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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l'analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.

Abstract

Trasporto assonale e trasporto intraflagellare (IFT) sono essenziali per la funzione e la morfogenesi dell'assone e le ciglia. Dineina e chinesina superfamiglia delle proteine sono motori molecolari che regolano anterograda e retrograda trasporto, rispettivamente. Questi motori utilizzano microtubule network come rotaie. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo potente modello per studiare il trasporto assonale e IFT in vivo. Qui, descrivo un protocollo per osservare il trasporto assonale e IFT nella vita di c. elegans. Merce trasportata può essere visualizzato mediante codifica proteine cargo utilizzando proteine fluorescenti come proteina fluorescente verde (GFP). C. elegans è trasparente e proteine GFP-etichettato cargo possono essere espresso in cellule specifiche sotto promotori di cellula-specifico. Viti senza fine viventi possono essere risolto microsfere su gel di agarosio 10% senza uccidere o anestetizzare i vermi. In queste condizioni, movimento di carico può essere osservato direttamente negli assoni e ciglia di vivere c. elegans senza dissezione. Questo metodo può essere applicato per l'osservazione di qualsiasi molecola di carico in tutte le cellule modificando proteine bersaglio e/o le cellule in che si sono espressi. Le proteine più elementari quali motori molecolari e proteine adattatrici che sono coinvolti nel trasporto assonale e IFT sono conservate in c. elegans. Rispetto ad altri organismi di modello, mutanti possono essere ottenute e mantenute più facilmente in c. elegans. Combinando questo metodo con vari mutanti di c. elegans può chiarire i meccanismi molecolari del trasporto assonale e IFT.

Introduzione

Live cell imaging è uno strumento essenziale per l'analisi di trasporto intracellulare. Nella biologia delle cellule neuronali, sono essenziali per comprendere la funzione e la morfogenesi neuronale1analisi del trasporto assonale con formazione immagine di cellule vive. Difetti nel trasporto assonale sono alla base di disordini neurodegenerative diversi2. Dineina e chinesina superfamiglia proteine svolgere trasporto assonale anterograda e retrogradely, rispettivamente1,2.

Le ciglia sono un altro compartimento cellulare in cui la rete dei microtubuli e traffico macchine sono altamente sviluppato3. Macchinario di sintesi proteica non è localizzata nelle ciglia, il che significa che ciliare proteine devono essere trasportati dal citoplasma verso le punte di ciglia. Cilia-specifiche chinesina e dineina, chiamato chinesina-2 e citoplasmatici dineina-2, rispettivamente, i componenti di ciglia4, in un fenomeno chiamato trasporto intraflagellare (IFT)5di trasporto. Il danno dell'IFT causa uno spettro di malattie chiamate ciliopatie6. Così, per capire i meccanismi di base della formazione ciliare e la patogenesi sono necessaria analisi del meccanismo IFT da formazione immagine di cellule vive.

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e IFT7,8,9. Per osservare IFT, Chlamydomonas è stato ampiamente utilizzato come organismo modello5,6. Essendo un organismo unicellulare Chlamydomonas , il rapporto dell'IFT con invecchiamento, funzione di un neurone e comportamento sarebbe difficile da analizzare. Inoltre, tecniche di genetiche essenziale come CRISPR/Cas9 non siano state applicate a Chlamydomonas. Negli più alti organismi di modello, come topi e Drosophila, interruzione del trasporto assonale e IFT spesso provoca fenotipi letali perché trasporto assonale e IFT sono essenziali per la morfogenesi e l'omeostasi del animali 10, 11. Nel caso di topi, trasfezione e coltura delle cellule è generalmente necessario osservare trasporto assonale e IFT, che richiede molte competenze e tempo estesa12,13. Inoltre, un sacco di contesto fisiologico importante può essere perso in linee cellulari e cellule coltivate. Poiché il sistema nervoso non è essenziale per la sopravvivenza dei vermi, c. elegans mutanti in cui trasporto assonale o IFT sono interrotti non sono spesso letali7,9,14. Trasporto assonale e IFT può essere osservato direttamente in vivo senza dissezione perché c. elegans è trasparente ed è quindi facile osservare GFP-etichettato marcatori.

Esistono diversi protocolli per immobilizzare c. elegans, come l'utilizzo di un dispositivo di microfluidica15, pastiglie di agarosio con anestesia16o microsfere17. L'inclusione dell'anestesia può inibire gli eventi traffici in neuroni15. Un chiaro svantaggio del metodo microfluidici-periferica è che preparando un dispositivo microfluidico non è sempre facile. Invece, l'immobilizzazione di agarosio pastiglie e microsfere è un modo conveniente e facile per eseguire imaging lasso di tempo in c. elegans. Qui, descrivo questo protocollo di base per immobilizzare c. elegans e visualizzare trasporto assonale e IFT in vivo in elegans del c. Rispetto agli altri metodi, il metodo qui descritto non richiede attrezzature speciali ed è molto più economico e più facile da eseguire.

Protocollo

1. preparazione del campione

  1. genera un transgenico c. elegans ceppo di interesse utilizzando metodologie transgeniche 18. In alternativa, ottenere ceppi appropriati da Caenorhabditis Genetics Center (CGC). Per visualizzare il trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche, utilizzare la linea transgenica wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Per osservare IFT, ottenere la linea transgenica mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Questi ceppi sono utilizzati in questo protocollo.
    Nota: Una matrice extracromosomico, integrazione genomica o anche GFP knock-in works. Per ridurre i segnali di fondo, utilizzare promotori di cellula-specifico, piuttosto che pan-neuronale promotori.
    Nota: Manutenzione di worms è descritto in altri protocolli 20. Ceppi sono stati mantenuti su prati dell'alimentatore Escherischia coli OP50 sulla crescita del nematode piastre di terreno (NGM) (agarosio 1,7% (p/v), 50 mM NaCl, 0,25% (p/v) di peptone, 1 mM CaCl 2, 5mg/mL colesterolo, 25mm KH 2 PO 4, 1mm MgSO 4 su piatti di plastica di diametro 60 mm) a 20 ° C.
  2. Crescere i vermi a 20 ° C sulle piastre di NGM a qualsiasi fase del ciclo di vita dei vermi.
    Nota: Si può osservare sia trasporto assonale e IFT in qualsiasi fase. L4 tardivo a giovane adulto è un buon controllo positivo perché più pubblicazioni hanno utilizzato queste fasi e visualizzato in quel momento 22 eventi traffico 14 , 21 , , 23.

2. Preparazione del 10% dell'agarosi

Nota: molti fornitori offrono prodotti simili, quali polveri di agar agar e agarosio. Utilizzare agarosio per elettroforesi (resistenza del gel > 1200 g/cm 2). Polveri di agar a buon mercato non funzionano perché il gel risultante non è abbastanza forte per immobilizzare worm.

  1. Mix 0,4 g agarosio in 4 mL di acqua distillata acqua (DW) in un tubo di vetro (1,5 x 10,5 cm). Mettere un coperchio sul tubo di vetro per evitare l'evaporazione.
  2. Mettere il tubo di vetro su un blocco di calore di 95 ° C per 90 min. Inoltre, preparare un altro tubo di vetro (1,5 x 10,5 cm) riempito con DW e tenerlo a 95 ° C. mettere una pipetta Pasteur a 95 ° C DW ( Figura 1 A). Un sacco di piccole bolle sarà visibili nel tubo di agarosio e la soluzione deve essere torbida. Lasciare fino a quando la soluzione diventa chiara. Quindi, mescolare pipettando su e giù fino a quando la soluzione di agarosio diventa omogenea.
    Nota: Forno a microonde non può essere utilizzato per preparare la soluzione di agarosio 10% quando effettuata in DW e dell'agarosi. Piccole bolle causate dalle microonde evitare la fusione dell'agarosi. Tuttavia, gel di agarosio solidificato 10% facilmente possono essere fusi nuovamente utilizzando un forno a microonde. Tubi di vetro contenenti gel di agarosio al 10% possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 ° C per almeno 6 mesi. Se in questo modo, sciogliere il brodo utilizzando un forno a microonde quando necessario e iniziare dal passaggio 3 in questo protocollo.
    Nota: Agarosio perde gradualmente la capacità di solidificare se incubate a 95 ° C per un tempo lungo o dopo ripetute solidificazione e fusione. Se questo accade, preparare nuove 10% agarosio.

3. Preparazione di agarosio Pad

  1. usando la pipetta di Pasteur riscaldata preparata al punto 2.2, inserire 2 gocce di agarosio al 10% in una diapositiva di 76 x 22 mm.
  2. Rapidamente coprire con una seconda diapositiva 2 76 x 22 mm prima della caduta dell'agarosi si solidifica come mostrato in Figura 1 B e spingere verso il basso della seconda diapositiva per appiattire la soluzione di agarosio. Lo spessore deve essere di 0,5-1 mm.
  3. Rapidamente svuotare la pipetta di Pasteur di pipettaggio 95 ° C DW su e giù fino a quando la soluzione di agarosio è lavata fuori. In caso contrario, la pipetta sarà ostruirsi di gel di agarosio. Lasciare la pipetta a 95 ° C DW.
  4. Attesa per 1 min. Il pad di agarosio forma e diventa torbida. Quindi, far scorrere le diapositive apart a mano ( Figura 1 C).

4. Montaggio di vermi

Nota: anche piccole quantità di movimento verme prevenire buona osservazione. Levamisole è stato tradizionalmente usato per impedire il movimento della vite senza fine sull'agarosio pad 24 , 25. Tuttavia, Levamisole inibisce i recettori neuronali in c. elegans e pertanto può influenzare eventi di traffici in neuroni 15. Utilizzando microsfere di polistirolo descritto qui una buona alternativa 17.

  1. Sotto un microscopio stereo equipaggiato con una transilluminazione specchio scorrevole, trasferire ~ 30 vermi transgenici che esprimono gli indicatori appropriati per un nuovo NGM piastra senza batteri utilizzando un filo di platino pick.
    Nota: Un filo di platino pick è costituito da filo di platino e pipetta Pasteur (5 pollici), e la punta del filo platino è stata appiattita. La preparazione dei picconi filo di platino e la manipolazione di vermi con questi sono descritti in Wormbook (http://www.wormbook.org).
  2. Lasciare la piastra per 1 min. batteri vengono rimossi automaticamente dalle superfici di vermi come i vermi muoversi su gel di agarosio NGM senza batteri.
  3. Put a 0,5-1,0 µ l goccia del 2,6% 100 microsfere di polistirolo del diametro nm in acqua sul blocchetto di agar ( Figura 1 D). Consente di trasferire le microsfere 10-20 vermi dalla piastra di NGM esente da batteri. Goccia e la diffusione di worm usando il legare di platino pick per evitare la sovrapposizione di verme corpi ( Figura 1 E).
  4. Applicare un vetrino coprioggetti 2 di 22 x 40 mm ( Figura 1, F). Spingere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria, ma evitare di schiacciare le viti senza fine. Il campione è pronto per l'imaging.
    Nota: Poiché non è amministrata anestesia, vermi vengono risolti solo dalla forza di attrito generata da agar pad, microsfere di polistirolo e coprioggetto 17. La presenza di batteri di alimentatore e/o troppo soluzione renderà la forza di attrito più debole.
    Nota: Diverse dimensioni del lavoro di vetrini coprioggetti (ad es., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2). Tuttavia, le lamelle più grandi possono impedire immersione acqua o olio dalla lente dell'obiettivo che perde in campioni durante l'osservazione.

5. Osservazione

Nota: appropriati parametri di imaging (potenza laser, guadagno, binning, ecc.) saranno diverso per ogni sistema di microscopio e la fotocamera. Qui, viene utilizzato un microscopio widefield equipaggiato con uno scanner confocale del disco rotante e una macchina fotografica digitale del CCD.

  1. Impostare il controllo della temperatura della fase a 20 ° C, o regolare la temperatura a 20 ° C.
  2. Mettere il vetrino sul tavolino del microscopio. Utilizzare x 100 (apertura numerica = 1.3 o superiore) dell'obiettivo.
  3. Cercare le aree indicate in Figura 2 A (per wyIs251 e trasporto assonale) o Figura 2 B (per mnIs17 e IFT) come controlli positivi . Altre zone possono essere analizzati come ben 22.
  4. Set di parametri (CCD guadagno = 200, Binning = 1 o 2, potenza laser a 488 nm = 1.0-1.3 mW). Eseguire la registrazione continua a 4 fotogrammi/s per fino a 1 min Salva file come formato mutli-TIFF.
    Nota: Se GFP segnali scomparire ed è difficile continuare a osservare GFP::RAB-3 o OSM-6::GFP per 30 s, la potenza del laser è troppo forte. In tal caso, ridurre la potenza del laser. Al contrario, se non è registrato nessun movimento vescicolare, la potenza del laser è troppo debole. In tal caso, aumentare la potenza del laser.
  5. Osservare un worm diverso e ripetere 5.3 e 5.4. Le osservazioni possono durare fino a 20 min, ma ogni verme deve essere registrati una sola volta per evitare gli effetti di pdanni di Hoto.
    Nota: I vermi sono stati osservati per almeno 20 min senza difetti significativi 7 , 27 , 28. Osservazione più lunga può essere possibile, ma porto ' t stato ancora testato. Un chiaro segno della morte neuronale è il cambiamento della morfologia neuronale come gonfiore del neurite. Segnali deboli di GFP possono essere visto negli assoni e dendriti sia wyIs251 e mnIs17, morfologia del neurite può essere facilmente controllato da solo guardando gli assoni o dendriti. Morfologia neuronale è illustrato nella Figura 2.
  6. Generare filmati.
    1. Apri il file Multi-TIFF file utilizzando software di Fiji. Vai a File > Open quindi selezionare il file Multi-TIFF salvato al passaggio 5.4.
      Nota: Fiji può essere scaricato presso jttps://fiji.sc. Immagine J e plugin può anche essere utilizzato per generare chimografi. Se in questo modo, seguire le istruzioni pertinenti per il plugin scelto.
    2. scegliere la " selezione rettangolare " ( Figura 3 A, freccia) e seleziona l'area di interesse disegnando un rettangolo con un mouse del computer (rettangolo giallo in Figura 3 A). Vai a immagine > stack > strumenti > fare Substacks e selezionare i numeri di fetta che sono inclusi nel film. Viene generato un substack.
    3. Attivare la finestra di substack cliccando e passare all'immagine > regolare > luminosità/contrasto. Una finestra per regolare la luminosità e il contrasto si presenta. Nella finestra, fare scorrere la parte superiore bar (minimo) a destra così che il segnale di fondo sparisce e il secondo bar top (massimo) a sinistra così che le particelle e le vescicole commovente possono essere visto abbastanza bene sullo sfondo.
    4. Vai a immagine > stack > tempo Stamper. Come il film è registrato a 4 fotogrammi/s al punto 5.4, l'intervallo di tempo è 0,25 s. Quindi, digitare " 0.25 " nell'intervallo di.
    5. Generare un file di filmato selezionando Salva come > AVI dal menu File (film 1 e 2).
      Nota: Utilizzando il plugin appropriato, è possibile salvare il file come altri formati come " mpeg4 " o " mov " file.
  7. Generare chimografi.
    1. Aprire i file del filmato originale utilizzando software di FIji nuovamente e ripetere i passaggi 5.6.2 e 5.6.3 per regolare la luminosità e il contrasto.
    2. Clic " segmentato linea " ( Figura 3 B, freccia). Usando un mouse, disegnare una linea segmentata lungo le ciglia o assone (linea gialla, in Figura 3 B).
    3. Andare a analizzare > Multi Kymograph > Multi Kymograph ( Figura 3 C). Linea larghezza finestra ( Figura 3 D). Tipo " 3 " nella finestra di Linewidth e fare clic su OK ( Figura 3 D).
    4. Kymograph finestra viene creata. Salvare l'immagine in formato TIFF o JPEG.

Risultati

Trasporto assonale nel neurone DA9
Utilizzando la riga di wyIs251 , l'anterograda e il trasporto assonale retrogrado di GFP::RAB-3 possa essere registrata simultaneamente nel neurone motore DA9. La velocità media di anterograda e retrograda trasporto nell'assone dorsale prossimale del neurone DA9 è circa 1,8 e 2,6 μm/s, rispettivamente22. Il numero delle vescicole commovente è circa 0,03 e 0,018 a μm di assone a s. Così, per un'os...

Discussione

Limitazione per quanto riguarda i metodi esistenti
Il metodo qui descritto è ottimizzato per osservare eventi veloci come trasporto assonale e IFT. Così, l'immobilizzazione è più una priorità di incubazione più lungo. Mentre siamo stati in grado di osservare eventi di traffici per almeno 20 min senza perturbazione significativa, questo metodo potrebbe non essere sempre adatto per osservare eventi lenti che richiedono osservazioni più lungo, ad esempio allungamento dell'assone e migrazione cellu...

Divulgazioni

L'autore non ha nulla di divulgare.

Riconoscimenti

L'autore ringrazia profondamente Dr. Asako Sugimoto (Università di Tohoku) per la sua discussione utile. wyIs251 era un dono generoso da Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 è stato fornito dalla CGC, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Questo lavoro è stato supportato da grant JSPS KAKENHI #17 H 05010 e #16 H 06536 e Fondazione di Daiichi Sankyo, Brain Science Foundation e Naito Foundation.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Slideglass (76  x 26 mm)MatsunamiS1111
Coverglass (22  x 40 mm)MatsunamiC024401
AgaroseWako318-01195
Polystylene microbeads 0.1 micronPolysciences#00876
Heat blockTAITEC0063288-000CTU-mini
MicroscopeOlympusIX-71widefield microscope
Spinning disk ScannerYokogawaCSU-X1spinning disc confocal scanner 
Digital CCD cameraHamamatsu PhotonicsC10600-10BORCA-R2 degital CCD camera
Objective lens (x100, NA1.4)OlympusUPLSAPO 100XO
Pasteur pipette (5 inch)IWAKIIK-PAS-5P
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)IWAKI9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251Laboratory of Kang ShenN/A
OTL11: mnIs17Ref. 27, 29N/ASP2101 was backcrossed with wild type for 6 times
Stereo microscopeCarl Zeiss435064-9000-000STEMI 508 
Mirror transillumination unitCarl Zeiss435425-9010-000
platinum wire (0.2 mm)Nilaco Corporationm78483501
60 mm plastic dishFalcon#351007
FijiN/AN/Ahttps://fiji.sc/
nematode growth medium (NGM)  1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 

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