Alternando microgel ibrida Gelatina di campo magnetico-Responsive per Controlled Drug uscita

Riepilogo

Vi presentiamo un metodo facile per fabbricare una piattaforma di rilascio del farmaco a base di gelatina biodegradabili che è magneto-termico sensibile. Ciò è stato ottenuto incorporando nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche e poli (N-isopropylacrylamide- co -acrylamide) all'interno di una gelatina sferica micro-rete reticolato da genipina, in combinazione con un sistema di applicazione di campo magnetico alternato.

Abstract

Magneticamente-responsive / biomateriali micro-ingegneria nano che consentono a un strettamente controllato, on-demand somministrazione di farmaci sono stati sviluppati nuovi tipi di dispositivi morbide intelligenti per applicazioni biomediche. Sebbene un certo numero di sistemi di rilascio di farmaci magneticamente rispondenti hanno dimostrato efficacies attraverso sia la prova in vitro di studi concettuali o in applicazioni preclinici in vivo, il loro uso in ambito clinico è ancora limitato dalla loro biocompatibilità e biodegradabilità insufficiente. Inoltre, molte delle piattaforme esistenti si basano su tecniche sofisticate per loro invenzioni. Abbiamo recentemente dimostrato la fabbricazione di biodegradabili, microgel termo-reattivo a base di gelatina intrappolando fisicamente poli (N-isopropylacrylamide- co -acrylamide) catene come componente minore all'interno di una rete di gelatina tridimensionale. In questo studio, presentiamo un metodo facile per fabbricare una piattaforma di rilascio del farmaco biodegradabile che consente a un magneto-thermally innescato rilascio del farmaco. Ciò è stato ottenuto incorporando nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico e polimeri termo-reattivo in microgel colloidali a base di gelatina, in combinazione con un sistema di applicazione di campo magnetico alternato.

Introduzione

Gli stimoli-reattivi sistemi di drug delivery che consentono una consegna di droga strettamente controllato in risposta a stimoli sia endogeni o esogeni (ad es., Temperatura o pH) sono stati ampiamente studiati come nuovi tipi di dispositivi intelligenti morbide per la consegna della droga. Idrogel MicroScale sono stati ampiamente utilizzati come piattaforma di consegna della droga, nel senso che conferiscono profili di rilascio di droga controllabili e sostenibili, nonché chimiche sintonizzabile e le proprietà meccaniche ^1-3. In particolare, i microgel colloidali presentano molti vantaggi come veicolo di somministrazione di farmaci per la loro rapida risposta a stimoli esterni e adatto iniettabilità al tessuto locale in una maniera minimamente invasiva ^4. Il poli (N-isopropilacrilammide) (pNIPAM) o suoi copolimeri sono state ampiamente adottate nella sintesi microgel termo-responsive mediante innesto pNIPAM con / polimeri biocompatibili biodegradabili compresi gelatina, chitosano, acido alginato, o acido ialuronico ^5,6, In cui una caratteristica transizione di fase pNIPAM alla sua temperatura critica più bassa soluzione (LCST) può essere utilizzato come un trigger di rilascio del farmaco ^7. Abbiamo recentemente dimostrato una fabbricazione di biodegradabile, Microgel termo-sensibile di gelatina a base incorporando poli (N-isopropylacrylamide- co -acrylamide) [p (NIPAM- co -AAm)] catene come un componente minore all'interno di reti di gelatina tridimensionali ^8. Il / p (NIPAM- co -AAm) microgel gelatina esibito una deswelling sintonizzabile all'aumento di temperatura, che positivamente correlata al rilascio di albumina sierica bovina (BSA).

Nel corso degli ultimi anni, ci sono stati aumentando gli sforzi per sviluppare una piattaforma di consegna della droga magneticamente sensibile che può innescare il rilascio di farmaco in un ^9,10 di moda on-demand. Il principio di base per la sintesi della piattaforma di drug delivery magneticamente sensibile utilizza la caratteristica di nanoparticelle superparamagnetiche (MNPs) per generare calore quando ricevono una alta frequenza campo magnetico alternato (AMF), che innesca un rilascio del farmaco sensibile alla temperatura. Questo promettente per future applicazioni cliniche in che questo sistema può indirizzare in profondità nel tessuto, permette un non-invasivo e telecomandata rilascio del farmaco e può essere combinato con il trattamento di ipertermia e risonanza magnetica sistema di imaging ^10-12. Tali piattaforme includono: (1) le particelle MNPs / pNIPAM ibrido MicroGEL ^13-15 e (2) ponteggi idrogel macroscopici che incorporano immobilizzato MNPs ^16-18. Le piattaforme MicroGel pNIPAM basate dimostrato una transizione risposta finemente accordabile fase del volume agli stimoli magnetotermici. Tuttavia, ancora si basano su tecniche complesse e sofisticate nella fabbricazione e l'uso di polimeri pNIPAM ad alto contenuto può essere potenzialmente citotossici per le cellule ^19, che possono limitare le loro applicazioni in vivo. I ponteggi macroscopiche esibiscono un parentely lenta risposta a stimoli esterni e richiedono un trapianto chirurgico invasivo rispetto a microgel colloidali.

