Labyrinthectomy chirurgica del ratto per studiare il sistema vestibolare

Riepilogo

Questo protocollo descrive la labyrinthectomy chirurgica di un topo, che è un metodo utile per lo studio del sistema vestibolare.

Abstract

Per studiare il sistema vestibolare o il processo di compensazione vestibolare, un numero di metodi è stato sviluppato per causare danno vestibolare, tra cui labyrinthectomy chirurgica o chimica e neurectomia vestibolare. Labyrinthectomy chirurgica è un metodo relativamente semplice, affidabile e rapido. Qui, descriviamo la tecnica chirurgica per ratto labyrinthectomy. Un'incisione postauricular fatta in anestesia generale per esporre il canale uditivo esterno e la membrana timpanica, dopo di che la membrana timpanica e gli ossicini vengono rimossi senza stapes. L'arteria dello stapes, che si trova tra la staffa e la finestra ovale, è una struttura vulnerabile e dovrà essere conservato per ottenere un campo chiaro chirurgico. Un buco a fenestrate il vestibolo è realizzato con una fresa trapano 2,1 mm superiore a stapes. Poi, 100% etanolo è iniettato attraverso questo foro e aspirato più volte. Dissezione meticolosa sotto un microscopio e un attento controllo del sanguinamento sono essenziali per ottenere risultati affidabili. Sintomi di perdita vestibolare, quali nistagmo, inclinazione testa e un movimento di rotolamento, sono visibili immediatamente dopo la chirurgia. Il test di sedia rotarod o rotazione può essere utilizzato per oggettivamente e quantitativamente valutare la funzione vestibolare.

Introduzione

L'organo vestibolare è essenziale per il controllo di equilibrio e con gli occhi. Una normale funzione vestibolare dipende simmetrici segnali afferenti dagli organi vestibolari nei due orecchi interni. Ipofunzione vestibolare o perdita induce vertigini, nistagmo e squilibrio posturale. Dopo danno acuto, la funzione vestibolare recupera spontaneamente entro alcuni giorni, un processo conosciuto come il compenso vestibolare^1,2. Il compenso vestibolare dei deficit statico è un processo di recupero legata allo squilibrio dell'attività spontanea che riposa fra i nuclei vestibolari ipsilaterale e controlaterali. Il compenso vestibolare dei deficit dinamico avviene principalmente tramite sostituzioni sensoriali e comportamentali (utilizzando input visivo o somatosensoriali)³. Questi processi sono attraenti per plasticità neuronale studi^4,5.

Un numero di metodi è stato sviluppato per studiare il sistema vestibolare e i meccanismi alla base della plasticità neuronale durante il compenso vestibolare, come labyrinthectomy chirurgico e chimico e neurectomia vestibolare^{5,6 ,7,8}. Neurectomia vestibolare è un certo modo di indurre perdita vestibolare completa, ma è una procedura più complessa e invasiva e può indurre danni cerebrali^8,9. Questo metodo richiede una maggiore abilità chirurgica e richiede più tempo che labyrinthectomy. Labyrinthectomy chimici, tra cui la gentamicina, arsanilate e tetracaina, è più facile e può produrre risultati affidabili^10,11,12. Tuttavia, la coclea può anche essere danneggiata e perdita vestibolare può svilupparsi nel tempo¹¹. Inoltre, gli effetti delle sostanze chimiche sul cervello, che deve essere conservato per una valutazione accurata, sono poco chiari. Labyrinthectomy chirurgico è stato introdotto negli studi sugli animali in 1842¹⁵ e in primo luogo è stato segnalato nel ratto in 1936¹⁶. Questa tecnica è stata usata da allora in molti animale studia^5,17,18,19. Labyrinthectomy chirurgica è un metodo specifico, affidabile e relativamente semplice. ^{13 , 14} inoltre, i sintomi di danno vestibolare sono visti immediatamente dopo la chirurgia. Qui, descriviamo la nostra tecnica chirurgica per ratto labyrinthectomy.

Protocollo

Questo studio è stato svolto in conformità delle istituzionali Animal Care e uso Comitato di Seoul National University Hospital (14-0148-C1A1), che è accreditato dall'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care Internazionale.

Nota: Gli esperimenti sono stati condotti su ratti maschi Sprague-Dawley (deviazione standard) del 7-8 settimane di età (200/250 g). Ogni animale è stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per 1 settimana prima dell'inizio dell'esperimento. Gli animali sono stati alloggiati in una camera a temperatura e umidità controllata con una costante 12-h:12-h chiaro: scuro ciclo con libero accesso a cibo e acqua.

1. Labyrinthectomy

1. Coprire gli strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave con un tampone sterile. Disinfettare la zona operativa con etanolo al 70%. Utilizzare un telino sterile e mantenere condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico.
2. Indossare un abito, maschera (per coprire naso e bocca), PAC (per coprire la testa) e un paio di guanti sterili. Gli strumenti chirurgici devono solo venire a contatto con superfici sterili.
3. Iniettare l'anestetico zolazepam tiletamina (40 mg/kg di peso corporeo) per via intramuscolare nella coscia mediale o intraperitonealmente e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) per via intramuscolare o per via intraperitoneale.
   Nota: Altre modalità di anestesia generale, incluse inalazione isoflurane, può anche essere utilizzato.
4. Posto il ratto su un tappetino riscaldante (inizialmente fissato a 42 ° C). Applicare unguento oculare lubrificante in entrambi gli occhi del ratto per prevenire la secchezza dell'occhio mentre sotto anestesia.
5. Posto il ratto sul suo lato destro. Radere il pelo nella zona chirurgica con tosatrici. Disinfettare il sito con etanolo al 70%.
6. Iniettare 1% lidocaina cloridrato per via sottocutanea nella zona retroauricular sinistra.
7. Utilizzando una lama per bisturi #15, fare un'incisione di retroauricular cm ~5.0. Separare il muscolo e la fascia di esporre il canale uditivo esterno con forbici Iris (Figura 1A). Aprire leggermente il canale uditivo esterno utilizzando la lama #15 o le forbici Iris (Figura 1B). Ampiamente esporre la membrana timpanica (Figura 2A).
8. Sotto un microscopio (7.5 X o 12,5 X), rimuovere la membrana timpanica e gli ossicini ad eccezione dello stapes, usando il forcipe. Staccare i muscoli sul crinale lambdoidal con la lama #15 o le forbici Iris (Figura 2B).
9. Utilizzando un trapano a bassa velocità (< 3000 giri/min) con una fresa diamantata (2.1 o 1,4 mm), forare l'osso timpanico bulla attorno al punto di uscita del nervo facciale (Figura 3A). Identificare l'arteria stapediali. Fare attenzione a non per danneggiare l'arteria stapediali durante il processo di perforazione.
10. Continuare ad esplorare il vestibolo superiore all'arteria stapediali ed esporre la finestra rotonda e il canale semicircolare laterale ossuto. Aprire il canale semicircolare laterale vicino alla sua ampolla. Continuare ad esplorare nel piano del canale semicircolare laterale e forare l'ampolla del canale semicircolare superiore.
11. Aspirare il contenuto del vestibolo utilizzando un ago 18-G o 22-G. Iniettare e aspirare 1 cm³ di etanolo 100% 3 x.
12. Chiudere i muscoli e la pelle in due strati con i suturare interrotti semplici.
13. Non lasciare incustodito un animale fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Mantenere caldo il ratto fino a quando non risveglia con un rilievo di riscaldamento o una lampada di calore. Dopo il risveglio, spostare il ratto in una gabbia individuale in una sala con le solite condizioni ambientali.
14. Somministrare antibiotici (ad es., Cefazoline 20 mg/kg, trimetoprim-sulfonamide 100 µ l per via sottocutanea, o penicillina 300.000 IU) come necessario il giorno 1; un analgesico (non un oppioide; ad esempio, Metacam 2mg/kg, Carprofen 5 mg/kg per via sottocutanea) può anche essere somministrato.

2. sham chirurgia

1. Per la chirurgia di sham come controllo, eseguire le stesse procedure chirurgiche e post-chirurgiche (secondo la sezione 1), tra cui l'esposizione del canale uditivo esterno e la membrana timpanica (punto 1.7), la rimozione della membrana timpanica e gli ossicini e la distacco dei muscoli sul lambdoidal colmo (passo 1,8), ma non aprire il canale semicircolare o iniettare etanolo.

3. controllare la perdita della funzione vestibolare

Nota: La perdita della funzione vestibolare può essere valutata utilizzando sia le prove di funzione comportamentale o vestibolare. ^{13 , 17 , 18} prove comportamentali includono la valutazione della asimmetria posturale e nistagmo.

1. Identificare asimmetria posturale che comprende spontanei o evocati barile-rolling, che cade sul lato sinistro, o muoversi mentre sporgendosi verso il lato leso¹⁸. Guarda il Video 1.
2. Identificare il nistagmo da un controllo visivo del movimento di occhio volontaria. Quando il nistagmo spontaneo è assente in stato di riposo, soffio aria delicatamente sopra la testa dell' animale¹⁸. Guarda il Video 2.

Risultati

Il successo della chirurgia è stato convalidato da test comportamentali. Tutti gli animali hanno esibito il comportamento tipico di una perdita della funzione vestibolare unilaterale. Barile-rotolamento spontaneo era evidente subito dopo della chirurgia, essere evocato da un soffio di aria sopra la testa o un tocco leggero al corpo nella fase iniziale di recupero (Video 1). 3 d dopo la chirurgia, gli animali spostati sporgendosi verso il lato leso con occasionali cade su...

Discussione

Questa tecnica è un metodo utile per la creazione di perdita di funzione vestibolare improvvisa, permanente e completa. Questo potrebbe essere utilizzato per lo studio di patologie vestibolari, come neurite vestibolare, un tumore acustico e la malattia di Meniere. Molti studi hanno utilizzato questa tecnica per studiare la plasticità neuronale dei nuclei vestibolari o il relativo processo centrale^5,17,18,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ASPIRATOR KB-012	KOH BONG & CO., LTD.	KB-012	Medical aspirator
Blade: #15	Fine Science Tools	#10015-00	Blades for #7 Scalpel Handles, #15
Carbon Steel Burrs	Fine Science Tools	#19007-05	shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs
Carl Zeiss Surgical GmbH	Carl Zeiss	#6627100863	Surgical microscope
Dumont #3c	Fine Science Tools	#11231-20	Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm
Dumont #5SF	Fine Science Tools	#11252-00
Dumont #7B	Fine Science Tools	#11270-20	Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm
Extra Fine Bonn: straight	Fine Science Tools	#14084-08	Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification
Fine Iris Scissors: straight	Fine Science Tools	#14094-11	Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium
Finger Loop Ear Punch	Fine Science Tools	#24212-01	1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system
Hartman	Fine Science Tools	#13002-10	Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm
Short Scalpel Handle #7 Solid	Fine Science Tools	#10003-12	#7 short, 12 cm
Small Vessel Cauterizer	Fine Science Tools	#18000-03	Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats
Strong 207S	SAESHIN	207S	Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller
Suction Tubes	JEUNGDO B&P CO., LTD.	H-1927-8	Frazier, 18 cm
VICRYL	ETHICON	W9570T	Synthetic absorbable sterile surgical suture
Weitlaner-Locktite	Fine Science Tools	#17012-13	Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm
Zoletil	Virbac, France		Tiletamine-zolazepam
Rompun	Bayer		Xylazine
Rimadyl	Pfizer		Carprofen
Septra	Pfizer		Trimethoprim-sulfonamide