ^14.
   1. Bloccare interazioni anticorpo non-specifici utilizzando siero di capra 10% e lo 0,25% triton X-100 in PBS per 60 minuti a RT. Diluire gli anticorpi primari (topo anti-SMI312 1: 2.000, coniglio anti-MBP 1: 1.000) in PBS e incubare su vetrini O / N a 4 ° C.
   2. Lavare 5 volte per 5 min con PBS a RT. Diluire anticorpi secondari (Alexa 488 anti-coniglio 1: 500, Alexa 546 anti-topo 1: 500) in PBS e incubare su vetrini per 60 minuti a temperatura ambiente. Lavare 5 volte per 5 min con PBS a RT. Montare i vetrini con copri-oggetto usando gelvatol e immagine su un microscopio a fluorescenza.
8. Utilizzare immunoistochimica per visualizzare cellule della linea oligodendrociti. Seguire la procedura per step 4.7, omettendo la fase di disidratazione / reidratazione, e l'utilizzo di siero di cavallo del 10% invece del siero di capra. Utilizzare i seguenti diluizioni di anticorpi primari: capra anti-PDGFRα 1: 100, mouse anti-CC1 1: 200, coniglio anti-Olig2 1: 200. Utilizzare i seguenti diluizioni degli anticorpi secondari: Alexa 488 anti-capra 1: 500, Alexa 594 anti-topo 1: 500, Alexa 647 anti-coniglio 1: 500.
9. Per preparare il tessuto per sezionamento parzialmente o ultrasottile, prima eseguire una perfusione transcardial ¹² con 20 ml RT PBS seguiti da 20 ml ghiacciata 4% paraformaldeide / 1% glutaraldeide in PBS. Rimuovere midollo spinale come descritto al punto 4.3. Fix O / N a 4% paraformaldeide / 1% glutaraldeide in PBS a 4 ° C.
10. Identificare il sito di iniezione come descritto al punto 4.4. Tagliare un pezzo 1 millimetro di tessuto che contiene il sito di iniezione. Ulteriori 1 millimetro blocchi su entrambi i lati della lesione possono essere preparati e se desiderato.
11. In una cappa aspirante, aggiungere 10 volte il volume 1% tetrossido di osmio / ferrocianuro di potassio 1,5% per ogni blocco su ghiaccioper 60 min.
    NOTA: tetrossido di osmio è una sostanza altamente tossica e deve essere maneggiato con estrema cura. Tutti i materiali a contatto con tetrossido di osmio siano messi in olio di mais (due volte il volume come soluzione di osmio tetrossido) per la neutralizzazione.
12. Lavare cavi 3 volte con 0,2 M cacodilato per 10 minuti a RT, scartando in olio di mais. Disidratare con etanolo soluzioni graduate (acqua, 50%, 70%, 90%, 2 volte con 95%, 2 volte con 100%, 2 volte con ossido di propilene) per 10 minuti a RT.
13. Cavi Incorpora in resina come da istruzioni del produttore.
14. Tagliare i blocchi su un ultramicrotomo e montare le sezioni sul gocce d'acqua su vetrini da microscopio. Collocare i vetrini su una piastra calda (circa 50 ° C) fino a secco.
15. Visualizza mielina aggiungendo qualche goccia di 1% blu di toluidina soluzione di borace / 2% sui vetrini per 10-15 secondi a 50 ° C. Risciacquare con acqua, secchi, e coprioggetto con supporti di montaggio. Sezioni di immagine su un microscopio in campo chiaro.

Risultati

Iniezione focale Lysolecithin nella sostanza bianca ventrale produce una lesione demielinizzante discreta che è rilevabile su una distanza di circa 3 mm (figura 2). La colorazione immunoistochimica del nucleo lesione per mielina (MBP) e assoni (SMI312) mostra assoni che sono stati privati ​​di mielina a 7 giorni (figura 3). Per 14 giorni, molti assoni sono circondati da anelli MBP-positivi, il che suggerisce la presenza di rimielinizzazione. Colorazione per cellule della linea oligodendrociti (PDGFRα, Olig2, CC1), vi è un aumento significativo sia del numero totale di cellule a 14 giorni rispetto a 7 giorni, così come la distribuzione di oligodendrociti maturi rispetto alle OPC (Figura 4) . Coerentemente con questo risultato, sezioni semisottile colorate con blu di toluidina rivelano la presenza di guaine di mielina sottili a 14 giorni raramente rilevati a 7 giorni (Figura 5), indicando che questi sono i remyelinatednternodes.

La procedura è altamente riproducibile tra animali. Variation si verifica quando il respiro pesante altera la posizione fissa del capillare questo di solito non è un problema di adeguata sedazione. Danneggiamento assoni risulta minimo, tranne nel centro della lesione, che è stato descritto in quanto il primo utilizzo del modello ^1. Crediamo che questo sia lesioni meccaniche dal capillare di vetro, come è anche osservabile in PBS iniettato controlli. Tuttavia, la variabilità tende ad essere piccolo, e noi e altri che utilizzano una procedura simile hanno rilevato differenze tra le condizioni sperimentali con il minor numero di 4 animali per gruppo ^15.

Figura 1. Montaggio della siringa iniezione. (A) Il dado della siringa iniezione è avvitato t egli estremità piatta del capillare di vetro, seguito dal 2 ghiere tale che il loro accoppiamento termina interblocco. Una volta che il capillare viene saldamente aderente nella boccola conica, il complesso viene avvitato mano stretta sull'estremità della siringa iniezione. (B) pezzo centro di un disco di gomma con l'ago mozzo metallico attaccato alla siringa di attivazione e scorrere verso il basso per la base. (C) Per il prelevamento lisolecitina soluzione nella siringa adescamento. (D) prema delicatamente la siringa di attivazione fino alla prima goccia di lisolecitina è visibile sulla punta dell'ago. (E) Inserire la siringa di attivazione nella canna della iniezione siringa, facendo una guarnizione costante con il disco di gomma. Premere leggermente la soluzione fino a che corre alla fine del capillare. Sfilare delicatamente la siringa adescamento mantenendo la pressione sullo stantuffo per rimuovere l'ago hub metallo senza introdurre bolle d'aria nella siringa iniezione.caricare / 52679 / 52679fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Rappresentante lisolecitina lesione macchiato di eriocromo cianina. Sezioni seriali (distanziati di 400 micron a parte) di una caratteristica lesione lisolecitina a 14 giorni, colorati con eriocromo cianina di visualizzare mielina (blu). Si noti che demielinizzazione è limitata alla materia bianca ventrale e che la lesione si estende circa 3 mm nella rostrale / caudale. Bar Scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Gli assoni e mielina inil modello lisolecitina. (A) A farsa (PBS) iniettato nel midollo spinale a 7 ​​giorni Mostra assoni sani che sono circondati da anelli di mielina. (B) A lisolecitina lesione a 7 ​​giorni Mostra assoni denudato e mielina degradato. (C) dopo 14 giorni, una proporzione di assoni (esempi denotati con frecce bianche) sono associati con la ricomparsa di anelli mielina. Bar Scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. cellule Oligodendrocyte lignaggio nel modello lisolecitina. (A, C) A 7 giorni, vi è una maggiore rappresentazione PDGFRα + OPC (barre bianche) rispetto a CC1 oligodendrociti + (barre magenta); i numeri all'interno delle barre rappresentano percentuali. Olig2 stato sondato aconfermare colorazione di cellule lignaggio oligodendrociti. (B, C) ​​A 14 giorni, non vi è un aumento significativo del numero totale di cellule lineage oligodendrociti rispetto a 7 giorni (p <0,05, due code t-test, n = 4 per gruppo ). C'è anche un aumento significativo nella distribuzione di oligodendrociti alle OPC a 14 giorni rispetto a 7 giorni (p <0,0001, test esatto di Fisher). Bar Scala = 10 micron. Ogni campo viene catturato con un ingrandimento originale di 60X. I valori sono media ± SD. * Significa p <0.05. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. rimielinizzazione nel modello lisolecitina. (A) Un blu toluidina trasversale macchiato sezione della sostanza bianca ventrale semisottile in un healthy mouse mostra assoni su una vasta gamma di calibro di rispettivi spessori mielina. (B) A 7 giorni, una mancanza di guaine mieliniche si osserva adiacente ad un'area inalterata (in basso a destra). (C) A 14 giorni guaine mieliniche sottili ( esempi contrassegnati da frecce rosse) appaiono in tutta la lesione, indicativa di segmenti remyelinated. Bar Scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Un certo numero di modelli animali è stato sviluppato per studiare MS, più riconoscibile l'encefalomielite autoimmune (EAE) modello sperimentale. In EAE, roditori sono immunizzati contro un frammento di un peptide mielina e subiscono lo sviluppo della lesione infiammatoria che si manifesta in paralisi ascendente. Anche questo modello è stato utile per i test pre-clinici di farmaci immunomodulatori SM, non è l'ideale per studiare la rimielinizzazione per tre ragioni principali: in primo luogo, la posizione delle lesioni infiammatorie è un po 'casuale, e la localizzazione di lesioni in caso di trattamento di tessuto per semi o ultrasottili sezioni possono essere impegnativo. La seconda è che remyelination si verifica in un corso di tempo specifico, e l'età esatta di una singola lesione EAE non può essere conosciuto senza continuo non invasivo risonanza magnetica. La terza è che remyelination è un fenomeno naturale nei roditori, e la prova di remyelination seguente trattamento farmacologico in EAE non può essere un risultato primaria del farmaco, ma inSTEAD un fenomeno secondario di ridurre l'infiammazione.

Un altro metodo comune per produrre demielinizzazione è ottenuta introducendo il chelante cuprizone rame nella dieta. Ciò si traduce in diffusa demielinizzazione, soprattutto nel corpo calloso. Ci sono limitazioni nello studio del corpo calloso come sito di rimielinizzazione per i seguenti motivi: in primo luogo, i diametri e spessori (assoni quindi mielina) sono più piccoli rispetto ad altre regioni del SNC, e guaine quindi sottilmente remyelinated possono essere indistinguibili da quelli che non sono mai stati demyelinated. In secondo luogo, perché il corpo calloso del mouse corpus contiene> 70% assoni amieliniche ^16, può essere chiaro se un segmento remyelinated vale la riparazione della mielina danneggiata o de novo sintesi della mielina nel adulta, che si verifica normalmente ^17.

E 'nostra convinzione che il miglior modello per studiare la rimielinizzazione è l'iniezione diretta di tossine, sia lisolecitina, ethidbromuro di ium, o altri, nei peduncoli cerebrali caudali ¹⁸ o la sostanza bianca del midollo spinale. La prima posizione è raggiunta solo precisa iniezione stereotassica 3-dimensioni, ed è limitata a grandi roditori (ratti) a causa delle piccole dimensioni dei peduncoli cerebellari. Ciò esclude la vasta risorsa di topi transgenici in studio de- e rimielinizzazione. Il midollo spinale, tuttavia, contiene molte grandi tratti di sostanza bianca che sono facilmente accessibili chirurgicamente. Gli spazi tra vertebre nel segmento toracico rostrale permette di esposizione del midollo spinale, senza la necessità di una laminectomia, che è un passo necessario in procedure chirurgiche toraciche caudale. Un vantaggio del destinatario principale la sostanza bianca ventrale è che gli assoni sono uniformemente più grande della sostanza bianca dorsale, rendendo la quantificazione di rimielinizzazione un compito simile alle sfide connesse con il corpo calloso meno ambigua. Inoltre, la sostanza bianca ventrale costituisce una t molto più grandeArget zona per iniettare; diverse centinaia di micron lateralmente nella regione dorsale sarebbero collocare il capillare all'esterno della colonna, mentre la stessa deviazione ventrale sarebbe ancora produrre una lesione demielinizzante prominente. Alcuni protocolli iniettare lisolecitina sia nel dorsali e ventrali colonne dello stesso animale ^19. Ciò può aumentare sia la probabilità di corretto posizionamento capillare e il numero di lesioni quantificabili in meno animali. Mentre i dati attuali sono presentati 8-10 settimane di età degli animali al momento del funzionamento, abbiamo anche avuto successo con la stessa procedura su 8-10 mesi di età i topi, in cui la rimielinizzazione è descritto come notevolmente più lento ^4.

La quantificazione di rimielinizzazione non è un'impresa banale. Un dogma centrale postula che segmenti remyelinated sono più brevi di lunghezza e più sottile, in media, rispetto ai loro omologhi sani, e quindi i calcoli g-ratio (diametro assone diviso per assone + diametro mielina) di sezione trasversale semi osezioni r ultrasottili sono diventati procedura standard. Tuttavia, è noto che i segmenti remyelinated addensare nel tempo ² e un recente studio utilizzando un reporter transgenico di oligodendrociti rimielinizzanti suggerisce che molti internodi fine diventano indistinguibili dal controllo ^20. Quantificare il numero di oligodendrociti maturi all'interno della lesione è un modo indiretto per misurare la riparazione, come oligodendrociti sono in grado di effettuare un ampio numero di internodi, e una percentuale significativa di-remyelination seconda del modello utilizzato, può verificarsi da cellule di Schwann ^3. Naturalmente, come rimielinizzazione è stata collegata al ripristino della conduzione saltatory ^21, la metrica finale di riparazione sarebbe il recupero funzionale dei deficit neurologici. Mentre rimielinizzazione è stata collegata al recupero della funzione in alcune specie ^22,23, non è diventata una procedura standard in studi Lysolecithin murini. Ciò è probabilmente dovuto ad una mancanza di osservati palesedeficit in grado di lesioni o dorsali o ventrali, rispetto ai modelli demielinizzazione più robusti, come EAE e anche cuprizone. Noi crediamo che i deficit funzionali derivanti da Lysolecithin iniezione, e il successivo recupero di rimielinizzazione, saranno solo osservabile utilizzando test sensibili di finissima funzionamento sensomotoria.