L'emulsione acqua-in-olio è stato il metodo standard per la produzione di submillimetrica o gel di dimensioni micrometriche particelle ^20. All'interfaccia acqua-olio dell'emulsione, Microgel particelle costituisce una forma sferica dovuta alla minimizzazione dell'energia di superficie della gocciolina di acqua sotto la forza di taglio meccanica. Questo metodo permette la produzione di una grande quantità di goccioline acquose gel sferiche in una semplice procedura di fabbricazione ed è stato adottato con successo per la fabbricazione microgel a base di gelatina per applicazioni drug delivery ^21-23.

Qui, vi presentiamo un metodo facile per sintetizzare un magnetothermally reattivo microgel a base di gelatina per l'applicazione somministrazione di farmaci utilizzando il metodo di emulsione acqua in olio. Questo è stato ottenuto incorporando fisicamente MNPs ossido di ferro e p (NIPAM- co -AAm) catene come componente minore all'interno di una rete di gelatina microscala sferica che è covalentemente reticolata da un genipina reticolante di derivazione naturale, in combinazione con un alta frequenza alternata magnetico sistema di applicazione di campo (AMF).

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Protocollo

Nota: Il processo generale di fabbricazione magnetici microgel gelatina campo-reattivo è illustrato nella Figura 1A.

1. Preparazione soluzioni e sospensioni

1. Preparare una genipina reticolante (1% w / v) soluzione sciogliendo 20 mg di genipina in 2 ml di tampone fosfato salino (PBS 1x; pH 7,4). Vortex la soluzione e mettere in un ⁵⁰ ° C bagnomaria per 2 ore per sciogliere completamente la soluzione.
2. Preparare una soluzione di tensioattivo sciogliendo 20 mg di poli (glicole etilenico) -poly (glicole propilenico) -poly (glicole etilenico) (M _w = 2.900 Da, denominato L64) in 200 ml di PBS per essere alla concentrazione di 100 ppm.
3. Preparare un 15% (w / v) soluzione di gelatina sciogliendo 64,5 mg di gelatina in 0,43 ml di PBS. Vortex la soluzione e posizionarlo su bagnomaria ^a 37 ° C fino a raggiungere una fase sol, dove la soluzione diventa fluidico. Poi, vortice la soluzione di gelatina 2 - 3 volte a garantire esimoe l'omogeneità del campione.
4. Preparazione di p (NIPAM- co -AAm) / soluzione MNPs con un modello di droga (BSA):
   1. Disperse 10,75 mg di idrofila MNPs in 0,43 ml di PBS e quindi sciogliere 12,9 mg di p (NIPAM- co -AAm) nella sospensione MNP per rendere la concentrazione del 3% (w / v). L'aumento della concentrazione di p (NIPAM- co -AAm) può essere utilizzato per ottenere un aumento comportamento deswelling di microgel.
   2. Utilizzare Texas-Red coniugato albumina sierica bovina (TR-BSA; M _w ~ 66 kDa) come modello di droga. Sciogliere 0,5 mg di TR-BSA nella miscela di p (NIPAM- co -AAm) / MNPs.
5. Preparare miscele di gelatina / p (NIPAM- co -AAm) / / soluzione BSA MNPs (0,86 ml) aggiungendo miscela di p (NIPAM- co -AAm) / MNPs (0,43 ml) nella soluzione di gelatina (0,43 ml) e poi accuratamente vortice loro di fare una miscela omogenea. Così, le concentrazioni di polimeri e MNP diventano metà delle concentrazioni iniziali della miscela finale.

2. emulsione

1. Versare 15 ml di olio di silicone [polidimetilsilossano (viscosità 350 cSt)] in un becher pulito e sterile.
2. Aggiungere immediatamente le miscele acquose pre-preparati di gelatina / p (NIPAM- co -AAm) / / soluzione BSA MNPs (0,86 ml) nel olio di silicone ed emulsionare la miscela acquosa nella fase oleosa mescolando con una barra di agitazione magnetica a 900 rpm ^a 30 ° C per 30 min.

