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  • Riepilogo
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  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
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  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un approccio efficiente per misurare l'assorbimento del colesterolo di LDL con tariffe afflusso in tempo reale utilizzando una cellula viva imaging system in vari tipi cellulari. Questa tecnica fornisce una piattaforma per schermare l'attività farmacologica dei composti che interessano l'afflusso di LDL durante il monitoraggio per la morfologia delle cellule e quindi potenziale citotossicità.

Abstract

La regolazione dell'assorbimento di colesterolo LDL tramite endocitosi mediata LDLR è un'importante area di studio in varie patologie principali, tra cui malattia metabolica, malattie cardiovascolari e malattie renali. Attualmente, non esiste un metodo disponibile per valutare l'assorbimento di LDL mentre simultaneamente il monitoraggio per la salute delle cellule. Lo studio attuale presenta un protocollo, utilizzando un sistema di analisi live cell imaging, per acquisire misurazioni seriali di afflusso di LDL con monitoraggio simultaneo per la salute delle cellule. Questa tecnica novella è testata in tre linee cellulari umane (epatico, renale tubolare epiteliale e coronarica cellule endoteliali dell'arteria) sopra un corso di tempo di quattro ore. Inoltre, la sensibilità di questa tecnica viene convalidata con ben noti inibitori di assorbimento di LDL, Dynasore e ricombinante proteina PCSK9, così come da un promotore di assorbimento di LDL, simvastatina. Presi insieme, questo metodo fornisce una piattaforma di produttività medio-alta per contemporaneamente attività farmacologica di screening, nonché il monitoraggio della morfologia delle cellule, quindi citotossicità di composti che regolano afflusso di LDL. L'analisi può essere utilizzato con diversi sistemi di imaging e software di analisi.

Introduzione

L'endocitosi di bassa densità della lipoproteina LDLR recettore-mediata di LDL è un'importante area di studio, poiché i livelli di colesterolo LDL circolanti sono alla base della malattia cardiovascolare1, rene malattia2 , nonché una varietà di infiammatoria 3 di malattie e disordini genetici con mutazioni in colesterolo trasporto geni4,5,6,7. Studi in afflusso LDLR-mediata di colesterolo hanno portato alla identificazione di più strumenti di ricerca, quali gli inibitori dinamina, tra cui la chimica Dynasore8,9,10, così come LDL-disciplinare proteine come proteina convertasi Subtilisin/Kexin tipo 9 (PCSK9)11,12.

Il pathway di endocitosi di LDL-LDLR inizia con sequestranti il complesso LDL-LDLR sulla superficie delle cellule in pozzi rivestite di clatrina13. Le vescicole sono poi formate da invaginazione della membrana cellulare superficiale interiorizzare il complesso LDL-LDLR nei vacuoli per il trasporto all'interno della cellula. Come la vescicola formata matura in endosomi precoci e tardivi quindi, il pH scende all'interno l'endosoma tardivo, causando dissociazione delle LDL dal suo recettore14. In passato, i metodi di quantificazione dell'afflusso di LDL dipendevano dal radio-marcato 125-LDL co-incubazione con le cellule e la successiva estrazione della proteina radio-marcato dalle cellule per quantificazione15. Questo fu poi sostituito dall'uso di proteine di LDL fluorescente etichettate come DiI-LDL e immunostaining successive o estrazione della proteina fluorescente letture utilizzando un spettrofotometro o piastra lettore15,16. Fluorescente etichettati LDL è anche stato utilizzato in fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per analisi di interiorizzazione delle LDL e delle cellule superficiali LDL associazione17. Mentre questi metodi consentono di raccolta dei dati dopo il trattamento, la vitalità delle cellule di controllo durante il trattamento non è possibile.

Il pH acido nell'endosoma tardivo consente l'utilizzo di una sonda fluorescente pH-attivata di LDL come pHrodo LDL rosso che reagisce in dopo l'interiorizzazione18,19. Questa proprietà permette un corso a tempo continuo di valutazione di assorbimento di LDL in cellule vive. Di conseguenza, questo protocollo utilizza l'imaging di fluorescenza pHrodo rosso-LDL in un'analisi di cellule vive di assorbimento di misura LDL in serie con il monitoraggio simultaneo per la salute delle cellule. I risultati indicano l'affidabilità di questa tecnica novella come testato sopra un corso di tempo di quattro ore in tre linee cellulari umane differenti, cellule umane di carcinoma epatico (HepG2), cellule epiteliali renali umane di (HK2) e cellule endoteliali arteriose coronarie umane (HCAEC ). Queste linee cellulari sono clinicamente significative a LDL liquidazione20,21,22,23,24,25,26,27 , rene malattia28,29,30,31e malattie cardiache32,33, rispettivamente. Oltre a monitorare l'afflusso di LDL, questo protocollo comprende il trattamento con due ben noti inibitori di assorbimento di LDL, Dynasore idrato e proteina ricombinante di PCSK9, nonché un statina induttore dell'espressione LDLR e l'assorbimento di LDL, simvastatina. Dynasore e ricombinante PCSK9 ogni opera attraverso diverse vie per ridurre l'assorbimento di LDL.

Dynasore è un inibitore di piccola molecola di Dynamins10 e riduce l'assorbimento di LDL bloccando endocitosi clatrina-dipendente di LDL-LDLR complesso10,34. Ricombinante PCSK9, d'altra parte, è un membro di peptidasi famiglia S8 che lega LDLR e inibisce il suo riciclaggio alla superficie delle cellule dopo il rilascio di LDL dal complesso interiorizzato bloccando necessari cambiamenti conformazionali35,36 . Diminuzione delle cellule superficiali LDLR densità conduce infine a ridotto assorbimento di LDL dalla cellula. Statine, mentre direttamente bloccando l'enzima 3-idrossi-3-metilglutaril-coenzima (HMG-CoA) reduttasi e quindi la biosintesi del colesterolo, sono anche noti per aumentare l'espressione di LDLR25,38 che conduce a maggiore assorbimento di LDL. La sensibilità di questo protocollo viene convalidata rilevando le riduzioni significative in afflusso di LDL in linee cellulari umane clinicamente rilevanti tre, HK2, HepG2 e HCAECs, da Dynasore e/o ricombinante PCSK9 e un profondo aumento nell'assorbimento di LDL in cellule HepG2 di Simvastatina in un corso di quattro ore di tempo con monitoraggio per morfologia/salute delle cellule. Presi insieme, questo metodo fornisce una piattaforma di medio-alto throughput screening contemporaneamente l'attività farmacologica e la citotossicità di composti che regolano l'assorbimento di LDL in cellule vive.

Protocollo

1. le cellule in una piastra a 24 pozzetti di semina

  1. Aspirare la media fuori le cellule, lavare le cellule con 5 mL di tampone fosfato isotonico di Dubelco (dPBS) e aspirare il dPBS. Per cellule HepG2 in un piatto di 100 mm, utilizzare 1,5 mL di 0,25% tripsina/EDTA, e per HK2 celle o HCAECs utilizzare 1,5 mL di soluzione di tripsina/EDTA 0,05% per staccare le cellule.
  2. Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 4 minuti o fino a quando le cellule sono staccate. Neutralizzare la tripsina dopo un'incubazione di 4 minuti aggiungendo 3 mL di terreno completo per HepG2 e HK2 o 3 mL di tripsina neutralizzando soluzione, dPBS più 5% siero bovino fetale (FBS), per le cellule HCAEC.
  3. Trasferire le cellule in provette coniche da 15 mL e centrifugare a 250 x g per 5 min, aspirare i media e risospendere il pellet cellulare in completa per i media.
  4. Filtrare la sospensione cellulare delicatamente attraverso un colino di maglia 40 μm per rompere i grumi di cellule. Non lavare le cellule con il colino.
  5. Contare le celle e impiattatelo ad una densità ottimizzata. Ad esempio, 5.000 cellule per pozzetto di cellule HepG2 o 10.000 cellule per pozzetto di HK2 celle o HCAECs in una piastra a 24 pozzetti portano a risultati ottimali.
  6. Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C per consentire alle cellule di allegare.
  7. Il giorno successivo, cambiare il supporto delle cellule alla base di supporto per la linea cellulare (senza FBS) più il 5% del siero carente di Lipo-proteine (LPDS) o bassa (2%) Media FBS a seconda del trattamento (Vedi 1.7). Quindi, continuare a incubazione per 24 h a morire di fame le cellule. Utilizzare 500 μL di totale media per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
  8. Trattare le cellule in uno dei tre modi: aggiungere 10 µ g/mL di rPCSK9 (o veicolo) e restituire le cellule nell'incubatore 37 ° C per 1 ora, aggiungere 40 µM di idrato di Dynasore (o veicolo, solfossido dimetilico) e restituire le cellule nell'incubatore a 37 ° C per 10 minuti , o aggiungere 1 µM simvastatina (o veicolo, solfossido dimetilico) e restituire le cellule nell'incubatore a 37 ° C per 12, 18 o 24 ore. Utilizzare supporti con 5% LPDS per trattamenti Dynasore o rPCSK9. Uso basso (2%) FBS media o media con trattamenti LPDS Simvastatin 5%.
    Nota: Trattando le cellule con composti desiderati può essere fatto al momento della sostituzione supporto per fame della lipoproteina (passo 1.6) per esperimenti a lungo termine, o prima l'analisi per esperimenti di breve durati. In alternativa, i tempi di trattamento su misura possono essere scelti sulla base del tipo e lo scopo degli esperimenti.
  9. Successivamente, aggiungere 5 µ l di pHrodo rosso-etichettati LDL (1 mg/mL di brodo) ad ogni pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 10 µ g/mL. Quindi, attentamente rimuovere tutte le bolle dai pozzi.

2. l'analisi delle cellule di vivere

  1. Immediatamente dopo l'aggiunta del LDL etichettati, posizionare la piastra nell'incubatore di sistema analisi di cellule vive (Vedi Tabella materiali) e consentire la piastra equilibrare per 15 minuti per ridurre la condensa nella piastra.
  2. Nel frattempo, aprire il software e pianificare la scansione aggiungendo il recipiente contenente la piastra. Immagine 16 immagini per pozzetto a intervalli di 1 ora a 10x per 4 ore utilizzando i canali rosso e fase.
  3. Creare una mappa di piastra da utilizzare per l'elaborazione dati.
    1. Scegliere la scheda Proprietà scegliere la mappa di piastra. Inserire il tipo di cella e trattamenti nella scheda composti .
    2. Fare clic sulla scheda regioni , selezionare ogni set di repliche e salvare come regioni.

3. impostare i parametri di analisi

  1. Una volta completata una corsa sperimentale, creare un Set di immagine nel software per preparare il computer per quantificare ogni parametro incluso nel set di conteggio.
    1. Nel software, aprire la vista di piastra, quindi nella finestra di Analisi lavoro utilità scegliere creare o aggiungere alla collezione di immagini.
    2. Selezionare la Nuova collezione di immagini, digitare un nome per la raccolta di immagini e scegliere i canali rosso e fase selezionando le caselle accanto ai canali.
    3. Selezionare 5 immagini più e aggiungere alla collezione di immagini con l'aggiunta all'insieme corrente di immagine.
  2. Creare una definizione di elaborazione per le cellule. Tabella 1 include i parametri per la cella HepG2, HK2 e HCAE l'elaborazione di definizioni per questo protocollo di afflusso di LDL.
    1. Nella finestra di Utilità del lavoro di analisi , scegliere Nuova definizione di elaborazione. Scegli la raccolta di immagine denominato nel passaggio 2.1.2 dal menu a discesa. Inserire i parametri per il tipo di cellule dalla tabella 1.
    2. Nella casella di anteprima, utilizzare il menu a discesa per selezionare Anteprima tutto.
    3. Nella casella Maschera di analisi , verifica la Confluenza Mask e le caselle di Rosso oggetto maschera per visualizzare l'area incluso nell'analisi per la definizione di elaborazione. Vedere la Figura 1.
    4. Scorrere l'insieme immagine affinché che le cellule e LDL sono inclusi nella maschera. Selezionare il File e salvare la definizione di elaborazione.
  3. Analizzare la serie di immagini dalla pista sperimentale.
    1. Aprire l'esperimento in vista zolla. Nella finestra di Utilità del lavoro di analisi , scegliere Avviare il nuovo processo di analisi. Selezionare la definizione di trasformazione salvata.
    2. Nome del processo di analisi, scegliere l'intervallo di tempo per analisi ed evidenziare i pozzi sperimentali per analizzare. Fare clic sul pulsante di avvio .

4. analisi ed elaborazione dati

  1. Una volta completato il processo di analisi, è possibile esportare i dati:
    1. Selezionare l'analisi completata e premere Visualizza. Nel menu utilità , scegliere Esporta metrica/grafico.
    2. Nel menu regioni , scegliere Tutti i pozzettie nel menù del gruppo , per ottenere i valori medi per ogni insieme di pozzi come gruppo scegliere replica e per l'esportazione i singoli valori per ciascun pozzetto scegliete nessuno.
    3. Nel menu oggetto rosso metrica , scegliere l' Intensità di totale rosso oggetto integrato (RCU x µm2/image). Questo parametro indica la somma dei tempi di intensità (in RCU) segnale rosso l'area del segnale rosso (in µm2) in tutte le immagini in ciascun pozzetto, che corrisponde all'assorbimento totale di LDL da parte delle cellule.
    4. Fare clic sul pulsante di Esportazione dati . Verifica dati si suddividono in singole immagini. I dati viene automaticamente copiati su un blocco per appunti e possono essere incollati in un nuovo file di foglio di calcolo.
    5. Nel menu oggetto fase metrica , scegli la confluenza (per cento). Verifica dati si suddividono in singole immagini. Fare clic sul pulsante di Esportazione dati . I dati viene automaticamente copiati su un blocco per appunti e possono essere copiati nel file di foglio di calcolo contenente i dati di intensità integrato rosso oggetto totale.
    6. Applicare la conversione della confluenza delle percentuali di area totale con la seguente equazione.

      Fase di superficie (µm2/image) totale = confluenza (%) × × × (altezza dell'immagine (pixel) risoluzione) (× larghezza (pixel) dell'immagine ad alta risoluzione)

      Nota: il parametro di confluenza (%) indica la confluenza delle percentuali della zona di fase per ogni immagine che corrisponde alla zona delle celle in ciascun pozzetto. Questa metrica deve essere convertita in area totale fase per ogni individuo immagine una volta esportato. Le specifiche di immagine per il canale di fase (altezza, larghezza e risoluzione) per essere utilizzato con la suddetta formula per ciascuna nave sperimentale possono essere trovate facendo riferimento alla Proprietà vaso sotto Canali dell'immagine.
    7. Normalizzare totale rosso oggetto integrato intensità alla zona di fase totale calcolata in 4.1.6 utilizzando la seguente formula per ogni singola immagine per eliminare la variabilità della densità delle cellule attraverso i pozzi.
      1. Dividere i valori di Intensità di totale rosso oggetto integrato (RCU x µm2/image) di ogni immagine dal suo corrispondente Superficie totale di fase (µm2/image) per ottenere i valori di Assorbimento di LDL (RCU) per ogni immagine.
      2. Poi, media i dati di Assorbimento di LDL (RCU) di tutte le immagini di ciascun pozzetto per ottenere l'assorbimento di LDL medio in ciascun pozzetto e poi media dei valori di assorbimento di LDL di tutti i pozzetti replicati per ottenere mezzi di gruppo. Questi dati sono i valori di assorbimento di LDL finali e possono essere utilizzati per l'illustrazione e l'analisi statistica utilizzando il software di scelta.

Risultati

Live Cell Imaging consente il monitoraggio affidabile di salute delle cellule durante gli studi di afflusso di colesterolo nelle tre linee cellulari umane
Abbiamo validato la nostra analisi in tre linee cellulari umane in quale colesterolo regolamento omeostasi gioca un importante ruolo fisiopatologico, compreso le cellule umane di carcinoma epatico (HepG2), cellule epiteliali renali umane di (HK2) e cellule endoteliali umane dell'arteria coronaria (HCAECs). Abbiamo usato un sistema di imaging di cellule vive per eseguire l'analisi di assorbimento di LDL in un corso a tempo 4h con misurazioni seriali a intervalli di 1 h. I nostri risultati indicano che tutti i tipi di cellulari testati erano compatibili con questa nuova tecnica e il risultato in curve che indica l'assorbimento di LDL continuo per tutta la durata dello studio afflusso con 4,33 h come endpoint finale (Figura 2). I dati di afflusso illustrati nella Figura 2 sono stati ottenuti normalizzando il totale pHrodo fluorescenza rosso-labeled LDL (oggetto rosso integrato intensità per immagine in RCU x µm2 totale/immagine) per l'area totale delle cellule in ogni immagine di ciascun pozzetto (area di oggetto di fase per ogni immagine in µ m2/image) per eliminare la variabilità della densità delle cellule attraverso i pozzi. Inoltre, per convalidare la sensibilità del dosaggio LDL afflusso allo scopo di composti che influenzano l'assorbimento del colesterolo di LDL di screening, abbiamo usato due controlli positivi noti per inibire LDL afflusso, Dynasore e rPCSK9 e un controllo positivo conosciuto per indurre il LDL assorbimento, simvastatina. Come convalidato dai nostri risultati, dopo il trattamento con Dynasore e rPCSK9, tutti e tre testato linee cellulari umane (HepG2, HK2 e HCAEC) ha mostrate significative riduzioni nell'afflusso di LDL sopra un corso di tempo di 4 h (Figura 2A-C). Ad esempio, nella figura 2A Mostra che l'afflusso di LDL è ridotta in cellule HepG2 con trattamento di Dynasore nel corso del tempo, rispetto alle cellule trattate con DMSO; mentre il DMSO come il controllo del veicolo per Dynasore controllo non aveva nessun effetto significativo sull'afflusso di LDL rispetto al gruppo di controllo non trattato. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato un profondo aumento nell'assorbimento di LDL dalle cellule HepG2 dopo il trattamento con simvastatina (Figura 3), supportando la sensibilità di questo metodo per rilevare alterazioni significative dell'afflusso di LDL. A intorno al punto di tempo 4,5 h, che è un punto di tempo tipico negli studi di assorbimento di LDL, l'afflusso di LDL è significativamente ridotto con il trattamento o Dynasore o rPCSK9 e aumentato di Simvastatin trattamento (Figura 4).

Un grande vantaggio ad usare live cell imaging per gli studi di assorbimento di LDL è che questo sistema fornisce immagini in tempo reale delle cellule in ogni pozzetto che potrebbero essere utilizzati per monitorare potenziali citotossicità dei composti esaminati. Figure 5-7 illustrano immagini rappresentative di tre linee cellulari studiate presso il punto temporale iniziale (0,33 h) e il punto finale (4,33 h) come riferimento visivo per l'afflusso netto di LDL. Le immagini confermano la normale morfologia delle cellule seguono i trattamenti Dynasore o rPCSK9, che indica sia l'efficacia e la sicurezza di questi composti.

Cellule vive analisi dà affidabile seriale colesterolo quantitativa afflusso misurazioni con vari trattamenti

Un ulteriore vantaggio di utilizzare questo protocollo con una cellula viva sistema di imaging è la capacità di raccogliere dati durante tutto il corso di tempo e confrontare afflusso di LDL a più punti di tempo, piuttosto che un solo punto di tempo finale come tradizionalmente fatto. Usando questo protocollo, siamo in grado di calcolare l'afflusso delle percentuali reductionin LDL al punto ora del terminale, così come a intervalli di 1 h durante tutto il corso del tempo. La tabella 2 riassume la riduzione nell'afflusso di LDL in tre linee di cellule umane testato dopo 10 min pre-trattamento con 40 µM Dynasore o 1h pre-trattamento con 10 µ g/mL rPCSK9. A 4,33 h come punto finale finale dello studio, il trattamento con Dynasore a 40 µM significativamente ridotto afflusso di LDL in cellule HepG2, HK2 e HCAECs da 53%, 68% e 54%, rispettivamente (Tabella 2A-C) e trattamento con rPCSK9 a 10 µ g/mL ha provocato la riduzione del 55% di LDL afflusso in HK2 cellule (tabella 2B). Oltre a quantificare il punto terminale tempo come in dosaggi tradizionali, siamo in grado di eseguire un'analisi quantitativa nella riduzione dell'afflusso di LDL dovuto il trattamento in ogni punto di tempo dell'esperimento. Ad esempio, la tabella 2B Mostra che il trattamento con rPCSK9 in cellule ha provocate una riduzione dell'assorbimento di LDL da 79% a 1,33 h, 67% a 2,33 h HK2, 59% a 3,33 h post trattamento rispetto alle cellule non trattate. Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per l'analisi quantitativa di afflusso di LDL dopo il trattamento.

