Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery

Riepilogo

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Abstract

Epiteliale di transizione mesenchimale (EMT) descrive il processo dell'epitelio transdifferentiating in mesenchima. EMT è un processo fondamentale durante lo sviluppo embrionale, che comunemente si verifica nel glioblastoma, la più frequente tumore maligno al cervello. EMT è stato osservato anche in più carcinomi di fuori del cervello, tra cui il cancro al seno, il cancro del polmone, cancro del colon, cancro gastrico. EMT è legata in posizione centrale per malignità, promuovendo la migrazione, l'invasione e la formazione di metastasi. I meccanismi di EMT induzione non sono pienamente compresi. Qui si descrive un sistema in vitro per l'isolamento standardizzato di cellule corticali neurali staminali (NSC) e la successiva EMT-induzione. Questo sistema fornisce la flessibilità necessaria per utilizzare sia singole cellule o espianto. In questo sistema, ratto o topo embrionali NSC proencefalo sono coltivate in un mezzo definito, privo di siero e enzimi. Le NSC espresso Olig2 e Sox10, due fattori di trascrizione osservata in oligodendroccellule precursori yte (OPC). Utilizzando questo sistema, le interazioni tra FGF-, BMP- e TGFβ di segnalazione che coinvolge Zeb1, Zeb2, e Twist2 sono stati osservati in cui TGFβ-attivazione significativamente migliorata la migrazione delle cellule, suggerendo un sinergico / TGFβ-interazione BMP-. I risultati indicano una rete di FGF-, BMP- e TGFβ-segnalazione di essere coinvolti in induzione e mantenimento EMT. Questo sistema modello è rilevante per indagare EMT in vitro. E 'conveniente e mostra elevata riproducibilità. Permette anche per il confronto delle mescole diverse rispetto alle loro risposte migrazione (misurazione quantitativa di distanza), e high-throughput screening di composti di inibire o migliorare EMT (misurazione qualitativa). Il modello è quindi adatto per testare le librerie di droga per le sostanze che interessano EMT.

Introduzione

Durante diversi stadi di sviluppo embrionale, le cellule epiteliali perdono la loro forte aderenza tra loro (ad esempio, giunzioni strette) e acquisiscono un fenotipo migratorio in un processo chiamato la transizione epitelio mesenchimale (EMT) ^1. EMT è necessaria per la formazione di tipi cellulari aggiuntivi, come le cellule della cresta neurale mesenchimali, una popolazione che segrega dal neuroepitelio ^2. EMT non è essenziale solo durante le fasi embrionali, ma richiesto anche nelle fasi successive della vita adulta a mantenere processi fisiologici nell'organismo adulto, come ad esempio la guarigione della ferita ³ e del sistema nervoso centrale di rigenerazione (SNC) in lesioni demielinizzanti ^4.

Tumori epiteliali sono noti per riattivare EMT come un passo di iniziazione per la migrazione, invasione e metastasi, in ultima analisi, che porta alla progressione del cancro ^1,3. EMT è infatti legata in posizione centrale ad una forte migrazione ^1,3. I passi cellulari di conditioning, avviando, in fase e il mantenimento di EMT non sono pienamente compresi e hanno bisogno di ulteriori indagini.

Qui, viene presentato un standardizzato in vitro sistema modello EMT sulla base di NSC, con fattori di crescita definiti e media (senza siero e senza l'utilizzo di enzimi). Questo sistema modello è rilevante per gli scienziati che lavorano su EMT. Le famiglie di proteine ​​Lumaca, Zeb e Twist hanno dimostrato di essere fondamentale per EMT, sia in fase di sviluppo e di malattia ^1. La lumaca, Zeb e Twist famiglie sono anche coinvolti nel sistema presentato. Il sistema è basato su una specifica regione del proencefalo che normalmente non subisce EMT fornire un vantaggio particolare per lo studio di eventi iniziali durante EMT induzione.

Il sistema modello potrebbe potenzialmente essere applicato a studiare EMT in epiteli all'esterno del SNC, poiché induttori EMT chiave, come la chiocciola, Zeb e proteine ​​torsione, si riscontrano anche durante EMT in sistemi tessuto fuori del SNC. Questo modello sistema permette l'isolamento standardizzato di NSC dalla corteccia in via di sviluppo per studiare le caratteristiche di cellule staminali in generale e, in particolare, EMT. Utilizzando questo sistema, abbiamo isolato le cellule staminali neurali, EMT indotta e studiato la successiva migrazione sotto l'effetto di FGF2 e BMP4. Abbiamo osservato che interagisce FGF- e BMP di segnalazione con TGFβ di segnalazione per promuovere la migrazione delle cellule, convalidando così il modello di sistema.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali hanno seguito la 'Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio "(pubblicazione NIH, 8 ^° edizione, 2011) e sono stati approvati dal Comitato per il benessere degli animali di Basilea (Linee direttive per la cura e l'uso di animali). Con queste linee guida il protocollo animale è considerato di "gravità grado più basso degli animali".

1. Preparazione del mezzo Expansion

Nota: Il lavoro in condizioni asettiche come standard per coltura di tessuti.

1. Dai due provette da 15 ml, e aggiungere 5 ml di DMEM / F12 senza L-glutammina (1: 1) da un flacone 500 ml medio in ciascuna delle due provette da 15 ml. Per il primo tubo da 15 ml, aggiungere 50 mg umano apo-transferrina, 50 ml di putrescina 1 m stock (0,1 mm concentrazione finale) e 30 ml di selenio di sodio 500 mM magazzino (concentrazione finale 30 Nm).
   1. Filtrare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron nel flacone DMEM / F12 originale.
2. Per il secondo tubo 15 ml, aggiungere 12,5 mg di insulina. Aggiungere6 - 9 gocce di 1 M NaOH. Vortex per sciogliere completamente l'insulina. Filtrare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron nel flacone DMEM / F12 originale.
   Nota: NaOH è tossico e corrosivo. Utilizzare guanti di protezione, cappotto, e occhiali di protezione.
3. Aggiungere 5 ml di penicillina (10.000 unità / ml) / streptomicina (10.000 mg / ml) / amfotericina B (25 mg / ml) al / F12 bottiglia DMEM.
4. Aggiungere 5 ml di 200 mm L-glutammina magazzino appena scongelati o oligopeptidi contenenti glutammina (200 mm L-alanil-L-glutammina dipeptide) per il medio / F12 bottiglia DMEM.
5. Agitare bene. Preparare 50 ml aliquote.
   Nota: media espansione può essere conservato per almeno 2 settimane a 4 ° C. tubi aliquotati mostra meno variazioni di pH rispetto alla media conservato in bottiglie da 500 ml.

2. Preparazione di Passaging Media

1. Per 1 L Ca ^{2 +} - e Mg ^{2 +} -free HBSS media, aggiungere 990,85 mg di glucosio (5 mm concentrazione finale) e 840,10 mg NaHCO ₃ (10 mM concentrazione finale). Regolare il pH a 7,3 con HCl (1 m stock). Filtro sterilizzare con 0,2 micron filtro e fare 50 ml aliquote.
   Nota: media Passaging può essere conservato per almeno 4 settimane a 4 ° C.

3. Preparazione di fattori di crescita

1. Preparare sterile 1x PBS con 1% BSA (PBS-BSA) da solo o con acido cloridrico (HCl) a 4 mM (PBS-BSA-HCl).
   Attenzione: HCl è corrosivo e tossico e richiede speciali misure di sicurezza (cappotti, occhiali, guanti, cappuccio).
2. Sciogliere 10 mg / ml umana ricombinante Fibroblast Growth Factor 2 (rhFGF2) in PBS-BSA (10 ng / concentrazione finale ml), 10 mg / ml ricombinante proteina morfogenetica umana 4 (rhBMP4) in PBS-BSA (10 ng / ml finale concentrazione), e 20 mg Factor / ml ricombinante umano di crescita trasformante ß 1 (rhTGFβ1) in PBS-BSA-HCl (40 ng / ml concentrazione finale).
   1. Non filtrare sterilizzare. Preparare aliquote.
      Nota: crescita aliquote fattore può essere conservato a-20 ° C per almeno 2 anni.

4. Rivestimento di colture cellulari Piatti

1. Sciogliere 1.875 mg Poli-L-ornitina (OLP) in 500 ml di acqua distillata H ₂ O per preparare un PLO magazzino 250X. Filtro sterilizzare usando un filtro a siringa da 0,2 micron e fare 2 ml.
   Nota: Queste aliquote possono essere conservati a -20 ° C per almeno 2 anni.
2. Sciogliere 1 mg fibronectina bovina in 1 ml sterile distillata H ₂ O per preparare 1,000x fibronectina magazzino. Non vortice in quanto ciò potrebbe coagulare la proteina appiccicosa. Agitare delicatamente a mano per 10 min.
   1. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione occasionale. Verificare la completa dissoluzione. Riscaldare la soluzione a meno di 37 ° C per la dissoluzione completa della fibronectina. Non filtrare-sterilizzare.
      Nota: La soluzione può essere conservato a 4 ° C per 6 mesi.
3. Usare piatti al plasma pre-trattati con plastica di coltura cellulare (100 mm o altre misure, come richiesto perl'esperimento). Per valutare la migrazione, utilizzare 35 mm piatti con griglia di 500 micron. Incubare piatti notte con 2 ml 1x PLO per 12 ore a 37 ° C in CO ₂ coltura tissutale incubatore 5%. Lavare due volte con 2 ml di PBS 1X.
4. Aggiungere 2 ml 1x fibronectina (/ ml concentrazione finale 1 mg) e incubare piatti per un minimo di 12 ore a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%. Rimuovere fibronectina poco prima placcatura le cellule.
   Nota: i piatti fibronectina rivestite possono essere conservati per almeno 2 settimane a 37 ° C.

5. standardizzata dissezione e preparazione del subventricolare zona corticale (SVZ)

1. Ottenere ratto giorno embrionale 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) e E13.5 il mouse (C57BL / 6) embrioni di temporizzato-accoppiamento. Mate animali dalle 18:00 alle 08:00 del mattino successivo. Mezzogiorno dopo il giorno di accoppiamento è considerato E0.5.
2. Anestetizzare l'animale in stato di gravidanza con il 5% isoflurano e il flusso di ossigeno 0,8 l / min. Controllare la risposta per compressione zampa con diss taglienteforcipe ezione. Decapitare l'animale. Evitare di CO ₂ asfissia come CO ₂ colpisce staminali recupero delle cellule.
3. Recupero di embrioni da taglio cesareo.
   1. Mettere animale in posizione supina e disinfettare pelliccia con il 70% di etanolo. Utilizzare pinze chirurgiche e forbici per rendere a forma di V incisione cutanea di circa 8 cm nel basso addome sopra l'utero. Incidere solo la pelle con pelliccia, mantenendo intatte le pareti muscolari.
   2. Utilizzare pinze freschi e forbici per incidere i muscoli e la parete muscolare addominale per entrare peritoneo.
   3. Identificare l'utero nel peritoneo posteriore inferiore. Rimuovere l'utero con netta separazione dai tessuti circostanti.
   4. Lavare l'utero con embrioni con sterili 1x PBS e posto in 1x PBS ghiacciato.
   5. Usare le forbici a punta fine per aprire le pareti uterine a rilasciare embrioni da embrioni al microscopio dissezione (ingrandimento 3x, Figura 1B). Utilizzare un paio di pinze per rimuovere gli scafi embrionali ( Figura 1B). Mantenere gli embrioni in media espansione sul ghiaccio.
   6. Verificare la corretta fase di sviluppo per l'Atlante della Sviluppo Rat Sistema Nervoso ^5. La dimensione embrione corretta è mostrata in Figura 1B.
   7. Verificare la corretta età ulteriormente la presenza di iniziare la formazione di cifre nella zampa anteriore del ratto (FL), come illustrato in Figura 1A.
      Nota: L'arto posteriore (HL) non ha ancora mostrare separazione cifre (Figura 1B).
4. Per la dissezione, trasferire gli embrioni ai piatti non rivestiti di Petri riempite con ghiaccio-freddo 1x PBS. Eseguire la dissezione al microscopio dissezione stereo (3X a 20X di ingrandimento) utilizzando una pinza sottile autoclave.
   Nota: Le piastre Petri impediscono fissaggio del tessuto alla superficie piatto come può accadere con piatti al plasma rivestite di coltura cellulare. aghi filo di tungsteno affilati o simili sono anche utili per alcune fasi di dissezione.
5. Togliere la pelle della testa e il cranio a partire dalla intersection del telencefalo sviluppo (TEL) e diencefalo (DI) (Figura 1B) tirando contemporaneamente anteriormente e posteriormente con due pinze per accedere al tubo neurale sviluppo (Figura 1C).
6. Identificare il mesencefalo-rombencefalo-confine (MHB, nero freccia testa nella figura 1B-D), che separa il mesencefalo (MES) dal rhombencephalon. Tagliare il rhombencephalon appena pari o inferiore al MHB (Figura 1D, freccia triangolare).
   Nota: Lo spazio sottocutaneo supplementare alla MHB facilita la rimozione della pelle senza danneggiare il tubo neurale.
7. Recidere il collegamento tra il telencefalo / diencefalo alla base del cranio con scheletro facciale (Figura 1E). Ciò si traduce in un blocco contenente telencefalo, diencefalo e mesencefalo (Tel-DI-MES) (figure 1F-H).
8. Trasferire il blocco TEL-DI-MES in media espansione sul ghiaccio. Keep it completely coperto di media espansione in un piatto non rivestito di Petri. Tenere il blocco al mesencefalo con un paio di pinze per evitare di toccare il telencefalo che contiene la SVZ corticale con NSC.
9. Ripetere i passaggi 5,5-5,8 con tutti gli embrioni (Figura 1F-H).
10. Trasferire una TEL-di-MES blocco nella fresca ghiacciata PBS 1x. Tagliare lungo la linea tratteggiata nel mesencefalo anteriore (Figura 1F-H), separando mesencefalo dal diencefalo, come mostrato nella Figura 1I.
11. Separare il DI dalla TEL tagliando lungo le linee tratteggiate in Figura 1F. Vedere telencefalo isolato nella figura 1J.
12. Dividere i due emisferi telencefalici, tagliando lungo la linea tratteggiata in figura 1J. Ciò comporta due emisferi separati, come illustrato nella figura 1K.
    Nota: L'emisfero sinistro è ingrandito in Figura 1L.
13. Identificare la banda medialeeminenze lionic (MGE, figura 2a; *) e eminenze gangliari laterali (LGE, figura 2a; +) visibile attraverso il futuro Forame interventriculare.
    1. Utilizzando pinze o aghi, sezionare lungo una linea retta nel punto di intersezione tra la MGE e LGE e la corteccia anteriore (ant-CTX, figura 2B). Tagliare una linea retta attraverso la corteccia, ippocampo (anca) e plesso coroideo (CP). Questo separa la corteccia anteriore compreso il bulbo olfattivo (ob) dalle eminenze gangliari (GE, Figure 2B, C).
14. Tagliare una seconda retta all'intersezione della caudale eminenza gangliare (CGE, Figura 2C, D) e la corteccia posteriore (Figura 2C), nuovo taglio attraverso la corteccia, ippocampo e del plesso coroide.
15. Appiattire il telencefalo. Rimuovere completamente il polo posteriore e il bulbo olfattivo (Figura 2D). Identificarel'orlo corticale che contiene l'ippocampo e il plesso coroide (Figura 2C), come definito in precedenza ^6,7.
    Nota: L'ippocampo ha un neuroepitelio più sottile della corteccia. Il CP contiene vasi rossi.
    1. Separare l'orlo corticale dalla corteccia, lasciando la dimensione della corteccia identica alla dimensione delle eminenze gangliari (Figura 2D). Ciò si traduce in un blocco della corteccia (tessuto bersaglio) e eminenze gangliari (GE, Figura 2D).
16. Vibrazione blocco cortex-GE con il ventricolo laterale (interno) alla superficie del disco.
    Nota: La superficie esterna del emisfero affrontare sperimentatore (figura 2E). Sulla superficie esterna sono le meningi vasi contenenti sangue (Figura 2E).
    1. Pin il GE alla superficie piatto con la mano sinistra e sbucciare le meningi con un paio di pinze nella mano destra (dominante) (Figura 2F ).
       Nota: Questo è il passo tecnicamente più impegnativa perché le meningi aderiscono fortemente alla corteccia. La separazione delle meningi dalla corteccia è facilitato dal taglio di una linea completamente diritta (non frastagliate) in passi 5.13.1 e 5.14.
17. Ripetere i passaggi 5,12-5,16 per l'altro emisfero e tutti gli embrioni. Tagliare la corteccia lungo la LGE in una distanza di metà del diametro principale del LGE (figura 2G, 2H). La corteccia sezionato estende su una superficie di 1,2 mm x 2,4 millimetri (figura 2H) e comprende il / strato germinale SVZ con le NSC.

6. Preparazione delle Culture Explant

1. Tagliare la corteccia in espianti di meno di 400 micron di diametro (Figura 2I). Utilizzare una griglia micron 400 (figura supplementare 1) posizionato al di sotto della dissezione Petri di rinvio (figura 2H e 2I). Trasferire tutti espianti in un piatto fresco di Petri con ghiaccio-comedia espansione ld.
2. Rimuovere la fibronectina da un piatto di coltura di tessuti (passo 4.4). Lasciare asciugare. Aggiungere 1 ml di terreno di espansione fredda al centro della piastra da 35 mm dimensione griglia da 10 mm x 10 mm (figura 3). Lasciar formare una goccia sferica (figura 3).
3. Inserire fino a 8 espianti al centro della goccia. Gli espianti devono trovarsi in posizione sulla griglia di partenza con la distanza di almeno 3 mm tra di loro per l'analisi della migrazione (vedere la sezione 8).
4. Incubare il piatto per circa 1 ora in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 21% O _2, 5% CO ₂₎ di attacco degli espianti. Lasciare le espianti di stabilirsi e di allegare alla superficie fibronectina rivestite. Non agitare il piatto, dato che gli espianti possono staccare e spostare fuori dal centro della griglia ottimale.
5. Dopo 1 ora di incubazione (37 ° C, 21% O _2, 5% CO _2), riempire il piatto per un volume totale di 2 ml di mezzo di espansione più la crescita fattori o sostanze di interesse per testare e incubare.
   Nota: Né la digestione enzimatica, né siero o centrifugazione sono necessari per la preparazione espianto. Questo è ottimale per l'integrità delle cellule.

7. Preparazione del NSC Cultura Single Cell

1. Warm up espansione e medie passaging a 37 ° C.
2. Trasferire i pezzi corteccia sezionati (dal punto 5.17) in un tubo da 15 ml con il mezzo di espansione fredda (tubo A). Centrifugare i pezzi corteccia per 5 min a 1200 x g. Aspirare il surnatante. Aggiungere media espansione pre-riscaldato a 200 microlitri per risospendere i pezzi di corteccia.
3. Aggiungere 700 ml di media passaging pre-riscaldato per il tubo da 15 ml con una punta P 1.000 (tubo A). Risospendere delicatamente il pellet. Posizionare la punta sul fondo della provetta 15 ml. Delicatamente e lentamente dissociare i pezzi di tessuto, aspirando tre volte con la punta P 1.000.
   Nota: Passaging media promuove separazione cellulare ed è necessario per evitare l'uso di enzimi.
4. Lasciare che il tubo a sedere per 30 a 60 secondi per i più grandi (più pesanti) pezzi indissociate per risolvere in fondo. Singole cellule dissociate rimarranno nel surnatante. Trasferire circa 700 ml di surnatante in una provetta da 15 ml fresco (provetta B).
5. Ripetere i punti 7.3 e 7.4 di dissociare i pezzi più grandi.
6. Ripetere le fasi 7.3 e 7.4 una seconda volta per dissociare i pezzi più grandi. Trasferire tutto surnatante al tubo 15 ml fresco (provetta B).
7. Aggiungere media espansione ad un volume totale di 5 ml. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Valutare le cellule morte dalla colorazione trypan-blu.
   Nota: I piccoli NSC tollerano i passi 7,2 a 7,6 meglio di celle più grandi. Da 10 embrioni aspettare circa 4 x 10 ⁶ celle con 10% di cellule morte.
8. Per l'espansione di NSC, piastra 1,5 x 10 ⁶ cellule per 10 cm fibronectina rivestite piatto di coltura tissutale in un volume di 8 ml di mezzo di espansione. Per l'espansione di serie, aggiungere 8 ml di 1,000x rhFGF2 magazzino. Aggiungere 8 ml rhFGF2 ogni giorno e mi cambiadia ogni altro giorno.
   Nota: La corteccia in questa fase di sviluppo contiene una maggioranza di NSC e solo una minoranza di cellule differenziate. Le cellule differenziate di minoranza non rispondono al rhFGF2-trattamento e muoiono durante la cultura di espansione.
9. Passaggio ampliato NSC al 60% di confluenza.
   1. Per NSC passaggio, rimuovere media espansione. Lavare le cellule rapidamente tre volte con 5 ml di media passaging. Attendere 2-4 min. Senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} cellule lentamente staccarsi dalla superficie, arrotondamento. Verificare il distacco delle cellule al microscopio fase. Attendere qualche minuto, se necessario, fino a quando si osserva il distacco visivo dalla superficie.
      Nota: le celle singole saranno completamente staccare, ma la maggior parte delle cellule sarà ancora aderire alla superficie piatto. La durata necessaria per il distacco dipende dalla durata del rivestimento fibronectina. Un rivestimento fibronectina breve (12 ore o meno) si traduce in più veloce il distacco delle cellule. Per gli esperimenti più lunghi (>; Si raccomanda 1 settimana) rivestimento fibronectina di oltre 24 ore.
10. Utilizzare una pipetta 10 ml di staccare delicatamente le cellule dalla superficie. Raccogliere il medium passaging 5 ml con le cellule e trasferirlo in una nuova provetta 15 ml. Ripetere con altri 5 ml di terreno passaging.
11. Dissociare le cellule nel tubo 15 ml pipettando su e giù tre volte, ponendo la pipetta 10 ml al fondo della provetta. Spin la provetta per 15 min a 1200 xga temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di mezzo di espansione. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Utilizzare trypan blu per valutare le cellule morte.
    Nota: Dopo l'espansione al 60% di confluenza, si aspettano 4 - 5 x 10 ⁶ cellule con una conta di cellule morte intorno al 10%.
12. Piastra 8 x 10 ⁵ cellule per 10 centimetri piatto per ulteriori passaggi.

8. Valutazione migrazione

1. Per la valutazione della migrazione, isolare espianti secondo la sezione 5. Seed gli espianti in35 piatti mm griglia. Un'ora dopo la placcatura, aggiungere FGF2 (rhFGF2). Porre le capsule in un incubatore a 37 ° per 2 giorni.
   Nota: Per il fissaggio ottimale espianto, evitare di spostare i piatti.
2. Rimuovere media da 1.000 ml punta. Aggiungere 2 ml di terreno di espansione da 1.000 punta microlitri partendo dal cerchio interno (Figura 3). Questo riduce la tensione superficiale su espianti.
3. Aggiungere fattori di crescita da soli o in combinazione come richiesto per esperimento. Utilizzare FGF2 BMP4 / TGFβ1 controllo / positivo. Nota: In questo esperimento, 2 microlitri FGF2 a piatto 35 mm, 2 microlitri BMP4 e 4 microlitri TGFβ1 stati aggiunti solo e in combinazione (figura 5).
   1. Aggiungere fattori aggiuntivi e / o sostanze verificabili. Mantenere i piatti ancora intatto per 2 giorni a 37 ° C.
4. Scattare fotografie di espianti su un microscopio invertito.
   Nota: espianti viventi producono immagini a contrasto di fase migliori rispetto cellule fissate. Entrambi possono essere utilizzati.
5. per la migrazionela valutazione, utilizzare un software di grafica che permette di misurare in pixel (ad esempio, Fiji ^8).
6. Misurare la griglia piatto di 500 micron distanza in pixel e usarlo come riferimento interno.
7. Definire il centro del espianto come punto di inizio della migrazione. Misurare la distanza tra il centro del trapianto e il gruppo più esterno di 10 celle.
   Nota: Tutte le cellule migrano centrifuga dalla espianto. Essi formano spontaneamente un foglio alla periferia nelle circostanze testati (Figura 5).

9. La valutazione Invasion

1. Preparare coltura dei tessuti piastre da 24 pozzetti fibronectina a polvere secondo protocollo Sezione 4.
2. Mettere 300 ml di media espansione caldo nel pozzo superiore delle camere di invasione delle cellule. Incubare le camere per 30 minuti a 37 ° C e 5% CO _2.
3. Rimuovere il supporto di espansione dal pozzo superiore e posizionare la camera di Boyden nel rivestito 24-pozzetti.
4. Aggiungere 500 l di media espansione caldo con 0,5 ml di rhFGF2 e 0,5 ml rhBMP4 verso il basso pure.
5. NSC passaggio e contano come descritto nella Sezione 7. Passaggi da 1 a 4 sono adatti.
6. Piastra 5 x 10 ⁵ cellule in un volume di 300 ml di media espansione caldo con 0,3 ml di rhFGF2 e 0,3 ml di rhBMP4 nel pozzo superiore della camera di Boyden.
7. Cultura le NSC teste di serie per 24 ore.
8. Aggiungere fattori aggiuntivi e / o sostanze verificabili alla camera e coltivare le cellule per un altro 48 ore.
   Nota: Se le cellule sono invasivi, passeranno dalla parte superiore bene attraverso lo strato di membrana basale in fondo bene. cellule invasive si aggrappano al fondo della camera di Boyden.
9. Seguire il protocollo fornito dal produttore. Usare tamponi di cotone (inclusi nel kit di test di invasione) per rimuovere le cellule non invasive nel pozzo in alto con la pulizia due volte.
10. Rimuovere il supporto dai pozzetti e aggiungere media espansione con 500 microlitriuna macchia membrana plasmatica di cellule viventi e con il colorante nucleare DAPI ai pozzetti.
11. Incubare per 10 minuti a 37 ° C e 5% CO _2.
    Nota: I coloranti integrerà nella membrana e il nucleo delle cellule invasive, rispettivamente, per la visualizzazione ottimale ^8. Opzione: Omettere colorante membrana plasmatica se multicolore immunocitochimica è prevista.
12. Rimuovere il mezzo con i coloranti e lavare due volte con media espansione. Visualizzare e contare le cellule invasive con un microscopio a fluorescenza invertito, come dimostrato in precedenza ^8.
    Nota: Alcune cellule invasive potrebbero essere staccata dal fondo della camera e sono scesi alla superficie ben sotto dove si attaccano alla superficie rivestita. Per l'analisi completa includere le cellule sulla superficie bene.
13. Rimuovere il supporto e fissare le cellule in ghiaccio-freddo fresco 4% PFA per 10 min. Lavare 3x con PBS 1x. Eseguire immunocitochimica sulle cellule invasive, come precedentemente descritto ^8-10.

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Risultati

Questo sistema modello EMT è basato sull'isolamento standardizzata di NSC sia come singole cellule o espianti come da una regione specifica del tubo neurale sviluppo, la corteccia centrale (figure 1 e 2). Per la valutazione quantitativa, espianti sono stati seminati proprio al centro di 500 micron cultura griglia piatto (Figura 3). Espianti da corteccia centrale sono stati esposti a FGF2 per due giorni, seguiti da altri due giorni i...

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Discussione

In questo studio un sistema standardizzato per EMT analisi NSC che utilizzano è descritta (riassunti nella figura supplementare 3). La standardizzazione assicura riproducibilità (Tabella 1 e 2). I NSCs sono derivati ​​dalla corteccia di sviluppo, un tessuto che normalmente non subisce EMT. Questo è un vantaggio per l'analisi dei primi passi in EMT. Primi passi in EMT non possono essere adeguatamente studiati nelle cellule tumorali che si sono accumulati i cambiamenti genetici...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BMP4, rhBMP4	RnD Systems	314-BP-01M
Bovine pancreas insulin	Sigma	I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay	Cell Biolabs	CBA-110	24 well plate system
Cell culture dish with grid	Ibidi 500 mm dish, 35 mm	80156
CellMask Orange	Life Technologies	C10045	Plasma membrane dye, use at 1:1,000.
DAPI	LifeTechnologies	D1306	Stock at 5 mg/ml. Use at 1:10,000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required.
DMEM/F12 1:1 medium bottle	Gibco Invitrogen	21331-020
FGF2, rhFGF2	RnD Systems	233-FB-01M
Fibronectine, bovine	Sigma	F4759
Glutamax supplement	Gibco Invitrogen	35050-061
Graphics software with pixel measurement feature	Fiji	fiji.sc/Fiji	version 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS media	Sigma	H9394
Human apo-Transferrin	Sigma	T1147	Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection.
L-glutamine	Gibco Invitrogen	25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibody	Genetex	GTX26142	Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody	Provided by Hirohide Takebayash	Personal stock	Use at 1:2,000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
Penicillin/Streptomycin/Fungizone	Gibco Invitrogen	15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody	Acris	DM3614P	Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100
Poly-L-ornithine	Sigma	P3655
Putrescine	Sigma	P5780	Skin and eye irritant. Appropriate protection required.
Sodium selenite	Sigma	S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody	Millipore Chemicon	AB5774	Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1%
TGFb1, rhTGFb1	RnD Systems	240-B-010
Uncoated Petri dishes	Falcon Corning	351029