3. gelificazione e trasferimento di micro-gocce di una soluzione acquosa

1. Trasferire l'emulsione (~ 16 ml) dal bicchiere in una provetta da 50 ml.
2. Raffreddare la provetta per 10 min a 4 ° C per gelificazione dei micro-goccioline di olio.
3. Riempire il tubo con la soluzione preparata L64 ^(a 4 ° C) fino a 50 ml e agitare vigorosamente la provetta. Può essere possibile che una porzione di L64 tensioattivi sarebbe nei microgel.
4. Centrifugare la provetta per 20 min a 2300 xga 4 ^{° C.}
5. Regularly controllare la presenza del pellet di particelle di gel sul lato del tubo. Se le particelle non si vedono, centrifugare per altri 20 minuti alla stessa velocità e la temperatura. Avanti a rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet formata sulla parete interna del tubo.
6. Ripetere i punti (3,3) a (3,5) ancora una volta. Ogni volta, trasferire il campione in una nuova provetta per evitare l'inclusione di eventuali goccioline di olio in sospensione Microgel. Dopo questo passo, assicurano che i tensioattivi o goccioline di olio non sono presenti nella sospensione del campione. Tuttavia, le fasi di separazione ripetute possono portare alla perdita di materiali iniziali.

4. covalente reticolazione del microgel

1. Aggiungere 2 ml di soluzione genipina (preparata nella sezione 1) al pellet di particelle di gel e mescolare bene nel vortex la soluzione.
2. Trasferire rapidamente il tubo della sospensione a bagnomaria a ²³ ° C per iniziare una reazione di reticolazione covalente durante una des(es., 5 - 120 min) tempo di reticolazione ired.
3. Dopo la reticolazione, rimuovere immediatamente eventuali reticolanti eccessivi scartando la soluzione genipina, risospendere le microgel in PBS, e centrifugazione del tubo per 20 minuti a 2300 xg (4 ^{° C).} Se necessario, cautamente si rompono formata pellet con un puntale. Questa fase di lavaggio può essere ripetuto fino a 3 volte se il genipina è ancora presente nella soluzione.
4. Eliminare il supernatante e risospendere le microgel in PBS ad una densità desiderata (ad es., 5 × 10 ⁶ microgel / ml) contando il numero con un emocitometro.
5. Per osservazioni microscopiche, caricare la sospensione Microgel nello spazio tra un vetrino e coprioggetto e sigillare il confine del vetrino con resina epossidica.

5. Applicazione di campo magnetico alternato per innescare Drug uscita

1. Posizionare il tubo con concentrazione desiderata di microgel in mezzi acquosi inla camera di bobine magnetiche. Se necessario, inserire una sonda di temperatura in fibra ottica nel tubo per monitorare il cambiamento della temperatura del supporto durante l'applicazione del AMF.
2. Applicare alta frequenza (> 100 kHz) AMF ad una intensità di campo definito (> 5 kA / m) e per una durata specificata. A seguito dell'applicazione del AMF, centrifugare la provetta per 20 minuti a 2.273 xg (4 ^{° C)} e raccogliere il surnatante per quantificare la quantità di TR-BSA rilasciato dalla microgel ai media circostanti con spettrofotometria. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per Texas Red sono 584 nm e 612 nm, rispettivamente.

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Risultati

Quando il protocollo è eseguita correttamente, i microgel fabbricati devono mostrare una morfologia sferica ben caratterizzato e disperdibilità colloidale con diametri nel campo tra 5 micron a 20 micron (Figura 1B e C). Sia MNPs fluorescenti o BSA fluorescente può essere utilizzata per confermare se MNPs o droghe (BSA in questo studio) sono correttamente incapsulati all'interno del Microgel (Figura 1D). I microgel prefabbricati possono essere stab...

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Discussione

La tecnologia qui descritta illustra un prototipo sull'uso di ibridi nanoparticelle Microgel per magneto-termico innescata rilascio del farmaco. Questo è stato ottenuto intrappolando fisicamente catene MNPs e P (NIPAM- co -AAm) all'interno di una rete di microscala gelatina tridimensionale reticolato per genipina. La piattaforma di campo-responsive magnetico era sufficiente a generare calore all'interno del Microgel in risposta ad una AMF applicata remoto, che a sua volta innescato il rilascio di u...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin	Sigma-Aldrich, MO, USA	G2500	Gelatin type A, porcine skin
poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)	Sigma-Aldrich, MO, USA	738727	MW = 20,000, LCST = 34 - 38 °C
Silicone oil	Sigma-Aldrich, MO, USA	378372	Viscosity 350 cSt
Pluoronic L64	Sigma-Aldrich, MO, USA	435449	poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol)
genipin	TimTec LLC, DE, USA	ST080860	MW = 226.23
Magnetic nanoparticles (MNPs)	Micromod Inc, Germany	79-00-102	nanomag-D-spio, 100 nm
TR-BSA	Life Technologies, NY USA	A23017	Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate