마우스 5/6일 신 모델 실험 신부전 심근을 유도

요약

이 원고 마우스 5/6^일 부분 신 (PNx) 극 결 찰과 수행에 상세한 2 단계 수술 절차를 제공 합니다. 수술 후 4 주 운영 하는 가짜 쥐에 비해 PNx 마우스 개발 장애 신장 기능, 빈 혈, 심장 비 대, 심장 섬유 증, 및 심장 수축 기 및 diastolic 기능 감소.

초록

만성 신장 병 (CKD) 심혈 관 질환 이벤트 및 사망률에 대 한 큰 위험 요소 이며 "신부전 심근" 라는 임상 표현 형에 점차적으로 발전 한다. 여기 극 결 찰, 수술 4 주 후에 신부전 심근 개발 5/6^일 부분 신 (PNx) 라는 하는 실험적인 CKD 마우스 모델을 설명 합니다. 이 PNx 모델 2 단계 수술에 의해 수행 되었다. 단계 1 수술에서 왼쪽된 신장의 두 극 출혈 했다. 수행 단계 1 수술 후 7 일, 2 단계 수술에서 오른쪽 신장은 제거 되었다. 가짜 수술 같은 수술 절차 수행 하지만 없이 왼쪽된 신장 결 찰 또는 오른쪽 신장 제거 장 대. 수술 절차는 쉽고 보다 적게 시간이 걸리는 다른 방법에 비해. 그러나, 나머지 기능 신장 질량 신장 동맥 결 찰으로 쉽게 제어 되지 않습니다. 수술 후 4 주 운영 하는 가짜 쥐에 비해 PNx 마우스 개발 장애 신장 기능, 빈 혈, 심장 비 대, 심장 섬유 증, 및 심장 수축 기 및 diastolic 기능 감소.

서문

CKD, 일컬어 만성 신부전, 신장 기능의 진보적인 손실 결국 영구적인 신부전으로 발전 하는 시간이 끝났습니다. CKD, 끝 단계 신장 질병 (ESRD)을 초기 단계 신장 질병 상태에서 심혈 관 질환 이벤트 및 사망률에 대 한 큰 위험 요소 이며 점차적으로 "신부전 심근"^1, 라는 임상 표현 형을 개발 ^2,3. CKD 또는 ESRD 환자에서 신부전 심근은 심장 혈관 이상, 주로 좌 심 실 (LV) 압력 및/또는 볼륨, LV 비 대 (LVH), LV 팽창 및 LV 수축 부전^{4의 오버 로드로 인 한 연관 ,,56}. 심장 섬유 증 심장 준수 LV 확장기 부전 결과로 감소 신부전 심근의 또 다른 일반적인 병 적인 과정 이다. 심각한 심장 섬유 증은 그 없이 심장 증상⁷에 갑작스런 심장 죽음으로 이어질 수 있습니다.

5/6^일 PNx은 신부전 심장 근육 병 증, 고혈압, 신부전을 포함 하는 동물 연구에 대 한 일반적으로 사용 되 CKD 동물 모델 이다. PNx 5/6 신장 실질의 제거에 의해 달성 된다. 쥐 모델 처음 개발한 두와 함께 가장 일반적인 프로토콜 외과 절제술 또는 경색 되 고 고용. 쥐 PNx 모델은 혈압, 심장 비 대 및 장애인된 diastolic 기능에 상당한 고도 함께 신부전 심근을 공부 하는 매우 유용한 모델. 나중에, 마우스 PNx 모델, 쥐 모델로 비슷한 기술로 운영 넓은 가용성 및 마우스 시스템에 유전자 조작의 용이성으로 인해 개발 되었다.

그것은 잘 문서화 된 조직의 산화 스트레스는 모두 임상 및 실험 신부전 심근^8,9의 일정 기능입니다. 게다가, 산화 스트레스 신부전 증후군¹⁰에 기여 하 고 신부전 심근^11,,1213에서 심장 종양의 병 인에 중요 한 역할을 한다. 이 시점에, 우리가 보여준 그 설치류 5/6^일 PNx 모델 발생 생리, 형태학, 생화학 기능과 신부전 심근^14,,1516, 의 ¹⁷. 여기에 설명 된 마우스 PNx 모델에서 운영 하는 PNx 마우스 개발 중요 한 산화 스트레스, Na/K-ATPase 함수를 PNx 중재 실험 신부전 심근에 중요 한 신호에 의해 적어도 부분적으로 중재. Na/K-ATPase 신호 감쇠 뿐만 아니라 산화 증폭 줄어들지만 또한 PNx 중재 실험 신부전 심근¹⁸phenotypical 변화를 살펴볼.

프로토콜

모든 동물 관리 및 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 마샬 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 국립 보건원 (NIH) 가이드에 의해 승인 했다. 남성 C57BL/6 마우스 (10-12 주 이전) 지정 객실 12 h 명암 주기에서 공기를 정화 제공 연습장을 갖추고 병원 체 무료 동물 시설에 보관 되어 있었다. 음식과 물 공급된 광고 libitum 했다.

1. 수술 준비

참고: 수술 도구와 재료 수술 작업에 특정 하지 않은 다른 소스에서 얻을 수 있습니다. 악기와 다른 소스 로부터 자료 또한 동일한 목적을 위해 사용할 수 있습니다. 수술 악기의 목록에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.

1. 수술에 대 한 준비
   1. 장소 운영 곳 다음 테이블: 온난화 패드, 할로겐 램프, 산소 탱크 및 isoflurane 탱크, isoflurane 기화 기, 머리 깎기, 제 모 크림, 비늘, 살 균 세트, 소독된 외과 넨, 면봉, 70% 알코올, polyhydroxydine 솔루션 (1% 요오드 포함), 0.9 %NaCl 용액, 1 mL 주사기 및 바늘 (30 G), 3-0와 4-0 비단 봉합 buprenorphine, 페니실린, 항생제 연 고를 운영 하 고 윤 활 유 눈 연 고.
   2. 감 금 소를 청소 하 고 수술 후 주택 마우스 침구 아래 열 패드 배치.

2. 단계 1 수술: 극 결 찰의 왼쪽 신장

참고: 수술 동안 멸 균 상태를 유지. 압력가 마로 소독 외과 기구 살 균 패드와 함께 커버. 수술 동안 교차 오염을 방지 하기 위해 더 이상의 수술 외과 악기의 하나 이상의 세트를 손에 계속. 악기를 다시 사용 해야, 여러 수술의 경우 betadine 솔루션 및 70% 에탄올, 악기를 소독 하 고 5 분 소독 70% 에탄올과 운영 지역에 대 한 germinator 유리 구슬 소독 기에 소독. (커버 코 입)를, (헤드 커버)에 모자, 마스크, 가운을 착용 하 고 멸 균 장갑 한 켤레. 각 수술 후 장갑 변경.

1. 세척 및 손 소독 및 멸 균 수술 장갑을 착용. 머리 모자와 마스크 착용.
2. 테이블 70% 알코올로 소독. 마 취에서 눈 건조를 방지 하기 위해 마우스의 두 눈에 윤활제 눈 연 고를 적용.
3. Isoflurane 기화 기 시스템의 유도 실에서 마우스를 배치 하 고 2.5% isoflurane 1-2 분에 대 한 100% 산소 (0.8-1.2 L/min)의 혼합물으로 마 취 유도
   참고: 마 취의 효능 통증 반사 종을 반사의 부재에 의해 뿐만 아니라, 꼬리를 곤란 하 게 하 여 눈 꺼 풀을 만져 elicited의 부재에 의해 결정 되었다.
4. 페니실린 (40000 단위/kg 몸 무게, 임)과 buprenorphine (0.02 mg/kg 몸 무게, 사우스 캐롤라이나) 수술 중 통증과 감염을 방지 하기 위해 주입.
5. 유지 절차 동안 체온 37 ° C의 주위를 감시 하는 직장 온도계로 지구 온난화 패드 (처음에 42 ° C에서 설정)에 마우스를 놓습니다. 마우스 코 코 콘으로 놓고 0.8-1.2의 혼합물으로 환기 % isoflurane 100% 산소 (0.8-1.2 L/min) 수술 하는 동안.
6. 는 오른쪽에 마우스를 놓습니다. 머리 깎기로 외과 영역의 머리를 면도 하 고 제 모 크림으로 제거. 뒤에 70% 에탄올 (1% 요오드 포함) polyhydroxydine 솔루션 사이트를 소독. 외과 영역에 압력가 수술 린 넨 정렬.
7. ~1.0 cm 허리 절 개를 하 고 근육과 근 노출 메스 집게 ( 그림 1a)를 사용 하 여 왼쪽된 신장 분리.
8. 당겨 왼쪽된 신장 밖으로 아주 부드럽게 perirenal 지방에 작은 무뚝뚝한 집게와. 과정에서 부 신 샘을 방해 하기 위하여 이동 아드레날린 선 위쪽으로 신장에서 집게.
9. 무딘 집게를 사용 하 여, 부드럽게 결합 조직과 신장 혈관에 입력 하 고 출구의 중간 pylorus 향해 신장의 우수한 끝에서 아드레날린 선 애타게. 식별 하 고 격리 ureter.
   참고: 열 등 한 결합 조직에 포함 된 및 빛에서 명확 하 게 보이는 신장 절반 주위 ureter 거짓말.
10. 부드럽게 잡아 결합 조직 및 ureter 출혈 되지 보장 하기 위해 신장 조직에서 분리.
11. 폴라 ligations 전에 신장의 뛰어난 및 하 부 1/3 부분을 식별 하는 메 마른 자를 사용. 마우스 신장은 일반적으로 1.25-1.5 cm 오래 주위
12. Ligate 3-0 비단 봉합 문자열과 적절 한 힘을 사용 하 여, pylorus의 중앙으로 우수한 부분에서 약 0.4 c m와 마찬가지로, 0.4 cm pylorus ( 그림 1a, 점선으로 열 등 한 부분에서 라인).
13. 두 극 ( 그림 1b) ligating, 후 아니 출혈은 되도록 2 분 관측 시간 허용.
    참고:이 과정에서 매우 중요 하다 부 신, 신장 동맥, 및 ureter 결 찰을 피하기 위해. 왼쪽된 ureter 출혈 하는 경우 마우스의 2 단계 수술에서 오른쪽 신장 제거 후 죽을 것 이다. 결 찰 힘 내 신장 출혈을 유발 하지 않고 폴란드에 혈액 흐름을 제한할 수 있습니다. 결 찰 후 1-2 분 이내 폴란드는 폴란드에 혈액 흐름의 제한으로 인해 변색.
14. 밀어 왼쪽된 신장 다시 원래 장소. 근육과 피부를 4-0와 3-0 비단 봉합 문자열에 각각 닫습니다. 더 나은 복구 및 소독에 대 한 외과 영역에 항생제 연 고를 적용.
15. 결 찰, 후 집에 별도로 마우스 열 램프와 감 금 소에는 침구 영역 (온도계와 모니터링), 37 ° C 가까이 개별 장에 동물을 배치 하기 전에.
    참고: sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 마우스를 모니터.
16. 복구 하는 동안 물과 음식에 쉽게 액세스를 허용합니다. 페니실린과 buprenorphine 감염 및 고통을 방지 하기 위해 첫 3 일 후 수술에 대 한 모든 12 h.
    참고: 마우스 2-3 일 이내 수술의 외상에서 회복 해야 하 고 다시 정상적인 식사, 음주와 이동 하는 것. 이 시간에서 전체 복구에 대 한 개별적으로 마우스를 집. 다음 모니터링 해야 합니다: 음주, 식사, 패턴, 어 색 한 걸음 걸이, 돌출, 눈 또는 비 강 방전 뒤로하고 공격적인 행동을 걸어. 발작, 혼 수 상태, untreatable 감염, 어려움 걷기, 걸음 걸이, 음식과 음료, 수 없습니다의 손실 및 15%의 손실의 어떤 표시 든 지 표시 하는 경우 마우스를 안락사 사전 작업 무게.

3. 단계 2 수술: 오른쪽 신장의 제거

1. 7 일 후, 단계 2.1에 2.10, 마우스의 왼쪽된 측면에 배치를 제외 하 고 왼쪽된 신장에 대 한 설명 된 대로 오른쪽 신장 노출.
2. 리넨에 오른쪽 신장 고 무딘 집게와 주변 지방과 결합 조직 취소.
3. 신장 동맥과 정 맥, 식별 하 고 두 개의 합자 (3-0 실크) 각 단일 느슨한 매듭 혈관 주위 장소. 부드럽게 결합 조직과 부 신을 애타게 중간 pylorus 무딘 집게를 사용 하 여 신장으로 신장의 우수한 끝에서 선. 부드럽게 열 등 한 끝에서 ureter을 치환 하 고 모든 넥타이 혈관 함께 (3-0 실크) 출혈 발생 하지 않고.
4. 혈관을 따라 두 개의 느슨한 묶인 매듭을 이동합니다. 복 부 대동맥 쪽을 향해과 다른 하나 하나 신장 쪽을 향해.
5. 먼저 넥타이 (복 부 대동맥 측면)으로 묶인 매듭을 두 배 매듭, 단단한 매듭 오른쪽 신장의 색을 변경 합니다. 두 배 매듭 (신장 측)으로 묶인 매듭을 묶어. 합자 매듭을 절단 하지 않고 두 매듭 사이의 혈관을 잘라 수 있도록 이러한 두 개의 두 배 매듭 사이의 충분 한 공간을 두고.
6. 두 매듭 사이의 신장 혈관 고 오른쪽 신장 제거. 가능 신장 혈관의 출혈에 대 한 확인 하십시오.
7. 오른쪽 신장 멸 균 거 즈를 사용 하 여 건조 하 고 그것의 무게
8. 4-0 비단 봉합 문자열 근육 절 개를 닫고 다음 3-0 비단 봉합 문자열 피부 절 개를 닫습니다.
9. 복구에 적어도 24 시간을 위한 음식과 물에 쉽게 접근할 케이지 (단계 2.15) 동안 열 램프와 깨끗 한 독방에 별도로 마우스를 집. 페니실린과 buprenorphine 감염 및 고통을 방지 하기 위해 3 일에 대 한 모든 12 h.
   참고: 마우스 2-3 일 이내 수술의 외상에서 회복 해야 하 고 다시 정상적인 식사, 음주와 이동 하는 것.
10. 수술 후 3 일, 그리고 하루에 실험의 기간에 대 한 다음 한 번에 대 한 마우스를 두 번 매일 모니터링. 수술 후 모니터링 및 치료 단계 2.16에서에서 설명한 절차에 따라.

4. 수술 가짜

1. 가짜 수술에 대 한 노출의 신장, 조직, 그리고 상처 폐쇄, 하지만 왼쪽된 신장 극 결 찰 없이 해 부 또는 오른쪽 신장의 제거를 포함 하 여 동일한 수술 절차를 수행 합니다.

5. 실험적인 신부전 심근 평가의

1. 희생 하기 전에 1 일 transthoracic 심장 초음파 검사를 수행 하 고 캡처 이미지 ¹⁸.
   참고: 여기, transthoracic 심장 초음파 처리 테이블 고 직장 온도계 마우스와 함께 수행 되었다. Echocardiographic 이미지 이미징 시스템에 연결 된 동작 주파수 변환기는 18-38 MHz를 사용 하 여 점령 했다. 우리가 ¹⁸ 설명한 상대 벽 두께 (RWT), 심근 성과 지표 (MPI), 그리고 좌 심 실 질량 지 수 (LVMI) 계산 했다.
2. 희생의 때에 몸 무게를 측정. 제조 업체에 따라 HCT 원심 분리기가 (HCT) 측정 ' s 지시. 4 ° c 탁상 냉장된 원심 분리기에서 1500 x g에서 10 분 동안 혈액 샘플 centrifuging 여 헤 파 린 코팅 된 튜브를 사용 하 여 플라즈마 샘플을 준비 합니다. Cystatin C, 크와 벤 다음 제조 업체 키트를 사용 하 여 측정 ' s 지시. 중복에는 측정을 수행.
3. 실험의 끝에, anesthetize xylaxine (10 mg/kg, IP) 케 타 민 (90 mg/kg, IP)와 쥐와 thoracotomy 희생. 가슴에서 그것을 제거한 후 심장 무게를 측정 합니다. ^{18 , 19} 전에 설명한 것 처럼 Type 1 콜라겐 (1 열), c-Src 및 단백질에서 인 산화의 결정 뿐만 아니라 심장 (LV) 및 신장 homogenates을 준비.

결과

데이터 표시이 수정 5/6^일 극 결 찰에 의해 PNx 모델은 신부전 심근을 조사 하는 간단 하 고 효과적인 모델. 수술 4 주 후,이 PNx 모델 선물 심장 섬유 증, 심장 비 대, 빈 혈, 신장 기능 장애 및 심장 수축 기 및 diastolic 기능 감소. 결과 아래에 요약 된다.

수술 4 주 후, PNx 쥐 인간의 신부전 심근의 phenotype과 일치 ?...

토론

쥐 5/6^일 PNx 모델 널리 CKD를 공부 하는 데 사용 되었습니다. 크기 때문에 훨씬 작은 신장 마우스에서, 클래식 동맥 결 찰 및 극 절제 가능한 높은 사망률 및 예기치 않은 출혈/혈액 손실이 마우스 모델에서 매우 어려운 있습니다.

우리는 출혈/혈액 손실을 극복 하기 위해 극 결 찰 마우스 PNx 모델을 채택 했다. 이 PNx 모델 향상 된 생존 율 및 높은 재현성으로 시간이 적게 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight	World Precision Instruments	501758
WPI Swiss Tweezers #5 11 cm, 0.1x0.06 mm Tips	World Precision Instruments	504506
Jewelers #5 Forceps, 11cm, Straight, Titanium	World Precision Instruments	555227F
Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated	World Precision Instruments	15914
Tweezers #3, 11cm, 0.2x0.4mm Tips	World Precision Instruments	501976
Medesy Iris 4.5" Curved Scissors, Stainless Steel	Net23	3512	www.Net32.com
Dr. Slick Iris Scissors; 3.5"	Avid Max	220-1-965-IrisScsrs-P	www.Avid Max.com
Miltex Iris Scissors 4 1/8" Curved	4mdmedical	V95-306	www.4mdmedical.com
5" Hemostat clap, curved jaw	PJTool	4355	www.pjtool.com
sklar Knapp Iris scissors, straight and sharp/blunt 4"	Medical Device depot	64-3430	www.medicaldevicedepot.com
Kelly Hemostatic Forceps straight 5.5"	Pilgtimmedical	FA710-50	www.pilgtimmedical.com
C57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals Inc.
Mouse Handling Table and rectal thermometer	Visualsonics
MicroScan transducer	Vevo 1100	MS400
Vevo 1100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics Inc.
Cystatin C ELISA kit and mouse creatinine kit	Crystal Chem. Inc.
Mouse BUN ELISA kit	MyBioSource Inc