Una ricerca PubMed di "rimielinizzazione" a fianco uno dei modelli animali di cui sopra, anche se un approccio metodologico brusco, mostra un minor numero di colpi di ricerca per Lysolecithin (109) rispetto al EAE (188) e cuprizone (197). Se la nostra tesi che Lysolecithin demielinizzazione è l'approccio superiore per studiare rimielinizzazione, perché è il meno discusso? Forse un timore per utilizzare questo metodo deriva da una credenza di difficoltà tecnica nello svolgimento dell'operazione chirurgica. In realtà, questa procedura è veloce e conveniente, e non è più difficile di dissezione dei tessuti di routine, che richiedono materiali che sono tutti commercialmente disponibili. La nostra speranza è che questo protocollo si rivela utile per coloro che desiderano aggiungere questo potente modello per il loro repertorio per studiare il campo interessante e in espansione di riparazione della mielina.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
spring scissors	Fine Science Tools	15004-08
forceps	Fine Science Tools	11254-20
retractor	Fine Science Tools	17003-03
clippers	Philips	QG3330
heating recovery chamber	Peco Services	V1200
surgical tape	3M	1527-1
scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
scalpel blade	Feather	No. 15
sponge spear	Beaver Visitec	581089
5-0 Vicryl sutures	Ethicon	J511G
curved ToughCut spring scissors	Fine Science Tools	15123-12
32 gauge metal needle	BD	305106
needle holders	Fine Science Tools	12002-14
angled forceps	Fine Science Tools	11251-35
cotton tipped applicator	Puritan	806-WC
gauze pads	Safe Cross First Aid	3763
10 μL syringe	Hamilton	7635-01	make sure to purchase the microliter, not gastight syringe
compression fitting	Hamilton	55750-01	contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μL syringe is a tighter fit
priming kit	Hamilton	PRMKIT	contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs
pre-pulled glass capillaries	WPI	TIP10TW1 (pack of 10)	contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1)
stereotactic frame	David Kopf instruments	Model 900
Ultrasonic cleaner	Fisher Scientific	FS-20
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound	VWR	25608-930
Tissue-Tek intermediate cryomold	VWR	25608-924
cryostat	Leica	CM1900
microscope slides	VWR	48311-703
bright field microscope	Olympus	BX51
ultramicrotome	Leica EM UC7	EM UC7
Lysophosphatidylchoine	Sigma	L1381
2-methylbutane	Sigma	M32631
Triton x-100	Sigma	X-100
goat serum	Sigma	G9023
Mouse anti-SMI312 antibody	Covance	SMI-312R	1:2000 dilution
Rabbit anti-MBP antibody	Abcam	AB40390	1:1000 dilution
Goat anti-PDGFRα antibody	R&D Systems	AF1062	1:100 dilution
Rabbit anti-Olig2 antibody	Millipore	AB9610	1:200 dilution
Mouse anti-CC1 antibody	Calbiochem	OP80	1:200 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Life technologies	A-11008	1:500 dilution
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG	Life technologies	A-11003	1:500 dilution
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG	Jackson Immuno	705-546-147	1:500 dilution
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG	Jackson Immuno	715-586-151	1:500 dilution
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG	Jackson Immuno	711-606-152	1:500 dilution
PBS	Oxoid	BR0014
isopropyl alcohol	Sigma	109827
ketamine	CDMV
xylazine	CDMV
iodine	West Penetone	2021
Vaseline petroleum jelly	VWR	CA05971
paraformaldehyde	Sigma	P6148
sucrose	Sigma	S5016
Eriochrome Cyanine R	Sigma	32752
sulfuric acid	Sigma	320501
iron(III) chloride	Sigma	157740
ammonium hydroxide	Sigma	320145
Acrytol	Leica Biosystems	3801700
Citrisolv	Fisher Scientific	22-143-975
horse serum	Sigma	H0146
glutaraldehyde	Electron Micrscopy Sciences	16220
osmum tetroxide	Electron Micrscopy Sciences	19150	highly toxic
potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate	Sigma	P3289
corn oil	Sigma	C8267
polyvinyl alcohol	Sigma	P8136
glycerol	Sigma	G9012
cacodylic acid	Electron Micrscopy Sciences	12300
propylene oxide	Electron Micrscopy Sciences	20401
EMBED kit	Electron Micrscopy Sciences	14120
Toluidine Blue O	Sigma	T3260
Sodium tetraborate decahydrate	Sigma	S9640
Recipes
Eriochrome cyanine solution
Ingredient			Amount to add
Eriochrome Cyanine R			0.8 g
sulfuric acid			400 mL 0.5%
iron(III)chloride			20 mL 10%
water			80 mL
*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year.
Gelvatol
Ingredient			Amount to add
PBS			140 mL
polyvinyl alcohol			20 g
glycerol			40 g
*mix well, place at  37 °C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes