Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse

Riepilogo

È stato introdotto un metodo per il trapianto omentale di isolotti in un mouse. Gli isolotti isolati sono mescolati con idrogel e la miscela viene inserita nel sacchetto omentale di un topo diabetico. Quindi, il glucosio nel sangue è controllato e viene eseguita l'analisi immuno-istochimica.

Abstract

Trapianto dell'isolotto è stato proposto per essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Convincente la prova recente indica che l'infusione intravascolare isolotto è tutt'altro che ideale e di conseguenza, l'omento sta riemergendo come un sito potenzialmente importante per trapianto dell'isolotto. Questo esperimento richiede l'isolamento degli isolotti di alta qualità e l'impianto degli isolotti ai destinatari diabetici. Trapianto al omento richiede passaggi chirurgiche che possono essere meglio dimostrati visivamente. Qui, vengono presentati i passaggi dettagliati per questa procedura. Qui sono descritti due metodi di miscelazione isolotti isolati con idrogel prima di mettere la miscela nel sacchetto omentale di topi diabetici. Idrogeli differenti sono utilizzati per le diverse condizioni. Livelli di glucosio nel sangue dei destinatari di topo diabetico di isolotti syngeneic nell'omento sono stati controllati per fino a 35 giorni. Alcuni animali sono stati sacrificati dopo 14 giorni per eseguire analisi immuno-istochimica. Questo approccio pre-clinica di trapianto può essere utilizzato come dati preliminari che portarono alla traduzione a trapianto clinico.

Introduzione

Secondo l'International Diabetes Federation (IDF), diabete mellito colpisce attualmente 382 milioni di persone, con un aumento previsto di persone 592 milioni di 2035¹. In entrambi trapianto di insule pancreatiche allogeniche e xenogeniche, terapia immunosoppressiva sistemica è necessaria. Senza immunosoppressione, rigetto immunitario è delle principali cause di perdita di innesto². C'è anche un significativo problema di perdita dell'isolotto trapiantato dovuto il sangue istantaneo mediata reazione infiammatoria (IBMIR)^3,4. Tuttavia, anche in assenza di una risposta immunitaria come syngeneic o modelli di auto-trapianto, cellule delle isole trapiantate nel fegato tramite la vena portale sono persi a causa di infiammazione e/o a condizioni ambientali sfavorevoli, come sangue povero alimentazione con ridotta ossigenazione e/o sostanze nutritive^5,6. Di conseguenza, al fine di garantire a lungo termine funzione metabolica, numeri più alti dell'isolotto sono necessari per compensare la perdita di cellule iniziali che riduce il engraftment⁷.

Nel tentativo di ottimizzare attecchimento dell'isolotto, diversi siti anatomici alternativi sono stati studiati sperimentalmente come pure clinicamente, con promettenti, ma non definitivo risultati⁸. Considerando che alcuni dei siti alternativi offrono un accesso facile e sicuro (ad es., pelle, capsula del rene, submucosa gastrico e camera anteriore dell'occhio) o una superficie più ampia per grandi masse dell'isolotto (ad es., cavità peritoneale), sopravvivenza e fisiologico prestazione metabolica delle isole trapiantate sono ancora limitate e rimangono una preoccupazione⁹. La ricerca di un sito più adatto per attecchimento dell'isolotto è in corso.

L'omento è stato tra i tanti siti anatomici che sono stati studiati nello sviluppo iniziale di trapianto dell'isolotto e si è rivelati un ambiente di successo per gli isolotti^{10,11,12,13, 14}. Tuttavia, infusione intraportal isolotto è diventato il clinico dovuto scelta in parte per la relativa semplicità della procedura e primi successi nell'animale modelli⁶. Inoltre, in parte, gli aspetti negativi associati con questo sito, particolarmente massiccia perdita iniziale dell'isolotto, erano meno comprensibili e meno vincolante nei primi giorni di trapianto dell'isolotto sperimentale come il campo maturata. Con più recente prova coercitiva che indica che l'infusione intravascolare isolotto è ben lungi dall'ideale, omento sta riemergendo come un sito potenzialmente importante per trapianto di cellule.

L'omento (sotto forma di un sacchetto omentale) offre vantaggi relativi sopra il fegato^15,16. È bene-vascularized e facilmente accessibile. Esso consente il recupero di innesto (se necessario) e/o biopsia. Il periodo ischemico sperimentato dagli isolotti è ridotto rispetto al fegato, e l'omento può accettare relativamente masse di grande isolotto che non è possibile intraportally, dove un aumento della pressione portale possono causare complicazioni.

Un modello syngeneic del topo del trapianto è stato usato nel protocollo testato nello studio, che impiegano i topi maschii C57BL/6 tra 6 – 8 settimane con un peso corporeo di 20 – 25 destinatari dell'isolotto di g. sono stati resi diabetici con una singola iniezione dello streptozotocin con una dose di 250 mg/kg ip. L'induzione del diabete può essere considerato riuscito se il livello di glucosio nel sangue del mouse è maggiore di 24 mmol/L 48 h dopo l'iniezione e rimane sopra quel livello per un minimo di 5 giorni.

Isolotti syngeneic sono stati isolati dal pancreas di pari età donatori seguendo metodi precedentemente pubblicati con alcune modifiche. In breve, la collagenasi è stato iniettato nella vescica di scorticatura invece il dotto biliare. Questo è stato fatto come un miglioramento per facilitare la facilità di iniezione. Collagenasi infusione è stata seguita da incubazione, la rottura del tessuto, separazione di gradienti di densità e raccolta a mano per ottenere puri isolotti. Gli isolotti sono stati coltivati durante la notte in CMRL-1066 supplementato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) in matracci T175 a 37 ° C, meno 95% aria - 5% CO₂ prima del trapianto.

Protocollo

Tutti i topi utilizzati in questo studio sono stati ottenuti dal centro medico animale di Guangdong. L'uso degli animali è stato approvato dall'ospedale del popolo secondo Shenzhen di comitato recensione etica, secondo i principi del benessere degli animali.

1. islet trapianto al omento

Nota: Questo protocollo richiede 2 persone compire.

1. Assemblare materiali chirurgici che sono elencati nella tabella 1. Preparare campo asettico in area chirurgica con materiali sterili quali tende e USA e getta e mantenere condizioni asettiche durante la chirurgia. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici. Indossare abiti da sterile.
2. Scegli gli isolotti utilizzando una punta di pipetta 200 µ l sotto lo stereomicroscopio. Ogni mouse riceverà 450 – 500 isolotto equivalente (IEQ) a tansplant. Per ogni animale, posto abbastanza isolotti per un singolo trapianto in un tubo di snap-top sterili da 1,5 mL con 100 µ l di terreno di CMRL-1066.
   Nota: Gli isolotti possono essere isolati il giorno del trapianto, ma è meglio isolarli il giorno prima per permettere il recupero per il processo di isolamento.
3. Mantenere le provette snap-top con isolotti su ghiaccio fino al momento del trapianto.
4. Scongelare l'idrogel di matrice della membrana dello scantinato e tenerlo sul ghiaccio dopo averlo tolto dal congelatore a-20 ° C. L'idrogel è liquido a 4 ° C a 10 ° C e si solidifica a temperature più elevate.
5. Pesare e tag tutti i topi diabetici di destinatario. Iniettare sodio pentobarbital 60 mg/kg per via intraperitoneale. Prova la profondità dell'anestesia con la somministrazione di un pizzico di punta. Dare un sodio pentobarbital ulteriori 10 mg/kg se l'animale reagisce per il pizzico. Se non c'è nessun ritirare riflesso, il livello di anestesia è corretto per la chirurgia.
6. Tamponare il sito chirurgico sull'addome con etanolo al 70%. Radersi i capelli dal sito con una lama di razer e disinfettare la zona con iodoforo. Amministrare veterinario unguento per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
7. Utilizzare le forbici oftalmiche per aprire l'addome lungo la linea mediana dell'addome con un'incisione di 4-5 cm. mossa gli intestini al lato sinistro e coprire con garza imbevuta salina per prevenire la disidratazione eccessiva durante la procedura di chirurgia.
8. Utilizzare tamponi di cotone per completamente esporre il campo visivo dello stomaco e individuare l'omento (situato sotto lo stomaco). Utilizzare due coppie di una pinzetta per distendere l'omento. Fare attenzione a evitare danni dallo strappo.
9. L'idrogel è completamente sciolto a questo punto. Girare il tubo con gli isolotti per 30 s a 200 x g e rimuovere il surnatante. 50 µ l di idrogel di aspirare, aggiungerlo nella provetta contenente gli isolotti e risospendere il mix delicatamente evitando la formazione di bolle. Mantenere i tubi sul ghiaccio durante la procedura.
10. Utilizzare due paia di pinze per prendere i bordi dell'omento e sollevarlo delicatamente per formare una scanalatura tra la parete gastrica e dell'intestino che può ospitare un piccolo volume di liquido con l'innesto dell'isolotto.
11. Lasciate che la seconda persona assistere nella procedura e aspirare la miscela di sedimento dell'isolotto-idrogel (l'intero contenuto del tubo) con una punta di pipetta 200 µ l, distribuire il contenuto nella scanalatura.
12. Assicurare che la miscela sia ben posizionata nella scanalatura delicatamente alzando o abbassando i bordi dell'omento. Completo di posizionamento della miscela all'interno di 3 min prima l'idrogel si solidifica come un effetto della temperatura corporea. Dopo aver impostato l'idrogel, piegare l'omento per coprire l'innesto.
    Nota: omento aderirà alla parete gastrica circostante come l'idrogel si solidifica.
13. Dopo l'idrogel è completamente solidificato, utilizzare tamponi di cotone per riposizionare l'intestino nella cavità addominale, facendo attenzione a non per toccare il sito di trapianto.
14. Aggiungere 20 µ l di cefalosporina (5 ~ 10 mg) nella cavità addominale per prevenire l'infezione, quindi utilizzare sutura 4-0 per chiudere l'addome.
15. Tornare il mouse alla sua gabbia e ripetere tutti i passaggi per ogni destinatario del mouse. Tenere in caldo i topi e monitorare visivamente fino a quando non riacquistano pienamente sufficiente coscienza per mantenere decubito sternale. Tenere i topi separati dagli altri animali fino a quando non hanno pienamente recuperato.
16. Iniettare 50 µ l di sodio cefazolina (0,05 mg/mL) ogni giorno per una settimana come profilassi post-operatoria. Amministrare la lidocaina + buprenorfina, vale a dire applicare 1-3 gocce di 0,25% lidocaina al sito di incisione per via topica prima del posizionamento delle clip di ferita. Amministrare Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) la via della intraperitoneale (IP).
17. Misurare il livello di glucosio nel sangue non a digiuno da un campione di sangue della vena caudale utilizzando un misuratore di glucosio del sangue una volta al giorno dopo il trapianto. Quando trapiantare l'omento, l'innesto dell'isolotto può avere una funzione in ritardo e non raggiungere un livello di glucosio nel sangue completamente normale per 2 – 3 settimane.
18. Per istologia, rimuovere l'innesto omentale dal mouse alla fine dell'esperimento dopo il trapianto. Difficoltà il tessuto secondo i protocolli istologici. L'innesto può essere analizzato per immunostaining o immunofluorescenza studi.

2. in alternativa per il trapianto al omento

Nota: Un idrogel di fibrina-trombina alternativo che viene utilizzata a temperatura ambiente può essere sostituito per l'idrogel di matrice della membrana dello scantinato. Si compone di 2 componenti, una soluzione di proteine del sigillante di fibrina (50 U/mL trombina e fibrinogeno di 10 mg/mL). Quando i componenti vengono miscelati, formano un coagulo che trattiene gli isolotti in posizione.

1. Utilizzare l'idrogel di fibrina-thombin composto a temperatura ambiente. Come descritto al punto 1.2, ogni mouse riceverà 450 – 500 equivalenti di isolotto (IEQ) per trapianto. Posizionare gli isolotti in un tubo di snap-top sterili da 1,5 mL con 100 µ l di terreno di CMRL-1066. Immediatamente prima del trapianto, aspirare gli isolotti in una tubazione PE50 sterile per una lunghezza di 10 cm e centrifugare delicatamente (30 s a 200 x g) per formare un pellet sciolto.
2. Preparare l'animale come indicato in precedenza (passaggi 1.5-1.8) con l'omento sparso. Miscelare i componenti di idrogel (10 µ l/CAD) e posizionare il omento. (Figura 3D)
3. Espellere immediatamente gli isolotti dal tubo sull'idrogel. L'idrogel forma un coagulo intorno gli isolotti. (Figura 3E)
4. Ripiegare l'omento l'idrogel e isolotti per formare un sacchetto. (Figura 3F) Continuare con i passaggi 1.13 a 1.18.

Risultati

Stato post-digestivo del pancreas è illustrato nella Figura 1A. Purificata isolotti sono mostrati in Figura 1B. Ditizone macchiatura e test di vitalità degli isolotti sono mostrati nella Figura 2. Le fasi principali del trapianto dell'isolotto di omento sono mostrate nella Figura 3. Il glucosio nel sangue dei destinatari dopo trapianto omentale sono mostrati in

Discussione

Trapianto dell'isolotto al fegato tramite la vena portale è il più diffuso metodo di trapianto dell'isolotto in esseri umani, ma ci sono ancora problemi di efficienza e sicurezza come vena portale trombosi e fegato steatosi¹⁷. Studi recenti dimostrano che l'omento può essere un'alternativa adatta per il fegato, ma più ricerca deve essere condotta prima della traduzione clinica^12,14,18,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5 inch (12-13 cm) Scissors	RWD Life Science	S12030-11
Fine Forceps	RWD Life Science	F11010-13
Small wound clips	RWD Life Science	R33003-01
Acutenaculum	RWD Life Science	F31044-13
2 pair tissue forceps	RWD Life Science	F13023-10
4-0 Suture with needle	Chenghe, China	17094
200 μL Pipette and tips	Gilson	PN11
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
razor blade	Philips	HC1099/15
Material and animals
Pentobarbital Sodium	Sigmaaldrich.com	P3761	For anesthesia
Hydrogel	bdbiosciences.com	356234	Basement Membrane Matrix
Fibrin-Thrombin Hydrogel	Baxter.com	1501250	Components clot when mixed
70% Ethanol	Yingniu medical, Anhui, China	23170608
Iodophor	Lierkang medical technology, Shangdong, China	170521
Normal saline	Baxter.com	2B1324
Cephalosporin	Lukang medical, Shangdong, China	150303
Cefazolin	Baxter.com	2G3508
lubricant eye ointment	Major Pharmaceuticals	203964
streptozotocin	Sigmaaldrich.com	S0130
collagenase Type V	Sigmaaldrich.com	C9262
CMRL-1066 media	celltrans, Wenzhou, China	X018D1
histopaque	Sigmaaldrich.com	10771	density gradient
PE50 tubing	Braintreesci.com	PE50 100 FT	Polyethylene .023" x .038
Calcein AM	Sigmaaldrich.com	C1359
Propidium iodide	Sigmaaldrich.com	P4864
optimal cutting temperature compound (OCT)	Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL	4583	embedding medium
insulin antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	8138S
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	14166S
eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	D1306
C57Bl/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province	/
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
T175 flasks	Falcon	353112
1.5 mL Snap-top tubes	Axygen	MCT-150-C