3-Nitrotyrosine 대기 환경을 통해 고성능 액체 착 색 인쇄기-전기 화학 검출기 시스템에서의 탐지

요약

우리는 6 mm 직경 라운드-고성능 액체 크로마토그래피-전기 화학 검출기 (HPLC-ECD)를 사용 하 여 공기 샘플러 prefilters에서 잘라와 대기 단백질의 화학 수정 3-nitrotyrosine를 검색 하는 방법을 제시.

초록

3-nitrotyrosine (3-NT) 대기 바이오-에 어로 졸 단백질을 통해 오존 (O₃)와 질소 이산화 (아무₂) 반응에 티로신 잔류물에서 생성 됩니다. 안정적인 3-NT 산화 손상에 대 한 특정 마커 이며 알레르기를 유도 하는 promotive 효과를 보고 됩니다. 현재 연구에서 우리는 바이오-에 어로 졸을 포함 하 여 도시 환경 공기에서 척도 3-NT를 미 립 자 물질 (PM_2.5)의 < 2.5 µ m를 수집 공기 샘플러 필터에 매우 민감한 분석 결과 개발을 보고 합니다. 이 방법에서는, 6 m m 직경 둥근 구멍은 공기 샘플러의 필터에서 잘라내어 단백질은 위해 일반적인 효소 칵테일을 혼합. 아미노산 수준으로 소화 하는 단백질 견본 3-nt-고성능 액체 크로마토그래피-전기 화학 검출기 (HPLC-ECD)를 사용 하 여 테스트 되었습니다. 최대 3-NT 콘텐츠 1.13 pg/m³의 탐지 한계를 가진 4.5에서 7.3 μ m 크기의 오후는 prefilter에서 발견 되었다.

서문

에 어로 졸 또는 공 수 오후 바이러스, 원핵생물, 곰 팡이, 식물 (화분), 동물 (곤충, 인간)¹등 다양 한 생물학 근원에서 단백질을 포함 되어 있습니다. 오후에 단백질 함량의 비율 공 수 알레르기²로 서 주요 역할 연루 되어 거의 5%로 추정 된다. 최근 보고서는 도시 주변에 어로 졸의 다양 한 제안 크기 비율 0.5%와 2³까지인 아미노산 포함. 또한, 오후 단백질의 화학 수정 O₃, 질소 이산화 (아무₂), 이산화 황 (이렇게₂)⁴등 다양 한 오염 물질 단백질의 반응에 의해 생성 될 제안 있다.

3-NT-단백질 수정-티로신 잔류물의 nitration에 의해 생성 됩니다. 아니₂ O₃ 의 높은 농도 의사 대기 공간^5,6분 자가 단백질의 nitration 홍보 하 보였다. Polypeptide 사슬에 티로신 잔류물의 nitration 꽃가루 단백질⁷의 알레르기 잠재력을 향상 시킵니다. 따라서, 정량화 및 공 수 3-NT의 평가 환경 건강의 문제 해결에 중요 한 측면 이다.

3-NT로 알려진 또한 산화의 바이오 마커 이며 nitrosative 스트레스⁸. 증거의 신흥 시체 여러 가지 인간의 질병^9,103-NT 콘텐츠의 중요 한 협회를 보이고 있다. 때문에 그것의 해로운 효과, 검색 및 3-NT 생물학 견본에서의 양적 평가 개인의 건강 상태를 결정 큰 관련성 개최. 최근 몇 년 동안, 다양 한 방법을 도입 되었습니다 추정 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험, HPLC를 포함 하 여 3-NT 콘텐츠 및 LC/MS¹¹. 이전 학문에서는, 우리는 이전 방법에 비해 여러 가지 장점을 수 여 하는 HPLC ECD 기술을 사용 하 여 탐지 방법을 보고 있다. 예를 들어 HPLC ECD는 상대적으로 간단한 분석 결과 시스템¹²는 추출 또는 derivatization 절차를 필요 하지 않습니다. 우리는이 방법을 생물 학적 샘플 (인간에서 플라즈마와 쥐)에서 3-NT 검색에 적용 됩니다 확인 했습니다.

비록 많은 조사 3-NT 생물학 견본에서의 검출 강조, nonbiological 샘플에 그것의 감지 애매, 고 따라서 현재 연구 추진 하고있다. 사실, 공 수의 해로운 효과 평가 하기 위해 3-NT, 양적 방법 3-NT 공중 입자에서 직접 검색 하는 데 유용 하는 필요; 따라서, 우리 감지 기존 HPLC ECD 메서드 적용 3-NT 오후에서_2.5 유리 섬유 필터에 대 한 수집. 사용 하 여 기술, 3-NT 작은에서 직접 검출 될 수 조각 (6 m m 직경 둥근 구멍) 오후 컬렉션 필터에서 샘플. 우리는 더 다양 한 오후 크기에 대 한 3-NT의 콘텐츠를 평가 하 고 3-NT의 검출 한계를 측정. 현재 문서 제안 3-NT nonbiological 및 생물 학적 샘플에서 직접 검색 하 고 구분 및 높은 처리량 방법.

프로토콜

1. 총의 수집 오후 단백질 입자, 오후_2.5또는 오후₇및 가수분해 방법 정지

1. 필터당 또는 백업 필터에서 오후를 수집 합니다.
   1. 총 부유 입자 (TSP)의 컬렉션에 이전 오후_2.5, 그리고 오후₇, 석 영 필터 무게.
      참고: 주어진 오후 단백질 및 펩 티 드에 의해 오염 미치지 않습니다 티로신 nitration 감지 (로 그들은 그런 니트로 그룹 부족), 우리는 측정 하기 전에 높은 온도에 quartz 필터를 취급 하지 않았다. 또한, HPLC ECD에 의해 결정으로 검출 한계에서 석 영 필터에서 3-NT 내용이 이었습니다.
   2. 입자 크기 선택기 오후₇ 7 d (그림 1B)에 대 한 지속적으로 1000 L/min의 유량에서 수집 하는 높은 볼륨에 어 샘플러에 quartz 필터를 설정 합니다. TSP 크기 선택 (그림 1A) 없이 석 영 필터에 수집할 수 있습니다.
   3. 오후_2.5 를 사용 하 여 낮은 볼륨에 어 샘플러 116 L/min의 유량에서 크기 분류 단위와 함께 지속적으로 7에 대 한 수집 d.이이 단위를 사용 하 여 입자 오후_4.5-2.5, 오후_7.3-4.5, 오후_15-7.3및 TSP-오후_{15로 분류 될 수 있다} 석 영 필터 분류에 수집. 오후_2.5 백업 필터 (그림 1C)에 수집할 수 있습니다.
   4. 레코드 필터 컬렉션의 시간에 흐름 총 볼륨입니다. TSP의 무게 측정 오후_2.5, 그리고 오후₇ postcollection 무게에서 precollection 무게를 빼서 필터에. 필터 비닐 봉지에 밀봉 하 고 단계 (섹션 2 참조)까지-30 ° C에서 그것을 저장 합니다.
2. Proteolyze 샘플.
   1. 0.1 m M 아세테이트 버퍼 (pH 7.4)와 일반적인 효소 칵테일을 디졸브. 투 석 막에 넣어 솔루션 (분자량 컷오프 = 5000 다) 4 ° c.에 감동으로 0.1 m M 아세테이트 버퍼의 1 L에 젖어 모든 12 h x 2 버퍼를 교체 하 고 생 3-NT와 질산염 (없음₂^-)를 제거 하기 위해 투 석 하룻밤을 수행. 투 석 후 솔루션을 수집 하 고 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 의해 단백질 농도 측정 합니다.
   2. 펀치는 prefilter 또는 백업 필터 6 m m의 둥근 동그라미 하 고 microtubes에 넣어. 최대 6 mm 분수의 5 조각 (그림 2) 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.
   3. 50 µ g 칵테일 일반적인 효소의 단백질 (단계 1.2.1에서에서 준비) 16 h 회전 50 ° C에서 오후 단백질은 튜브를 포함 하는 0.1 m M 아세테이트 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다.
      참고: 생 빼기 3-NT 일반적인 효소 칵테일 솔루션에서 그것은 준비 하 고 일반적인 효소 칵테일 전용 샘플을 소화 하는 데 필요한.
   4. 0.1 m M 아세테이트 버퍼를 추가 하 고 centrifuging 여 외 막의 공급된 튜브 함께 린스 (10000 x g 30 초;에 대 한 정확한 속도 멤브레인에 따라 다릅니다), 막에 있는 3-NT와 비슷한 화학 물질 오염으로 인해. 반복 린스 1 x.
   5. 게시물 베이스, 외 막으로 10 분 부하는 상쾌한 2500 x g에서 샘플을 원심 및 10000 x g와 적용에 대 한 4 ° C에서 원심 (MWCO = 10000), 차입의 충분 한 볼륨 수집 될 때까지. 어둠 속에서 4 ° C에 있다를 저장 합니다.
      주의: 3-NT 스핀 열의 비슷한 피크의 검출, 때문에 그것은 HPLC 물 같은 버퍼 및 이전 0.1 M 아세테이트 버퍼 사용 또는 깨끗 한 물으로 잘 세척 하는 데 필요한.

2. 3-NT 콘텐츠 TSP, 오후_2.5, 및 오후₇통해 고성능 액체 착 색 인쇄기 (HPLC-ECD) 전기 화학 탐지 시스템의 결정

주: 그림 3을 참조 하십시오.

1. 모바일 단계를 준비 합니다.
   1. 0.2 M 인산 버퍼 (pH 2.5) 포함 50 mg/L EDTA를 준비 합니다. 버퍼의 98 볼륨과 이기 (HPLC 등급)의 두 개의 볼륨을 측정 하 고 깨끗 한 유리병에 붓고 모자와 함께 적극적으로 혼합.
   2. 녹은 공기 플랫 때까지 몇 시간 동안 실 온에서 모바일 단계를 정착.
      참고: 시스템 이전을 시작 하는 경우 모바일 단계 sonicated 고 진공에서 degassed. 그러나, 이상 기체 제거 물과 유기 단계를 통해 증발 사이의 비율을 변경 됩니다.
2. 펌프, HPLC 열, 한 degasser, 한 ECD와는 인젝터 ECD HPLC 시스템에 의하여 이루어져 있다. 모바일 단계를 equilibrate 하 고 배경 및 잡음을 줄이기 위해 시스템을 안정화.
   1. 모바일 위상 및 HPLC 열 HPLC 시스템에 설치 합니다. HPLC 펌프를 켜고 시작 하루 전날에서 열 온도 25 ° C에서 500 µ L/min 흐름 속도로 모바일 단계와 열 안정.
   2. 다음 날에는 ECD를 점화 하 고 매개 변수를 설정 (-900에서 감소 전압 mV와 400 여기 전압 mV). 적어도 3 시간 그것을 고정 시켜야 합니다.
3. 오후₇에서 3-NT 농도 측정 합니다.
   1. 0.1 m M 아세테이트 버퍼에 3-NT 표준 (5-500 nM)와 빈의 다양 한 농도 (3-NT 표준 및 특이 효소 칵테일, 유리병도 버퍼 확인 하는 오염) 없이 준비 합니다.
   2. HPLC 데이터 프로세서를 실행 합니다.
   3. 자동-인젝터에 설정 샘플 튜브를 넣어 25 µ L. 사출 볼륨 작동 모바일 위상 및 유량 단계 2.2.1에서에서 설명한 대로 동일한 조건.
      참고: 샘플 준비 완료 되는 경우 이어야 한다 샘플, 표준 (5-500 nM), 일반적인 효소 칵테일 전용 샘플 및 빈 유리병.
   4. 크로마에 기준 평면 인지 확인 하 고 샘플 주입을 시작 합니다.
      참고: 일반적으로, 3-NT에서에서 검색 된 20-21 분; 그러나, 약 30 분 샘플 주입 당 실행 시간으로 권장 됩니다. 그렇지 않으면, 오염 물질 봉우리 다음 실행에 포함 됩니다.

3. Chromatograms 및 오후₇ 에서 3-NT 콘텐츠의 정량화 분석

1. 3-NT 피크는 chromatograms에서 확인 하 고 콘텐츠를 계산.
   1. 데이터 수집 후 분석 소프트웨어와 크로마 데이터 파일을 엽니다.
   2. 플랫 베이스 라인에서 3-NT 피크 맞은편에 선을 인출 하 고 그려진된 라인에서 피크 높이 읽고.
      참고: 양적 한계는 약 5 nM (125 fmol 25 µ L 주입에서).
      주의: 전극은 ECD에서 천천히, 고갈 되 고 제한 때문에 S/N 비율 높은 것.
   3. 3-NT 표준 봉우리에서 회귀선을 준비, 기울기를 계산 하 고 차단.
   4. 다음 방정식으로 이러한 상수에 할당 하 고 샘플에서 3-NT 콘텐츠를 다음과 같이 계산.
      샘플 3-NT (nM) = [피크 샘플-차단] / 경사 식 (1)
      참고: 표준 곡선 잘 나타내야 5 사이 직선으로 및 500 nM.
2. 공기 환경 및 샘플 유리병에서 오후₇ 에서 3-NT를 계산 합니다.
   1. 증식로 반응 (희석 비율, 있는 경우), 3-NT 농도 그리고 오후₇ 원형에서 절대 3-NT 콘텐츠 평가.
   2. 수집 된 필터 영역을 측정 하 고 3-NT 콘텐츠 총 오후에 계산 다음 방정식으로₇ 필터.
      총 오후₇ [원의 오후₇ 에서 3-NT 콘텐츠] = [원형 지역에 오후₇ 필터 영역의 비율] x x 226.19 (그램 두더지를 변환)의 경우 식 (2)
   3. 나누어 총 오후₇ 총 공기 흐름 볼륨 또는 오후 공기 환경 또는 오후₇ 에서 3-NT 콘텐츠 평가₇ 무게 (단계 1.1.3에에서 기록).

결과

HPLC ECD 원리는 간단 하다. 대상 포함 된 샘플 HPLC 및 모바일 단계 구분 하 고 분리 된 대상 화합물은 감소 전기 화학 검출기에서 산화.

ECD HPLC 시스템에서 약 22 분에서 3-NT 피크 감지 됩니다. (PEC-510와 HTEC-500) ECDs HPLC 줄에서에 연결 됩니다. 첫 번째 ECD는 화합물에서 수 산 기 그룹 그리고 산화 감소 된 화학 물질. ECDs를 매우 민감한 탐지의 범위가 10^-15 M. ECD HPLC 시스템의 검출 한계 1.13 pg/m³, 10 부품 x 3의 평균 기저 신호 (mV)으로 계산 했다.

대표 chromatograms는 그림 4에 나와 있습니다. 순수한 3-NT 표준 분석 하 여 안정적인 기준과 명확한 피크 수 감지 (그림 4A). 오후에 3-NT₇ 또한 측정 했다 6 m m, 라운드 모양의 샘플 (그림 4B)를 사용 하 여.

3-NT 탐지 능력의 정확성에 관한 3-NT 표준 HPLC에 주사 3-NT에 해당 하는 피크 20 분의 보존 기간에 검색 되었습니다. 오후 샘플 3-NT 다른 물질 로부터 분리 되었다 그리고 독립적인 피크 표준으로 보존 동시에 발견 되었다. 일반 표준 곡선 그림 5, 5, 40 nM 사이 선형성은 관찰 하는 어디에 표시 됩니다. 선형성 500 볼 수 있다 nM (데이터 표시 되지 않음).

표 1 pg/m³ 에 어로 분위기에서 3-NT 내용을 보여준다. 3-오후_2.5 prefilter에 NT의 #3 (오후_7.3-4.5)에서 관찰 되었다.

그림 1 : TSP, 수집 체계 오후₇및 오후_2.5. (A) 총 부유 입자 (TSP) (1000 L/min의 유량)에 컬렉션 필터에 직접 수집 됩니다. (B) 오후₇ 수집 큰 입자 크기 선택 (1000 L/min의 유량)에 의해 제외 됩니다. (C) 오후_2.5 (116 L/min의 유량)에 4 개의 prefilters을 통해 수집 됩니다. 석 영 필터는 통용 오후₇ 와 오후_2.5 에 대 한 백업 필터 또는 TSP에 대 한 컬렉션 필터가이 그림에 표시 된 대로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 6 mm-라운드의 준비. 컬렉션 필터 6 m m 직경을 가진 빈 펀치 도구를 사용 하 여 절단 했다. 그런 다음, 예제 1.5 mL microtube에 저장 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : HPLC ECD 시스템의 회로도. 삽입 된 샘플에서 3-NT는 모바일 단계 흐름 통해 HPLC 칼럼에서 분리 되었다. 3-NT aminotyrosine로 감소, iminotyrosine로 산화 되었고 화학적 검출기에서 검출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : HPLC ECD 시스템에서 전형적인 chromatograms. (A) 순수 3-NT ECD HPLC 시스템에 의해 분석. 오후₇ 필터에서 (B) 6mm 원형 샘플 3-NT를 감지 하는 데 사용. 3-NT 피크는 화살표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 순수한 3-NT 샘플의 표준 곡선. 낮은 농도에서 결과 다른 그래프에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

제목		일 컬렉션	스팟	3-NT (pg/m3 공기)
PM2.5	필터당 # 1	27	4	8.25 ± 0.37
	필터당 # 2	27	4	29.66 ± 1.94
	필터당 # 3	27	4	74.37 ± 4.09
	필터당 # 4	27	4	32.70 ± 0.75
	Backfilter	7	5	4.21 ± 0.91
PM7	Backfilter	7	1	89.16 ± 6.36
TSP	필터	7	1	10.34 ± 2.09

표 1: 3-NT ECD HPLC 시스템에 의해 측정 하는 분위기에서. 각 필터에서 6mm 원형 반점 HPLC ECD 시스템을 사용 하 여 측정 되었다. Prefilters #1-# 4는 같은 기간에 수집 되었다. 참고 3-NT 공기에서의 농도 수집 된 날짜, 년, 위치 등 다양 한 요인에 의해 영향을 받습니다. 데이터 (n = 3-10)는 평균 ± 표준 오차 표현.

토론

이 문서는 매우 중요 한 HPLC ECD 기법을 사용 하 여 석 영 필터에 수집 하는 공 수 오후에 3-NT를 평가 하는 정량화 방법을 설명 합니다.

일반적으로 3-NT 측정 방법 인간 질병에 있는 산화 긴장의 biomarkers로 개발 되었습니다. 항 체 기반 방법 (예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과) 있기 때문에 엄격한 분석 결과 유효성 테스트의 신뢰성을 평가 하기가 반 정량적으로 간주 됩니다. 전기 화학 탐지 (ECD)와 질량 분석 기반 분석 HPLC 3-NT¹³의 정량화에 대 한 적절 한 감도 있다. 들은 민감한, GC-MS 같은 질량 분석 기반 방법 또는 GC-MS/MS 필요한 아미노산, derivatization 그리고 derivatization 수시로 과정 유물¹⁴의 형성에 결과.

GC와 LC 기법에 비해 HPLC ECD 상대적으로 저렴 하며 측정 3 충분 한 감도가지고-NT. 또한, GC-MS와 LC-MS derivatization 단계 종종 추가 시간이 필요 합니다. 여기에 제시 된 방법 단백질 소화 단계에 대 한 16 시간을 필요로, 하지만 그것은, 그럼에도 불구 하 고, 실시 될 수 있습니다 하룻밤 (위에서 설명한 대로 실습 시간 약 30 분이 필요 샘플 당). 자동 반복 측정 한 autosampler를 사용 하 여 높은 처리량 측정 시스템을 제공할 수 있습니다. 이전 연구는 면역 방법 측정 하 보고 오후^2,7; 3-NT 그러나, 이러한 방법을 감지할 수 없습니다 3-NT 오후¹⁵3-NT의 낮은 수준 때문에 겨울 시즌에.

HPLC ECD 메서드는 추가 이점이 다른 표준 방법; 예를 들어 추출 과정 (i)는이 메서드가 필요 하지 않습니다, (ii) 그것은 완전히 세제 무료, (iii) 그것은 최소한의 샘플 요구 사항, 그리고, 중요 한 것은, (iv) 그것이 높은 감도. 입자 필터에 수집 된 다양 한 구성의 정량화를 포함 하 여 추가 조사에 대 한 쥡니다 자주 구분 됩니다. 세제 또한 필터에서 오후-바인딩 단백질을 분리 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 이러한 추가 단계 오염, 샘플 손실, 및 과소 추출 효율 때문의 위험을 증가 하 고 또한, 대부분의 세제가 LC/MS와 호환 되지 않습니다. 현재 ECD HPLC 방법에서 HPLC 샘플 쉽게 분리 수 있습니다 필터에서 간단한 빈 펀치를 사용 하 여 및 추가 샘플 준비 과정의 요구 사항 없이. 라운드 모양의 샘플의 영역은 28.3 m m²는 원래 석 영 필터의 크기에 비해 매우 작은은 (8 × 10 인치 = 203.2 x 254 m m = 51,600 m m²).

HPLC ECD 조건 3-NT 신호에 간섭을 유발 하지 않도록 신중 하 게 검토 되어 앞에서 설명한¹². 모바일 위상의 강한 산 성 pH 및 이기의 적절 한 농도 감지에 대 한 중요 하다. 이러한 조건을 사용 하 여, 다른 화합물을 니트로 기본를 포함 하 여 nitrotyrosine에서 분리 수 있습니다. 현재 상태 3-NT에서 다른 실제 속성 (예: 미 립 자 물질 및 플라즈마) 샘플의 탐지를 위해 적당 하다.

평가 하는 공기에 3-NT 필터 무게의 측정 및 배경 제거 중요 한 단계가 있습니다. 일반적으로 오후₇ 의 약 100 밀리 그램은 수집; 4-7 일의 기간 동안 그러나, 몇 가지 요소는 오후₇ 컬렉션, 습도 및 정적 전기 충전을 포함 하 여 전후 필터 무게에 영향을. 이러한 효과 방지 하려면 오랜 기간 동안 필터의 안정화는 subequal 온도 습도에서 필요 합니다. 전자 저울 설치 위치는 안정적인 환경에서 유지 되어야 합니다. 샘플 준비, 그것은 종종 3-nt 비슷한 피크를 표시 하는 일반적인 효소 칵테일에서 배경 효과 및 외 막 수정 하는 것이 중요.

이 메서드는 실내 환경에 포함 하 여, 다른 입자에 적용할 수 있습니다. 단백질의 nitration 그들의 극성 잠재적인²증가할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 환경 청결 평가 및 nitrosative 스트레스를 방지 도움이 됩니다.

이 연구에서 우리는 쉬운 손잡이 및 저렴 한 기구와 공기 샘플러 필터의 대기 3-NT에 대 한 매우 중요 한 측정 방법을 보고합니다. 3-NT 대기에서의 생성은 O₃,₂, 오후 단백질, 및 인간의 allergenicity에 영향을 미치는 기상 요소 등 환경 오염 물질에 연관 된다. 결론적으로, 현재 조사에서 개발 하는 방법 O₃, 다양 한 오염 물질, 그리고 다양 한 기상 조건 하에서 오후 단백질의 대기 반응 평가 하는 데 도움이 있습니다. 3-nitrotyrosine는 분위기에서의 추정을 위한 HPLC ECD 개발의 이러한 노력으로 우리는 인간의 건강을 향상 더 나은 환경 청결, 예상.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quartz filter, backup quartz filter	PALL life sciences	7204	Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in
High-volume air sampler	SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY	HV-1000F
Particle size selector for SPM	SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY	080130-061	SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter.  SPM is almost identical to PM7.
Low-volume air sampler	SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY	AH-600F
Size classification unit for PM2.5	SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY	AH-600
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15)	Tokyo Dylec	AHQ-630
Non-specific protease cocktail	Roche	11459643001	Pronase from Streptomyces griseus
3-Nitrotyrosine	SIGMA	N7389
Ultrafiltration membranes	Millipore	UFC5010BK	AMICON ULTRA 0.5 mL - 10kDa cutoff
ECD	Eicom	HTEC-500, PEC-510	standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump
HPLC column	Eicom	SC-5ODS
Data processor	Eicom	EPC-300
Injector	Hitachi High-Tech Science	L-7200	Auto sampler
Analyzing software	eDAQ Japan	ES280	PowerChrom software