Etichettatura delle cellule e Targeting con superparamagnetico ossido di ferro nanoparticelle

Riepilogo

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

Abstract

Somministrazione mirata di cellule e agenti terapeutici a favore di un'ampia gamma di applicazioni biomediche concentrando l'effetto terapeutico al sito bersaglio, riducendo al minimo gli effetti deleteri a siti fuori bersaglio. Il targeting cellule magnetica è una tecnica di consegna efficiente, sicuro, e diretto. Nanoparticelle di ossido di ferro (superparamagnetic spion) sono biodegradabili, biocompatibili, e possono essere endocitosi in cellule di renderli sensibili ai campi magnetici. Il processo di sintesi prevede la creazione di magnetite (Fe ₃ O ₄₎ nanoparticelle seguita da emulsificazione ad alta velocità per formare una poli (lattico-co-glicolico) (PLGA) rivestimento. Le SPIONs PLGA-magnetite sono circa 120 nm di diametro compreso nucleo diametro magnetite circa 10 nm. Quando posto in terreno di coltura, SPIONs sono naturalmente endocitosi dalle cellule e memorizzati come piccoli cluster all'interno di endosomi citoplasmatici. Queste particelle impartiscono massa magnetica sufficiente per le celluleper consentire il targeting entro campi magnetici. Numerosi separazione delle cellule e applicazioni destinate sono attivati ​​per rendere vari tipi di cellule sensibili ai campi magnetici. SPIONs hanno una varietà di altre applicazioni biomediche e compreso l'uso come agente di contrasto imaging medico, farmaco o gene somministrazione mirata, saggi diagnostici, e la generazione di ipertermia locale per la terapia tumorale o saldatura del tessuto.

Introduzione

Targeted delivery and capture of cells to specific sites within the body is desirable for a variety of biomedical applications. Delivery of neural stem cells to the brain by MRI-guided focused ultrasound has been proposed as a possible treatment option for neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and stroke¹. Mesenchymal stem cells are being studied for their ability to deliver anti-cancer drugs to tumors due to their natural tumor-tropic properties^2,3. Cardiac stem cells have been delivered to the heart as a possible treatment for myocardial infarction^4,5. Vascular stents have been developed with CD34 antibodies to capture circulating progenitor cells⁶. While promising, these cell targeting approaches present drawbacks including lack of cell specificity, inconsistent cell retention, and off-target cell delivery.

The overall goal of the current method is to enable magnetically directed targeting of cells for a variety of cell delivery and sorting applications. Magnetic targeting allows for controlled delivery of specific cells to a specific target site with minimal off-target effects⁷. The magnetic fields can be generated by implanted or external devices to safely direct the movement of magnetically-labeled cells within the body⁸. Numerous research efforts have focused on magnetically directed targeting of stem cells to injured tissues such as the heart^9-14, retina¹⁵, lung¹⁶, skin¹⁷, spinal cord^18,19, bone²⁰, liver²¹, and muscle^22,23 in order to improve regeneration outcomes.

Magnetic targeting of cells has also been studied extensively as a means to endothelialize implantable cardiovascular devices. A uniform and complete endothelium provides a barrier between the device and circulating blood elements to mitigate thrombosis and inflammation. Endothelial cells can be delivered to the device either prior to implantation or via the vascular system following implantation. In both cases, magnetic fields are used to capture cells to the surface of the device and retain the cells when subjected to the shear stress generated by circulating blood. Magnetic vascular stents^24-27 and vascular grafts²⁸ have both been fabricated and tested for this purpose.

Magnetic cell targeting requires a strategy for labeling cells with magnetic carrier particles. These particles can be bound to the surface of cells via antibodies or ligand/receptor pairs or they can be endocytosed into the cells. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and readily endocytosed by a variety of cell types²⁹. These particles effectively render a cell responsive to magnetic fields and are naturally degraded over time. SPIONs provide a straightforward and safe means of magnetically labeling cells in culture for a variety of magnetic targeting and sorting applications. A method for synthesizing SPIONs with a magnetite (Fe₃O₄) core and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) shell is provided. In addition, a method for labeling cells in culture with SPIONs is provided.

Protocollo

1. Sintesi di magnetite Gel

1. Lavare la vetreria con acido cloridrico concentrato seguita da acqua deionizzata seguita da alcool etilico. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente in un forno di essiccazione.
   ATTENZIONE! acido cloridrico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante; alcol etilico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale.
2. Utilizzare una bottiglia di Drechsel di de-gas 500 ml di H _{2 O} deionizzata facendo gorgogliare delicatamente _N 2 gas per 30 minuti.
3. Set-up l'apparato di sintesi di magnetite all'interno di una cappa.
   1. Posizionare un pallone ml a tre colli a fondo tondo da 500 all'interno di un riscaldatore cuffia riscaldante e fissare il collo centro utilizzando una pinza e stand.
   2. Installare un setto di gomma in uno dei colli laterali del pallone a fondo rotondo e condensatore a riflusso con un setto di gomma nel collo lato rimanente. Continuamente scorrere acqua fredda attraverso il refrigerante a ricadere.
   3. Puntura °e setto di gomma del pallone a fondo tondo con un ago collegato ad una linea del gas N ₂ e forare il setto di gomma del condensatore a riflusso con un ago collegato ad una linea di gas in esecuzione ad un gorgogliatore (cioè, matraccio con acqua) per visualizzare efflusso del gas.
   4. Installare una pala lama nel centro collo del pallone a fondo tondo tramite un adattatore pagaia. Attaccare albero della pala lama a un agitatore montato su un supporto.
4. Spurgare il pallone a fondo tondo con N ₂ gas e lasciare _N 2 gas che scorre ad una velocità bassa ma rilevabile.
5. Rimuovere il condensatore a riflusso del pallone a fondo tondo ed aggiungere 1.000 g di ferro (III) cloruro, 0,6125 g di ferro (II) cloruro tetraidrato, e 50 ml di degassati H ₂ O.
   ATTENZIONE! di ferro (III) cloruro e ferro (II) cloruro tetraidrato sono nocivi - indossare dispositivi di protezione individuale.
6. Sostituire il condensatore a ricadere e mescolare a 1.000 giri, mentre il riscaldamento a 50° C. Mescolando in queste condizioni produce 10 nm nanoparticelle di magnetite diameter.
7. Una volta a 50 ° C, aggiungere 10 ml di soluzione di idrossido di ammonio 28% iniettando attraverso il tappo di gomma nel pallone a fondo tondo pur agitazione.
   ATTENZIONE! idrossido di ammonio è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale.
   NOTA: La soluzione di idrossido di ammonio è utilizzato per precipitare magnetite e la soluzione dovrebbe diventare nero.
8. Rimuovere il setto di gomma e N ₂ linea gas dal pallone a fondo tondo e calore a 90 ° C per evaporare l'ammoniaca gassosa mentre ancora agitazione.
   NOTA: È facoltativa per mantenere il flusso di N ₂ nel pallone a fondo tondo perforando setto di gomma della condensatore a riflusso, tuttavia, l'ossidazione di magnetite per maghemite è trascurabile durante questa fase.
9. Una volta a 90 ° C, aggiungere 1 ml di acido oleico nel pallone a fondo tondo pur agitazione. L'acido oleico è utilizzato per rivestire la magnetite nananoparticelle di per formare gel magnetite.
   ATTENZIONE! acido oleico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale.
10. Sostituire il setto di gomma e N ₂ linea del gas sul pallone a fondo tondo e rimuovere il refrigerante a ricadere.
11. Spegnere il fuoco e mescolate a 500 rpm per 2 ore.
12. Rimuovere il pallone a fondo tondo dal riscaldatore cuffia riscaldante e decantare il liquido in eccesso mentre usando un magnete forte tenuto contro il fondo del pallone di trattenere il gel magnetite.
    ATTENZIONE! gestire il forte magnete con estrema cura per evitare danni o lesioni.
13. Lasciare che il gel di magnetite asciugare O / N (facoltativo).

