Un Mouse 5/6th Nephrectomy modello che induce cardiomiopatia uremica sperimentale

Riepilogo

Questo manoscritto fornisce una procedura chirurgica in due passaggi dettagliati per eseguire nefrectomia parziale^th da mouse 5/6 (PNx) con legatura di palo. Quattro settimane dopo la chirurgia, in confronto ai topi falsità-azionati, i topi di PNx sviluppato fibrosi cardiaca, insufficienza renale, l'anemia, ipertrofia cardiaca e ridotta funzione sistolica e diastolica del cuore.

Abstract

Malattia renale cronica (CKD) è un grande fattore di rischio per eventi cardiovascolari e mortalità e progressivamente si sviluppa al fenotipo clinico chiamato "cardiomiopatia uremica". Descriviamo qui un modello sperimentale di topo CKD, denominato 5/6^th il nephrectomy parziale (PNx) con legatura di palo, che ha sviluppato la cardiomiopatia uremica alla post-chirurgia quattro settimane. Questo modello di PNx è stato effettuato da un intervento chirurgico in due fasi. In chirurgia passo-uno, entrambi i poli del rene di sinistra erano legati. Nella chirurgia di passaggio-due, che è stata effettuata 7 giorni dopo l'intervento di passo-uno, è stato rimosso il rene di destra. Per la chirurgia di falsità, le stesse procedure di chirurgia sono state effettuate ma senza poli legatura del rene di sinistra o alla rimozione del rene di destra. Le procedure chirurgiche sono più facili e meno dispendio di tempo, rispetto ad altri metodi. Tuttavia, il residuo massa renale funzionale non è controllata come facilmente come la legatura dell'arteria renale. Quattro settimane dopo la chirurgia, in confronto ai topi falsità-azionati, i topi di PNx sviluppato fibrosi cardiaca, insufficienza renale, l'anemia, ipertrofia cardiaca e ridotta funzione sistolica e diastolica del cuore.

Introduzione

CKD, noto anche come insufficienza renale cronica, è una perdita progressiva della funzione del rene nel tempo che si sviluppa poi in insufficienza renale permanente. CKD, dagli Stati di malattia renale fase precoce di malattia renale di stadio finale (ESRD), è un grande fattore di rischio per eventi cardiovascolari e mortalità e progressivamente si sviluppa al fenotipo clinico chiamato "cardiomiopatia uremica"^{1, 2,3}. La cardiomiopatia uremica nei pazienti con CKD o ESRD è associata con le anomalie cardiovascolari, principalmente causate da sovraccarico di pressione ventricolare di sinistra (LV) e/o volume, portando a ipertrofia (LVH), la dilatazione di LV e la disfunzione sistolica LV^{4 ,5,6}. Fibrosi cardiaca è un altro processo patologico comune di cardiomiopatia uremica che riduce la compliance cardiaca conseguente disfunzione diastolica di LV. La fibrosi cardiaca severa può portare alla morte cardiaca improvvisa, anche in quelli senza sintomi cardiaci⁷.

Il 5/6^th PNx è un modello animale di CKD comunemente utilizzato per gli studi sugli animali che coinvolgono l'indebolimento renale, cardiomiopatia uremica e ipertensione. PNx è raggiunto tramite ablazione del parenchima renale 5/6. Modello del ratto è stato inizialmente sviluppato con i due più comuni protocolli impiegati essendo la resezione chirurgica o infarto. Il modello di PNx ratto è un modello estremamente utile per studiare la cardiomiopatia uremica con sostanziali aumenti nella pressione sanguigna, l'ipertrofia cardiaca e alterata funzione diastolica. Più tardi, i modelli murini di PNx, operati con le tecniche simili come modello del ratto, sono stati sviluppati grazie alla vasta disponibilità e facilità di effettuare manipolazioni genetiche del sistema del mouse.

È ben documentato che lo stress ossidativo sistemico è una caratteristica costante di entrambi cardiomiopatia uremica clinica e sperimentale^8,9. Inoltre, lo sforzo dell'ossidante contribuisce alla sindrome uremica¹⁰e svolge un ruolo critico nella patogenesi delle anomalie cardiache visto in cardiomiopatia uremica^11,12,13. A questo punto, abbiamo dimostrato che il roditore 5/6^th PNx modello causa le caratteristiche fisiologiche, morfologiche e biochimiche di cardiomiopatia uremica^{14,15,16, 17}. nel modello del topo di PNx descritto qui, topi PNx-azionati sviluppato forte stress ossidativo, almeno parzialmente mediato di Na/K-ATPasi funzione, che è fondamentale in cardiomiopatia uremica sperimentale PNx-mediata di segnalazione. Attenuazione di Na/K-atpasi di segnalazione non solo riduce l'amplificazione ossidativo, ma migliora anche le modifiche fenotipiche in cardiomiopatia uremica sperimentale PNx-mediata¹⁸.

Protocollo

tutti cura degli animali e gli esperimenti sono stati approvati dalla Marshall University istituzionali cura degli animali e uso Committee (IACUC) in conformità con la guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso di animali da laboratorio. I topi maschii C57BL/6 (10-12 settimane) sono stati alloggiati in una struttura animale libero agente patogeno in determinate stanze dotate di gabbie che forniscono aria purificata sotto un ciclo luce/buio di 12 h. Il cibo e l'acqua era fornito ad libitum.

1. preparazione all'intervento

Nota: I materiali e gli strumenti chirurgici sono ottenuti da diverse fonti che non sono specifici per gli interventi di chirurgia. Strumenti e materiali da altre fonti possono essere utilizzati anche per lo stesso scopo. Vedi la Tabella materiali per un elenco di strumenti chirurgici.

Tabella

1. preparazione per la chirurgia
   1. posto di seguito alla portata di funzionamento: riscaldamento pad, lampada alogena, bombola di ossigeno e isoflurano serbatoio, vaporizzatore isoflurano, tagliatore di capelli, crema depilatoria, bilance, sterilizzati funzionamento insieme, lino chirurgico sterilizzato, tamponi di cotone, alcool al 70%, soluzione polyhydroxydine (contenente 1% di iodio), soluzione di NaCl 0,9%, 1 mL siringhe ed aghi (30 G), punti di sutura seta 3-0 e 4-0, buprenorfina e penicillina, pomata antibiotica, e unguento oculare lubrificante.
   2. Pulire una gabbia e posizionare una piastra di calore sotto la biancheria da letto per topi alloggiamento dopo chirurgia.

2. Chirurgia passo-uno: palo legatura del rene di sinistra

Nota: mantenere condizioni sterili durante l'intervento chirurgico. Coprire gli strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave con un tampone sterile. Tenere più di un set di strumenti chirurgici in mano per più di un intervento chirurgico per evitare la contaminazione incrociata durante l'intervento chirurgico. Se gli strumenti devono essere utilizzati nuovamente, nel caso di interventi chirurgici multipli, disinfettare gli strumenti con soluzione di betadine ed etanolo al 70% e quindi sterilizzare in uno sterilizzatore di perlina di vetro germinator per 5 min, disinfetta l'area operativa con etanolo al 70%. Indossare un abito, maschera (per coprire naso e bocca), PAC (per coprire la testa) e un paio di guanti sterili. Cambiare i guanti dopo ogni intervento chirurgico.

1. Lavare e disinfettare le mani e indossare guanti chirurgici sterili. Indossare un berretto in testa e una maschera.
2. Disinfettare la tabella con alcool al 70%. Applicare l'unguento oculare lubrificante in entrambi gli occhi del mouse per prevenire la secchezza dell'occhio mentre sotto anestesia.
3. Posizionare il mouse in una camera d'induzione di un sistema di vaporizzatore isoflurano e inducono anestesia con una miscela di 2,5% isoflurane con ossigeno al 100% (0,8 - 1,2 L/min) per un minimo di 1-2
   Nota: L'efficacia dell'anestesia è stato determinato dall'assenza del riflesso di dolore suscitato pizzicando la coda, così come dall'assenza del riflesso palpebrale toccando la palpebra.
4. Iniettare penicillina (40.000 unità/kg di peso corporeo, IM) e buprenorfina (0,02 mg/kg peso corporeo, SC) per prevenire l'infezione e dolore durante l'intervento chirurgico.
5. Posizionare il mouse su un tappetino riscaldante (inizialmente fissato a 42 ° C) con un termometro rettale per mantenere e monitorare la temperatura corporea intorno ai 37 ° C durante la procedura. Posizionare il mouse naso nel cono di naso e ventilare con una miscela di 0.8-1.2% isoflurane con ossigeno 100% (0,8-1,2 L/min) durante l'intervento chirurgico.
6. Posizionare il mouse sul lato destro. Radersi i capelli del campo operatorio con un tagliatore di capelli e poi rimuovere con la crema depilatoria. Disinfettare il sito con soluzione polyhydroxydine (contenente 1% di iodio), seguito da etanolo al 70%. Allineare la biancheria in autoclave chirurgico sulla zona chirurgica.
7. Fare un'incisione lombare di cm ~1.0 e separare il muscolo e la fascia per esporre il rene di sinistra utilizzando il bisturi e pinze ( Figura 1a).
8. Estrarre il rene di sinistra molto delicatamente, tirando il grasso perirenale con piccolo forcipe smussato. Nel processo, in modo da non disturbare la ghiandola surrenale, spostare la ghiandola surrenale verso l'alto dal rene con forcipe.
9. Using forcipe smussato, stuzzicare delicatamente il tessuto connettivo e la ghiandola surrenale dall'estremità superiore del rene verso il piloro centrale del rene dove vasi sanguigni entrare ed uscire. Identificare e isolare l'uretere.
   Nota: L'uretere si trova intorno alla metà inferiore del rene incorporato nel tessuto connettivo e chiaramente visibile sotto la luce.
10. Delicatamente afferrare il tessuto connettivo e separata dal tessuto renale per garantire che l'uretere non è legato.
11. Prima polar legature, utilizzare un righello sterile per identificare la parte superiore ed inferiore di 1/3 del rene. Il rene del topo è solitamente intorno 1.25-1.5 cm long.
12. Legano usando una seta 3-0 suturare stringa e con adeguata forza, circa 0,4 cm dalla parte superiore verso la metà del piloro e allo stesso modo, 0,4 cm dalla parte inferiore verso il piloro ( Figura 1a, punteggiato linee).
13. Dopo legatura entrambi i poli ( Figura 1b), consentire un periodo di osservazione di 2 min per assicurarsi che non esiste nessun sanguinamento.
    Nota: Nel processo, è molto importante evitare la legatura del surrene, dell'arteria renale e dell'uretere. Se è legato l'uretere di sinistra, il mouse morirà dopo la rimozione del rene di destra nella chirurgia passo-due. La forza di legatura può limitare il flusso di sangue ai poli senza causare sanguinamento intra-renale. Entro 1-2 min dopo la legatura, i polacchi sono scoloriti a causa del limite di flusso sanguigno ai poli.
14. Spingere indietro il rene di sinistra al posto originale. Chiudere il muscolo e la pelle con stringhe di sutura seta 4-0 e 3-0, rispettivamente. Applicare pomata antibiotica per l'area chirurgica per una migliore ripresa e disinfezione.
15. Dopo la legatura, casa del mouse separatamente in una gabbia con una lampada di calore sopra la gabbia affinché la zona di biancheria da letto è vicino a 37 ° C (controllato con un termometro), prima di mettere gli animali in gabbie individuali.
    Nota: Controllare il mouse fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale.
16. Consentire un facile accesso all'acqua e cibo durante il recupero. Amministrare la penicillina e buprenorfina ogni 12 h per il primo post-ambulatorio 3 giorni prevenire l'infezione e dolore.
    Nota: Il mouse dovrebbe recuperare dal trauma dell'intervento chirurgico entro 2-3 giorni e dovrebbe essere tornato alla normale mangiare, bere e in movimento. In questo momento, casa del mouse individualmente per il pieno recupero. Devono essere monitorati i seguenti: bere, mangiare, camminare modelli, andatura goffa, gobba, scarico oculare e/o nasale e comportamento aggressivo. Eutanasia il mouse se Mostra segni di grippaggio, coma, infezione incurabile, difficoltà a camminare, perdita di andatura, in grado di mangiare e bere e perdita di più di 15% pre-operazione peso.

3. Passaggio-due chirurgia: rimozione del rene di destra

1. sette giorni più tardi, esporre il rene di destra come descritto per il rene di sinistra nei passaggi 2.1 a 2.10, tranne posizionare il mouse sul suo lato sinistro.
2. Inserire il rene di destra sulla biancheria e deselezionare circostante grasso e tessuto connettivo con forcipe smussato.
3. Identificare l'arteria renale e la vena e quindi posizionare due legature (seta 3-0) ciascuna con un singolo nodo sciolto intorno ai vasi. Delicatamente prendere in giro il tessuto connettivo e surrenale ghiandola dall'estremità superiore del rene verso il piloro centrale del rene usando il forcipe smussato. Delicatamente spostare l'uretere dall'estremità inferiore e legare tutti i vasi insieme (seta 3-0) senza provocare sanguinamento.
4. Spostare i due nodi di legatura sciolti lungo i vasi. Uno verso il lato dell'aorta addominale e l'altra verso il lato del rene.
5. Prima legare il nodo di legatura (verso il lato dell'aorta addominale) con doppi nodi; un solido nodo cambierà il colore del rene di destra. Legare il nodo di legatura (verso il lato del rene) con doppi nodi. Lasciare spazio sufficiente tra questi due doppi nodi in modo da tagliare i vasi tra i due nodi senza tagliare i nodi legature.
6. Tagliare i vasi renali tra i due nodi e rimuovere il rene di destra. Controllare i possibili emorragie dei vasi renali.
7. Asciugare il rene di destra con garza sterile e pesare it.
8. Chiudere l'incisione del muscolo con stringa di sutura seta 4-0 e quindi chiudere l'incisione cutanea con stringa di sutura seta 3-0.
9. Casa del mouse separatamente in una gabbia pulita solitario con una lampada di calore sopra la gabbia (punto 2.15) con facile accesso all'acqua e cibo per almeno 24 h di recupero. Amministrare la penicillina e buprenorfina ogni 12 h per 3 giorni per prevenire l'infezione e dolore.
   Nota: Il mouse dovrebbe recuperare dal trauma dell'intervento chirurgico entro 2-3 giorni e dovrebbe essere tornato alla normale mangiare, bere e in movimento.
10. Dopo la chirurgia, monitorare i topi due volte al giorno per tre giorni e poi una volta al giorno per tutta la durata dell'esperimento. Seguire le procedure di monitoraggio e trattamento post-chirurgiche descritte nel passaggio 2.16.

4. Sham chirurgia

1. per la chirurgia di sham, eseguire le stesse procedure di chirurgia, compresa l'esposizione del rene, la dissezione del tessuto e la chiusura della ferita, ma senza la legatura di palo del rene di sinistra o la rimozione del rene di destra.

5. valutazione della cardiomiopatia uremica sperimentale

1. un giorno prima del sacrificio, eseguire un ecocardiogramma transtoracico e catturare immagini ¹⁸.
   Nota: Qui, l'ecocardiografia transtoracica è stata effettuata con un termometro rettale e tabella di gestione del mouse. Le immagini ecocardiografiche sono state acquisite utilizzando un 18-38 MHz trasduttore di frequenza di funzionamento collegato a un sistema di imaging. Spessore della parete relativa (RWT), indice di performance miocardica (MPI) e indice di massa ventricolo sinistro (orientamento) sono stati calcolati come descritto ¹⁸.
2. Al momento del sacrificio, misurare il peso del corpo. Misurare l'ematocrito (HCT) con una centrifuga HCT secondo produttore ' s istruzioni. Preparare i campioni di plasma utilizzando provette sensibilizzate con eparina mediante centrifugazione i campioni di sangue per 10 min a 1.500 x g a 4 ° C in una centrifuga refrigerata da tavolo. Misurare la cistatina C, creatinina e BUN utilizzando kit seguendo il produttore ' s istruzioni. Eseguire le misurazioni in duplicato.
3. Alla fine dell'esperimento, anestetizzare i topi con ketamina (90 mg/kg, IP) e xylaxine (10 mg/kg, IP) e sacrificio dal thoracotomy. Misurare il peso del cuore dopo averlo tolto dal petto. Preparare cardiaco (LV) e degli omogeneati del rene, come pure la determinazione di collagene di tipo 1 (COL-1), la fosforilazione di c-Src e proteina carbonilazione, come descritto prima ^{18 , 19}.

Risultati

I dati hanno indicato che questo modificato 5/6^th PNx tramite la legatura di palo è un modello semplice ed efficace per studiare la cardiomiopatia uremica. Alla quattro settimane post-chirurgia, questo PNx modello presenta alterata funzione renale, l'anemia, l'ipertrofia cardiaca, fibrosi cardiaca e ridotta funzione sistolica e diastolica del cuore. I risultati sono riassunti qui di seguito.

Alla pos...

Discussione

Il ratto 5/6^th PNx modello è stato ampiamente utilizzato per lo studio di CKD. A causa della dimensione molto più piccola del rene nel topo, la legatura dell'arteria classica e la resezione di palo sono molto impegnativi in modelli murini con possibili alti tassi di mortalità e la perdita di sangue sanguinamento inaspettato.

Abbiamo adottato un modello di topo PNx con legatura di palo per superare la perdita di sangue/sangue. Questo modello di PNx richiede meno tempo con il tasso...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight	World Precision Instruments	501758
WPI Swiss Tweezers #5 11 cm, 0.1x0.06 mm Tips	World Precision Instruments	504506
Jewelers #5 Forceps, 11cm, Straight, Titanium	World Precision Instruments	555227F
Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated	World Precision Instruments	15914
Tweezers #3, 11cm, 0.2x0.4mm Tips	World Precision Instruments	501976
Medesy Iris 4.5" Curved Scissors, Stainless Steel	Net23	3512	www.Net32.com
Dr. Slick Iris Scissors; 3.5"	Avid Max	220-1-965-IrisScsrs-P	www.Avid Max.com
Miltex Iris Scissors 4 1/8" Curved	4mdmedical	V95-306	www.4mdmedical.com
5" Hemostat clap, curved jaw	PJTool	4355	www.pjtool.com
sklar Knapp Iris scissors, straight and sharp/blunt 4"	Medical Device depot	64-3430	www.medicaldevicedepot.com
Kelly Hemostatic Forceps straight 5.5"	Pilgtimmedical	FA710-50	www.pilgtimmedical.com
C57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals Inc.
Mouse Handling Table and rectal thermometer	Visualsonics
MicroScan transducer	Vevo 1100	MS400
Vevo 1100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics Inc.
Cystatin C ELISA kit and mouse creatinine kit	Crystal Chem. Inc.
Mouse BUN ELISA kit	MyBioSource Inc