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  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo un metodo per rilevare 3-nitrotirosina modificazioni chimiche delle proteine atmosferiche con 6 mm di diametro giri tagliati da prefiltri campionatore di aria mediante un rivelatore di elettrochimica per la cromatografia liquido ad alte prestazioni (HPLC-ECD).

Abstract

3-nitrotirosina (3-NT) è generata dai residui della tirosina in bio-aerosol atmosferico proteine tramite una reazione con ozono (O3) e biossido di azoto (NO2). Stabile 3-NT è un marker specifico per danno ossidativo ed è segnalato per avere un effetto promotore di suscitare allergie. Nello studio presente, segnaliamo lo sviluppo di un test altamente sensibile per quantificare 3-NT in filtri di campionatore di aria per raccogliere < 2,5 µm di particolato (PM2.5) dall'aria dell'ambiente urbano, tra cui bio-aerosol. In questo metodo, un 6 mm di diametro foro rotondo è stato tagliato dai filtri di campionatori di aria e mescolato con un cocktail di proteasi non specifiche al fine di idrolizzare proteine. Campioni di proteine digeriti al livello dell'amminoacido sono stati testati per 3-NT mediante un rivelatore di elettrochimica per la cromatografia liquido ad alte prestazioni (HPLC-ECD). Il contenuto massimo di 3-NT è stato rilevato in un prefiltro per PM di dimensioni da 4.5 a 7.3 μm, con un limite di rilevazione di 1,13 pg/m3.

Introduzione

Aerosol o airborne PM contiene proteine da varie origini biologiche, tra cui virus, procarioti, funghi, piante (polline) e animali (insetti, umani)1. Il rapporto del contenuto proteico in PM è stimato in circa il 5%, che è stato implicato per giocare un ruolo importante come un allergene disperso nell'aria2. I rapporti recenti suggeriscono che aerosol ambiente urbano di varie dimensioni contengono aminoacidi con rapporti compresi tra 0.5% e 2%3. Inoltre, le modifiche chimiche delle proteine di PM sono state suggerite per essere generata dalle reazioni delle proteine con varie sostanze inquinanti, come ad esempio3O, biossido di azoto (NO2) e anidride solforosa (SO2)4.

3-NT — una modifica della proteina — generato dalla nitrazione di residui di tirosina. Una maggiore concentrazione di O3 e non2 ha dimostrata di promuovere la nitrazione delle molecole proteiche in spazio pseudo-atmosferico5,6. La nitrazione di residui di tirosina nella catena del polipeptide migliora il potenziale allergenico di polline proteine7. Così, la quantificazione e la valutazione di airborne 3-NT è un aspetto importante nell'affrontare le preoccupazioni di salute ambientale.

3-NT è anche conosciuto come un biomarcatore di ossidativo e nitrosativo stress8. Un corpo emergente di prova ha mostrato un'associazione significativa del contenuto 3-NT con parecchie malattie umane9,10. A causa dei suoi effetti nocivi, la rilevazione e la valutazione quantitativa di 3-NT in un campione biologico tenere grande rilevanza nel determinare la condizione di salute di un individuo. Negli ultimi anni, sono stati introdotti diversi metodi per stimare il contenuto di 3-NT, tra cui analisi enzima-collegate dell'immunosorbente, HPLC e LC/MS11. Negli studi precedenti, abbiamo segnalato un metodo di rilevamento utilizzando la tecnica HPLC-ECD elargita con diversi vantaggi rispetto ai metodi precedenti. Ad esempio, l'HPLC-ECD non richiede una procedura di estrazione o derivatizzazione che lo rende un sistema di analisi relativamente semplice12. Abbiamo confermato che questo metodo è applicabile per rilevare 3-NT da campioni biologici (plasma da umano e del ratto).

Anche se molte indagini hanno evidenziato la rilevazione di 3-NT in campioni biologici, sua rilevazione nei campioni della resta sfuggente, e quindi lo studio presente è stato perseguito. In effetti, per valutare l'effetto nocivo di airborne 3-NT, un metodo quantitativo che è utile per rilevare 3-NT direttamente da particelle sospese nell'aria è richiesto; di conseguenza, abbiamo applicato il metodo HPLC-ECD per rilevare 3-NT da PM2.5 raccolti su un filtro di fibra di vetro. Utilizzando la tecnica, 3-NT potrebbe essere rilevata direttamente da piccoli pezzi (6 mm di diametro fori tondi) del campione da un filtro di raccolta di PM. Abbiamo ulteriormente valutati il contenuto di 3-NT per vari formati di PM e misurato il limite di rilevazione di 3-NT. Il presente articolo propone un metodo di alto-rendimento e ad alta sensibilità per rilevare 3-NT direttamente da campioni biologici e di queste.

Protocollo

1. collezione di totale sospensione particelle, PM2.5, o PM7e il metodo dell'idrolisi per PM proteine

  1. Raccogliere il PM da un filtro prefiltro o di backup.
    1. Prima della raccolta delle particelle in sospensione totale (TSP), PM2.5e PM7, pesare il filtro quartz.
      Nota: Dato che la contaminazione da PM proteine e peptidi non dovrebbe influenzare la rilevazione di nitrazione della tirosina (perché hanno un gruppo nitro), noi non trattare il filtro al quarzo ad alta temperatura prima della misurazione. Inoltre, 3-NT contenuto nel filtro al quarzo era sotto il limite di rilevamento, come determinato da HPLC-ECD.
    2. Impostare il filtro quartz su un campionatore d'aria ad alto volume con un selettore di dimensione delle particelle per raccogliere PM7 ad una portata di 1.000 L/min continuamente per 7 d (Figura 1B). TSP può essere raccolto su un filtro di quarzo senza un selettore di dimensione (Figura 1A).
    3. Raccogliere PM2.5 utilizzando un campionatore a basso volume con un'unità di classificazione formato ad una portata di 116 L/min continuamente per 7 d. utilizzando questa unità, le particelle possono essere classificate come PM4.5-2.5, PM7.3-4,5, PM15-7.3e TSP-PM15 e raccolti su filtri a quarzo per la classificazione. PM2.5 può essere raccolto su un filtro di backup (Figura 1).
    4. Registrare il volume di flusso totale al momento della raccolta filtro. Misurare il peso di TSP, PM2.5e PM7 sui filtri sottraendo il peso preraccolta dal peso postcollection. Sigillare il filtro in un sacchetto di plastica e conservarlo a-30 ° C fino al passaggio successivo (vedere paragrafo 2).
  2. Proteolyze i campioni.
    1. Sciogliere il cocktail di proteasi non specifici con un tampone di acetato di 0.1 M (pH 7.4). Mettere la soluzione in una membrana di dialisi (peso molecolare cutoff = Da 5.000) e immergerlo in 1 L di soluzione tampone di acetato 0,1 M con agitazione a 4 ° C. Sostituire il buffer 2 x ogni 12 h e quindi eseguire dialisi durante la notte al fine di rimuovere endogeno 3-NT e nitrito (NO.2–). Dopo la dialisi, la soluzione di raccogliere e misurare la concentrazione di proteina dall'analisi di proteine (BCA) acido bicinconinico.
    2. Punzone rotondi cerchi di 6 mm fuori il prefiltro o il filtro backup e metterle in microprovette. Fino a cinque pezzi di frazioni di 6 mm può essere utilizzato per l'analisi (Figura 2).
    3. Aggiungere 300 µ l di tampone di acetato 0,1 M contenente 50 µ g di proteina della proteasi non specifico cocktail (preparata al punto 1.2.1) al tubo per idrolizzare le proteine di PM a 50 ° C per 16 h con rotazione.
      Nota: Per sottrarre endogeno 3-NT dalla soluzione cocktail proteasi non specifici, è necessario preparare e digerire un campione solo cocktail di proteasi non specifiche.
    4. Risciacquare la membrana di ultrafiltrazione con relativo tubo in dotazione aggiungendo tampone acetato 0,1 M e centrifugazione (10.000 x g per 30 sec; la velocità esatta dipende dalla membrana), dovuta alla contaminazione di sostanze chimiche simili a 3-NT nella membrana. Ripetere il risciacquo 1 x.
    5. Post-proteolisi, centrifugare i campioni a 2.500 x g per 10 min carico il surnatante nella membrana di ultrafiltrazione e centrifugare esso a 10.000 x g e a 4 ° C per ultrafiltrazione (MWCO = 10.000), fino a quando non sufficiente volume di eluizione è raccolto. Conservare gli eluati a 4 ° C al buio.
      Attenzione: A causa del rilevamento di un picco simile a 3-NT nella colonna spin, è necessario lavarlo bene con acqua pulita o con un buffer come acqua di HPLC e un tampone di acetato 0,1 M prima di utilizzare.

2. determinazione del contenuto di 3-NT in TSP, PM2.5e7PMtramite un ad alte prestazioni cromatografia liquida e sistema di rilevazione elettrochimica (HPLC-ECD)

Nota: Vedere la Figura 3.

  1. Preparare la fase mobile.
    1. Preparare 0,2 M fosfato tampone (pH 2,5) contenenti 50 mg/L EDTA. Misurare i 98 volumi del buffer e due volumi di acetonitrile (grado HPLC), versare in una bottiglia di vetro pulita e mescolare energicamente con un tappo.
    2. Risolvere la fase mobile a temperatura ambiente per diverse ore fino a quando l'aria disciolta va piatto.
      Nota: Se il sistema viene avviato in precedenza, la fase mobile può essere sonicata e degassata sotto vuoto. Tuttavia, la sovra-degassamento cambierà il rapporto tra l'acqua e la fase organica tramite evaporazione.
  2. Il sistema di HPLC-ECD è costituito da una pompa, una colonna HPLC, un degasatore, un ECD e un iniettore. Equilibrare la fase mobile e stabilizzare il sistema per ridurre lo sfondo e il rumore.
    1. Installare la fase mobile e la colonna HPLC nel sistema HPLC. Accendere la pompa HPLC e stabilizzare la colonna con la fase mobile ad una portata di 500 µ l/min a 25 ° C temperatura della colonna dal giorno prima del giorno di partenza.
    2. Il giorno successivo, accendere l'ECD e impostare i parametri (la tensione di riduzione -900 mV e la tensione di eccitazione a 400 mV). Stabilizzare per almeno 3 ore.
  3. Misurare la concentrazione di 3-NT in PM7.
    1. Preparare le varie concentrazioni di standard 3-NT (5-500 nM) e uno spazio vuoto (senza la 3-NT standard e non specifica proteasi cocktail, per assicurarsi che il flaconcino né il buffer è contaminata) in un tampone di acetato 0,1 M.
    2. Eseguire il processore dei dati HPLC.
    3. Mettere fiale del campione nella auto-iniettore e impostare il volume di iniezione a 25 µ l. operano le stesse condizioni della fase mobile e portata come indicato al punto 2.2.1.
      Nota: Se la preparazione del campione è completa, ci dovrebbe essere campioni, standard (5-500 nM), un campione di proteasi non specifiche solo cocktail e una fiala vuota.
    4. Assicurarsi che la linea di base nel cromatogramma è piatto e iniziare l'iniezione del campione.
      Nota: In genere, 3-NT viene rilevato nel min 20-21; Tuttavia, circa 30 min è raccomandato come il tempo di esecuzione per iniezione del campione. In caso contrario, picchi di contaminante saranno tra l'esecuzione successiva.

3. analisi dei cromatogrammi e quantificazione del contenuto di 3-NT in PM7

  1. Controllare il picco 3-NT i cromatogrammi e calcolare il contenuto.
    1. Dopo la raccolta dei dati, aprire il file di dati di cromatogramma con software di analisi.
    2. Tracciare una linea attraverso il picco 3-NT dalla linea di fondo piatto e leggere l'altezza di picco dalla linea disegnata.
      Nota: Il limite quantitativo è di circa 5 nM (125 fmol in un'iniezione di 25 µ l).
      Attenzione: L'elettrodo nell'ECD si esaurisce lentamente, e il limite sarà elevato dovuto al rapporto S/N.
    3. Preparare una retta di regressione dalle vette standard 3-NT, calcolare la pendenza e intercetta.
    4. Assegnare queste costanti nell'equazione seguente e calcolare il contenuto di 3-NT nei campioni come segue.
      Esempio 3 – NT (nM) = [campione picco – intercettare] / slope EQ (1)
      Nota: La curva standard dovrebbe essere ben rappresentata come una linea retta tra 5 nM e 500 nM.
  2. Calcolare il 3-NT nell'aria ambiente e la PM7 dalla fiala del campione.
    1. Moltiplicare la concentrazione di 3-NT il volume di reazione (e il fattore di diluizione, se del caso) e valutare il contenuto di 3-NT assoluto in PM7 dal cerchio.
    2. Misurare l'area filtro raccolti e calcolare il contenuto di 3-NT nel totale PM7 filtro dalla seguente equazione.
      Totale PM7 = [3-NT contenuto in PM7 del cerchio] x [rapporto tra l'area di filtro-7 PM alla zona del cerchio] x 226.19 (nel caso di conversione di talpe in grammi) EQ. (2)
    3. Valutare il contenuto di 3-NT in ambiente air o PM7 dividendo il totale PM7 per il volume del flusso d'aria totale o PM7 peso (registrato nel passaggio 1.1.3).

Risultati

Il principio di HPLC-ECD è semplice. Campioni contenenti il bersaglio sono separati dalla colonna HPLC e fase mobile, e il composto di destinazione separati è ridotto e/o ossidato nel rivelatore elettrochimico.

Nel sistema HPLC-ECD, un picco 3-NT viene rilevato in circa 22 minuti. ECDs (PEC-510 e HTEC-500) sono connessi in tandem nella linea di HPLC. Il primo ECD riduce i gruppi dell'idrossile in composti, e la prossima si ossida le sostanze chimiche ridotte. ECDs hanno una gamma di rivelazione altamente sensibile di 10-15 M. Il limite di rilevamento del sistema HPLC-ECD è stato 1,13 pg/m3, che è stato calcolato come il medio segnale basale (mV) di 10 parti x 3.

Cromatogrammi rappresentativi sono mostrati in Figura 4. Analizzando un puro standard 3-NT, un picco definitivo con una linea di base stabile può essere rilevato (Figura 4A). 3-NT in PM7 inoltre è stata misurata utilizzando 6 mm, campioni di forma circolare (Figura 4B).

Per quanto riguarda la precisione di capacità di rilevamento 3-NT, quando uno standard 3-NT è stato iniettato in HPLC, del picco corrispondente a 3-NT è stato rilevato a un tempo di ritenzione di 20 minuti. Nei campioni di PM, 3-NT è stato separato da altre sostanze, e il picco indipendente è stato rilevato allo stesso tempo di ritenzione come standard. Una tipica curva standard è illustrata nella Figura 5, dove la linearità è osservata tra 5 e 40 nM. Linearità può essere visto fino a 500 nM (dati non mostrati).

La tabella 1 Mostra il contenuto di 3-NT nell'atmosfera, calcolato come aria di pg/m3 . La più alta concentrazione di 3-NT in un prefiltro di PM2.5 è stata osservata in #3 (PM7.3-4.5).

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Figura 1 : Sistema di raccolta per TSP, PM7e PM2.5. (A) le particelle in sospensione totale (TSP) sono raccolti direttamente su un filtro di raccolta (con una portata di 1.000 L/min). (B) quando viene raccolto PM7 , particelle più grandi sono esclusi da un selettore di dimensioni (con una portata di 1.000 L/min). (C), PM2.5 raccolti attraverso quattro prefiltri (con una portata di 116 L/min). Un filtro quartz è comunemente usato come filtro backup per PM7 e PM2.5 o come un filtro di raccolta per TSP, come mostrato in questa figura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2 : Preparazione di un cerchio rotondo millimetri 6. Il filtro di raccolta è stato tagliato utilizzando un tool di fustella con un diametro di 6 mm. Quindi, il campione è stato conservato in una microprovetta 1,5 mL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3 : Diagramma schematico del sistema HPLC-ECD. 3-NT in un campione iniettato è stato separato nella colonna HPLC attraverso il quale scorre di fase mobile. 3-NT è stato ridotto a aminotyrosine, ossidato a iminotyrosine e rilevato elettrochimicamente nel rivelatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4 : Tipici cromatogrammi nel sistema HPLC-ECD. (A) puro 3-NT analizzati dal sistema HPLC-ECD. (B) 6 mm cerchio campione da un filtro di7 PM utilizzato per rilevare 3-NT. Un picco 3-NT è indicato da una freccia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5 : Curva standard di Puri 3-NT campioni. I risultati ad una concentrazione più bassa sono indicati in un altro grafico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

OggettoGiorni di
Collezione		Spot3-NT
(aria di3 pg/m)
PM2,5Prefiltro #12748,25 ± 0,37
Prefiltro #227429.66 ± 1,94
Prefiltro #3274± 74,37 4,09
Prefiltro #427432.70 ± 0,75
Backfilter754.21 ± 0.91
PM7Backfilter7189,16 ± 6.36
TSPFiltro7110,34 ± 2,09

Tabella 1: 3-NT nell'atmosfera misurata con il sistema di HPLC-ECD. Le macchie circolari di 6 mm da ciascun filtro sono state misurate utilizzando il sistema di HPLC-ECD. Prefiltri #1 - #4 sono stati raccolti nello stesso periodo. Nota che le concentrazioni di 3-NT nell'aria sono influenzate da vari fattori, quali la data di raccolta, anno o posizione. I dati (n = 3-10) sono rappresentati come media ± errore standard.

Discussione

Questo articolo viene descritto un metodo di quantificazione per valutare 3-NT in airborne PM raccolti su filtri a quarzo utilizzando tecniche di HPLC-ECD altamente sensibili.

In generale, sono stati sviluppati metodi di misura 3-NT come biomarcatori dello stress ossidativo nelle malattie umane. Metodi basati su anticorpi (ad esempio, l'enzima-collegata dell'immunosorbente) sono considerati come semi-quantitativa perché non esiste alcuna convalida di test rigorosi ed è difficile valutare l'affidabilità del test. HPLC con rilevazione elettrochimica (ECD) e saggi basati sulla spettrometria di massa hanno sensibilità adeguata per la quantificazione della 3-NT13. Anche se sono sensibili, metodi basati sulla spettrometria di massa come GC-MS o GC-MS/MS richiedono la derivatizzazione di aminoacidi, e il processo di derivatizzazione spesso provoca la formazione di artefatti14.

Rispetto alle tecniche LC sia il GC, HPLC-ECD è relativamente meno costoso e ha una sensibilità sufficiente per misura 3-NT. Inoltre, il passo di derivatizzazione in GC-MS e LC-MS spesso richiede ulteriore tempo. Anche se il metodo presentato qui richiede 16 ore per la fase di digestione di proteine, può, tuttavia, essere portato fuori tutta la notte (come descritto in precedenza, circa 30 minuti tempo di preparazione manuale è necessario per campione). Ripetizione automatica misura utilizzando un autocampionatore può fornire un sistema di misura ad alta velocità. Gli studi precedenti hanno segnalato i metodi immunologici per misurare 3-NT PM2,7; Tuttavia, tali metodi non potrebbero rilevare 3-NT nella stagione invernale a causa dei bassi livelli di 3-NT nel PM15.

Il metodo HPLC-ECD presenta ulteriori vantaggi rispetto ad altri metodi standard; ad esempio, (i) un processo di estrazione non è necessaria in questo metodo, (ii) è completamente privo di detersivo, (iii) non ha il requisito minimo del campione e, soprattutto, (iv) ha alta sensibilità. Particelle che vengono raccolti su filtri sono spesso separate da sonicazione per ulteriori indagini, compresa la quantificazione dei vari componenti. Detergenti utilizzati anche per isolare il PM-proteine dai filtri. Tuttavia, questi passaggi aggiuntivi aumentano il rischio di contaminazione, perdita del campione e sottovalutazione grazie alla efficienza di estrazione, e inoltre, la maggior parte dei detergenti sono incompatibili con LC/MS. Nel presente metodo HPLC-ECD, campioni HPLC possono essere separati facilmente dal filtro, utilizzando un semplice pugno vuoto e senza la necessità di un processo di preparazione del campione supplementare. L'area del campione di forma circolare è 28,3 mm2, che è molto piccola rispetto alle dimensioni del filtro al quarzo originale (8 x 10 pollici = 203,2 x 254 mm = 51.600 mm2).

La condizione di HPLC-ECD è stata esaminata attentamente per evitare interferenze con il segnale di 3-NT, come descritto in precedenza12. Un pH acido forte della fase mobile e una concentrazione adeguata di acetonitrile è importante per il rilevamento. Utilizzando queste condizioni, altri composti, tra cui nitro base, possono essere separate dalla nitrotyrosine. La condizione attuale è adatta per la rilevazione di 3-NT da campioni con una diversa proprietà fisiche (ad es., particolato e plasma).

Per valutare 3-NT nell'aria, la misurazione del peso filtro e l'eliminazione dello sfondo sono passaggi critici. In generale, nel corso di circa 100 mg di PM7 sono raccolti in un periodo di quattro-sette giorni; Tuttavia, diversi fattori influenzano il peso del filtro prima e dopo la raccolta di7 PM, tra cui umidità e carica elettrica statica. Per evitare questi effetti, la stabilizzazione del peso filtro per lunghi periodi è necessaria sotto subeguali temperatura e umidità. La posizione in cui è installato il bilanciamento elettronico deve essere mantenuta in un ambiente stabile. Per la preparazione del campione, è importante correggere gli effetti di sfondo dalla proteasi non specifico cocktail e la membrana di ultrafiltrazione, che spesso mostrano un picco simile a 3-NT.

Questo metodo può essere applicato ad altre particelle, compresi quelli in ambienti interni. La nitrazione delle proteine può aumentare il loro potenziale allergenico2. Pertanto, questo metodo può aiutare a valutare la pulizia ambientale e prevenire lo stress nitrosativo.

In questo studio, segnaliamo un metodo di misurazione altamente sensibile per atmosferica 3-NT filtri campionatore d'aria con apparecchio facile da maneggiare e poco costoso. La generazione di 3-NT nell'atmosfera è associata con inquinanti ambientali quali O3, non2, PM proteine ed elementi meteorologici che interessano umano allergenicità. In conclusione, il metodo sviluppato nella presente inchiesta può aiutare a valutare la reazione atmosferica di O3, varie sostanze inquinanti e le proteine di PM in varie condizioni meteorologiche. Con questi sforzi di sviluppo di HPLC-ECD per una stima di 3-nitrotirosina nell'atmosfera, possiamo anticipare meglio pulizia ambientale, migliorare la salute umana.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Masayuki Kubo di la US Environmental Protection Agency per il suo aiuto con il campionamento di TSP/PM2.5 . Questo lavoro è stato sostenuto in parte da JSP KAKENHI Grant numero JP16K15373 e JP18H03039.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Quartz filter, backup quartz filterPALL life sciences7204Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
High-volume air samplerSIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGYHV-1000F
Particle size selector for SPMSIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY080130-061SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.  SPM is almost identical to PM7.
Low-volume air samplerSIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGYAH-600F
Size classification unit for PM2.5SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGYAH-600
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15)Tokyo DylecAHQ-630
Non-specific protease cocktailRoche11459643001Pronase from Streptomyces griseus 
3-NitrotyrosineSIGMAN7389
Ultrafiltration membranesMilliporeUFC5010BKAMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff
ECDEicomHTEC-500, PEC-510standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump
HPLC columnEicomSC-5ODS
Data processorEicomEPC-300
InjectorHitachi High-Tech Science L-7200Auto sampler
Analyzing softwareeDAQ JapanES280 PowerChrom software

Riferimenti

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