2. Purificazione di magnetite Gel

1. Aggiungere 40 ml di esano nel pallone a fondo tondo di sciogliere il gel magnetite
   ATTENZIONE! esano è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante.
2. Utilizzare un imbuto separatore con 40 ml di de-gasati H _{2 O} per rimuovere residui di H _{2 O} from la soluzione magnetite.
   1. Versare lentamente la soluzione di magnetite sul H _{2 O} nel imbuto separatore e miscelare delicatamente il liquido in due fasi per 5 minuti.
   2. Scolare fuori e scartare la frazione acquoso inferiore.
   3. Aggiungere lentamente 40 ml di degassati H ₂ O a imbuto separatore tale che si deposita sotto la soluzione magnetite e miscelare delicatamente e scaricare come prima.
   4. Ripetere per lavare per la terza volta.
3. Trasferire la soluzione di magnetite di una beuta, aggiungere un paio di spatole per un valore di solfato di sodio anidro e agitare per rimuovere ogni residuo H _{2 O} residua dalla soluzione di magnetite.
4. Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro magnetite 1 micron in un imbuto filtro per rimuovere il solfato di sodio e residua H _{2 O.}
   NOTA: è consigliabile farsi accompagnare vuoto.
5. Trasferire la soluzione magnetite ad un pallone di evaporazione 50 ml e utilizzare un evaporatore rotante per evaporare l'esano per2 h con le seguenti condizioni: velocità di rotazione moderate, vuoto applicato, evaporando pallone in un bagno a 50 ° C di acqua, e 24 ° C l'acqua che circola attraverso il condensatore.
   NOTA: In alternativa, conservare il gel di magnetite prima del rivestimento con PLGA.

3. Rivestimento di magnetite di nanoparticelle con PLGA Shell

1. Sciogliere 3,60 g di PLGA (75/25 blend) in 240 ml di acetato di etile per creare un (m / v) di 1,5%. ATTENZIONE: acetato di etile è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante.
2. Sciogliere 25.00 g di Pluronic F-127 in 500 ml di degassati H ₂ O con un agitatore magnetico per creare un (m / v) 5,0%.
   NOTA: Pluronic F-127 è un copolimero a blocchi anfifilo non ionico che agisce come un tensioattivo biocompatibile. Aiuta a stabilizzare l'emulsione olio-in-acqua nel passo 3.3.2.
3. Utilizzando un microspatula, raccogliere il gel di magnetite in sei 0,040 g aliquote all'interno fiale di vetro ponderati. Perform il seguente processo di rivestimento e lavaggio per ciascuna aliquota.
   NOTA: Le aliquote sono necessari per garantire una gestione efficiente e decantazione magnetico, che consentirà di massimizzare purezza e resa, riducendo al minimo la degradazione prima di liofilizzazione al punto 4.
   1. Aggiungere a 0,040 g di gel un'aliquota magnetite e 40 ml della soluzione di PLGA in un beaker di plastica e sonicare in ultrasuoni per 10 minuti.
   2. Aggiungere 80 ml della soluzione Pluronic nel becher di plastica ed emulsionare immediatamente con un miscelatore da laboratorio al valore massimo per 7 minuti per formare il rivestimento PLGA sulle nanoparticelle di magnetite come una emulsione olio-in-acqua.
   3. Diluire immediatamente la soluzione Spion in 1 L di H ₂ O deionizzata e ultrasuoni per 1 h in una cappa per evaporare l'acetato di etile.
   4. Posizionare un forte magnete accanto alla soluzione Spion e mescolare delicatamente per raccogliere SPIONs brunastre al magnete.
      NOTA: potrebbe essere necessario mescolare ad intermittenza per diverse ores prima che la soluzione diventa biancastra indicando che la maggior parte dei SPIONs sono stati raccolti.
   5. Decantare la soluzione acquosa, pur mantenendo le SPIONs nel bicchiere con il magnete.
   6. Lavare i SPIONs tre volte di seguito.
      1. Sospendere le SPIONs in 1 L di deionizzata H _{2 O.}
      2. Sonicare la soluzione Spion per 20 minuti.
      3. Posizionare un forte magnete accanto alla soluzione Spion e mescolare delicatamente per raccogliere SPIONs brunastre al magnete. Potrebbe essere necessario agitare intermittenza per diverse ore prima la soluzione diventa chiara indicando che la maggior parte dei SPIONs sono stati raccolti.
      4. Decantare la soluzione acquosa, pur mantenendo le SPIONs nel bicchiere con il magnete.
4. Raccogliere le SPIONs sintetizzati da ciascuna delle sei aliquote gel magnetite in una singola fiala di vetro ponderata in sospensione acquosa. Opzionalmente decantare l'acqua in eccesso magneticamente, se necessario.

4. Fermo-Essiccazione di SPIONs

1. Congelare la soluzione spion.
2. Liofilizzare la soluzione Spion O / N in un liofilizzatore.
3. Pesare i SPIONs liofilizzati. SPIONs liofilizzati possono essere conservati a -20 ° C fino al momento per l'etichettatura delle cellule.
   NOTA: Conservare a -20 ° C riduce drammaticamente cinetica di degradazione e aumenta la durata di conservazione.

5. Etichettatura di Celle con SPIONs

1. Sospendere una aliquota di SPIONs in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 40 mg / ml e con ultrasuoni per 30 minuti.
2. Aggiungere la soluzione in un pallone Spion quasi confluenti di cellule ad una concentrazione di 5 microlitri / ml di mezzo di coltura cellulare. Garantire una distribuzione uniforme agitandola lentamente il pallone.
3. Incubare le cellule per 16 ore a 37 ° C.
4. Aspirare delicatamente terreno di coltura e lavare le cellule due volte con PBS.
5. Raccogliere le cellule magneticamente marcate e utilizzare per gli esperimenti.
6. Soluzione spion non utilizzata può essere conservato a 4 ° C e dovrebbe essere noicato nel giro di pochi mesi. Con ultrasuoni per 30 minuti prima di ogni utilizzo.

Risultati

Nanoparticelle di magnetite sono circa 10 nm di diametro a seguito di agitazione una soluzione acquosa di ferro (III) cloruro e ferro (II) cloruro tetraidrato a 50 ° C e 1.000 rpm (Figura 1). Questi risultati dimostrano riuscita sintesi di nanoparticelle di magnetite. È importante verificare la dimensione e la forma delle nanoparticelle di magnetite prelevati da un piccolo campione di batch quando si tenta la sintesi per la prima volta. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è il metodo preferi...

Discussione

Come con qualsiasi protocollo di sintesi di nanoparticelle, la purezza dei reagenti chimici è fondamentale per ottenere SPIONs alta qualità che avranno effetti citotossici minimi. È quindi importante per l'acquisto reagenti molto puri compreso l'acido oleico (≥99%), ferro (II) tetraidrato Cloruro (≥99.99%), ferro (III) cloruro (≥99.99%), acetato di etile (grado HPLC, ≥99.9% ), esano (grado HPLC, ≥97.0%), idrossido di ammonio (≥99.99%) e solfato di sodio (≥99.0%). È di particolare importanza per...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis	Sigma-Aldrich	338818-100ML	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Dreschel bottle, 500 ml	Ace Glass	5516-16
Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9%	Sigma-Aldrich	650528-1L	Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint	Sigma-Aldrich	Z515558	For use with rotoevaporator
Filter paper, 3 cm dia, grade 1	Fisher	09-805P	For use with glass filter funnel
Glass beakers, 1 L	Fisher	FB-101-1000	For washing SPIONs
Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL	Fisher	K954100-0344
Glass vial caps	Fisher	03-391-46	For use with glass vials
Glass vials, 2 ml	Fisher	03-391-44	For collecting magnetite gel & SPIONs
Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC)	Sigma-Aldrich	34859-1L	Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758	Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood
Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis	Sigma-Aldrich	380024-5G	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis	Sigma-Aldrich	451649-1G	Harmful reagent - wear personal protective equipment
Isomantle heater, 500 mL	Voight Global	EM0500/CEX1
Laboratory mixer	Silverson	L5M-A
Lyophilizer	Labconco	7670520
Microspatulas	Fisher	21-401-25A	For transfering magnetite gel
NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in	Amazing Magnets	C1000H-M	Very strong magnet, handle with care
Oleic acid, ≥99% (GC)	Sigma-Aldrich	O1008-5G	Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment
Overhead stirrer	IKA	2572201
Overhead stirrer clamp	IKA	2664000	For use with overhead stirrer
Overhead stirrer H-stand	IKA	1412000	For use with overhead stirrer
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023
Plastic beakers, 250 ml	Fisher	02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend)	Purac	PDLG 7502	PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer
Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	P2443-250G
PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia	SciQuip	SP4018
PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle	Monmouth Scientific	PTFE Vessel Adaptor A480	For use with PTFE expandable blade paddle
Recirculating chiller	Clarkson	696613	For use with rotoevaporator
Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm	Ace Glass	5997-133
Rotoevaporator	Clarkson	216949
Rubber septa, fits 24/40	Ace Glass	9096-56
Separatory funnel with stopper, 250 ml	Fisher	10-438E
Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular	Sigma-Aldrich	239313-500G
Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml	Ace Glass	6948-16
Ultrasonic cleaner perforated pan	Fisher	15-335-20A	For use with ultrasonic cleaner
Ultrasonic cleaner, 2.8 L	Fisher	15-335-20
Vacuum controller	Clarkson	216639	For use with rotoevaporator (optional)
Vacuum pump	Clarkson	219959	For use with rotoevaporator