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Figura 1 : Elaborazione Definizione maschera. Immagini rappresentative delle cellule HK2 sono raffigurati a seguito dell'applicazione della definizione del trattamento appropriato (indicata nella tabella 1). Indicato areHK2 cellule senza mascherare (A), con fase Maskapplied (B), con rosso oggetto maschera applicata (C), o con fase sia oggetto rosso maschere applicate (D). Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2 : Riduzione LDL assorbimento utilizzando live imaging sistema celle sopra un corso di tempo 4,33 h. Vivere il sistema è utilizzato per misurare l'afflusso di LDL in cellule umane di carcinoma epatico (HEPG2) (A), umane cellule epiteliali tubolari renali (HK2) (B) e dell'arteria coronaria umana le cellule endoteliali (HCAE) (C) l'analisi delle cellule. Le cellule sono state trattate con Dynasore (10 min prima della corsa) o rPCSK9 (1 h prima della corsa) come controlli positivi. DMSO è stato usato come un veicolo per trattamenti Dynasore. Controlli positivi ha fatto diminuire significativamente l'afflusso di LDL in tutte le linee cellulari 3. I valori di afflusso di LDL sono stati ottenuti normalizzando l'intensità totale oggetto rosso integrato (RCUxµm2/image) per l'area dell'oggetto fase totale (µm2/image). I dati sono mean±SEM. N = 6 pozzetti/gruppo. I dati sono rappresentativi di 2 o 3 esperimenti indipendenti. p < 0,0001 vs vuoto, e # # #p < 0,0001 vs DMSO, facendo uso di ANOVA a due vie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3 . Aumento nell'assorbimento di LDL utilizzando live cell imaging sistema sopra un corso di tempo 4,33 h. Vivere l'analisi delle cellule sistema è utilizzato per misurare l'afflusso di LDL in cellule umane di carcinoma epatico (HEPG2). L'assorbimento di LDL è aumentato significativamente dopo il trattamento con simvastatina per 12 h (A), 18 h (B) o 24 h (C) utilizzando supporti contenenti 2% FBS. Il punto di tempo di 24 ore inoltre è stato realizzato con supporti contenenti 5% LPDS (senza FBS). DMSO è stato usato come controllo negativo. I valori di afflusso di LDL sono stati ottenuti normalizzando l'intensità totale oggetto rosso integrato (RCU x µm2/image) per l'area dell'oggetto fase totale (µm2/image). I dati sono mean±SEM. N = 6 pozzetti/gruppo. I dati sono rappresentativi di un esperimento indipendente. p < 0,0001 vs DMSO, utilizzando il test t di Student. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4 . Significativa riduzione di afflusso di LDL da agenti di riduzione assorbimento di LDL al punto di tempo 4,3 h. Afflusso di LDL è ridotta significativamente in cellule umane di carcinoma epatico (HepG2) (A), umane cellule epiteliali tubolari renali (HK2) (B) e umane dell'arteria coronaria (HCAE) le cellule endoteliali (C) dopo il trattamento con l'assorbimento di LDL inibitori Dynasore per 10 min o rPCSK9 per 1 ora. Afflusso di LDL contrassegnato è aumentato di simvastatina in cellule HepG2 dopo 12, 18 o 24 trattamenti di h (D). I dati sono mean±SEM. N = 6 pozzetti/gruppo. I dati sono rappresentativi di 2 o 3 esperimenti indipendenti. p < 0,0001 mediante ANOVA a due vie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5 . Ridotto afflusso di LDL in cellule epatocellulari di carcinoma (HepG2) dall'agente di assorbimento-abbassamento del LDL, Dynasore. Immagini rappresentative dell'oggetto rosso per cellule HepG2 e oggetto di fase sono raffigurati a 0,33 h (pannelli a sinistra) e l'endpoint di 4,33 h (pannelli di destra) Mostra lo stato sano delle cellule. 40 µM Dynasore, conosciuto per ridurre l'assorbimento di colesterolo LDL, è stato usato come controllo positivo (C). Immagini sono state scattate a 10 ingrandimenti. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6 . Ridotto afflusso di LDL in umana epiteliali (HK2) le cellule tubolari renali da LDL agenti di riduzione assorbimento, Dynasore e rPCSK9. Immagini rappresentative dell'oggetto di fase e di oggetto rosso per cellule HK2 raffigurato a 0,33 h (pannelli a sinistra) e l'endpoint di 4,33 h (pannelli di destra) mostrano lo stato sano delle cellule. 40 µM Dynasore (C), o 10 µ g/mL rPCSK9 (D), noto per ridurre l'assorbimento del colesterolo LDL, sono stati usati come controllo positivo. Immagini sono prese a 10 ingrandimenti. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7 . Ridotto afflusso di LDL in cellule endoteliali umane dell'arteria coronaria (HCAECs) dall'agente di assorbimento-abbassamento del LDL, Dynasore. Immagini rappresentative dell'oggetto di fase e di oggetto rosso per HCAECs raffigurato a 0,33 h (pannelli a sinistra) e l'endpoint di 4,33 h (pannelli di destra) mostrano lo stato sano delle cellule. 40 µM Dynasore, conosciuto per ridurre l'assorbimento di colesterolo LDL, è stato usato come controllo positivo (C). Immagini sono state scattate a 10 ingrandimenti. Barra della scala = 100 µm. dati sono mean±SEM. N = 6 pozzetti/gruppo. I dati sono rappresentativi di 2 o 3 esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Tabella 1: definizione parametri di elaborazione. Questi parametri sono specifici per il sistema di analisi utilizzato nel presente protocollo. Per analizzare la zona rossa nel canale del rosso e l'area della cella nel canale fase dovrebbero essere impostati tutti i parametri. Impostazioni dei parametri per HepG2, HK2, linee cellulari HCAE sono presentate.

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Tabella 2: variazione percentuale di afflusso di LDL nelle cellule HepG2, HK2 e HCAE trattati con Dynasore, rPCSK9 o simvastatina a h. 4,3 (A) HepG2 cellule, cellule HK2 (B), (C) HCAE cellule e cellule HepG2 (D).

Discussione

Nel protocollo attuale, dimostriamo l'utilizzo dell'imaging di cellule vive come un nuovo e più efficace metodo per misurare l'assorbimento tempo reale LDL sopra un corso di tempo in varie linee cellulari umane. Cellule umane di carcinoma epatico (HepG2) sono comunemente usate negli studi di screening per abbassare il colesterolo therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Pertanto, abbiamo scelto questo tipo di cella per testare la capacità di un sistema di imaging di cellule vive per gli studi di afflusso di LDL. I nostri risultati indicano che le cellule HepG2 sono compatibili con questa nuova tecnica e il risultato in una curva sigmoidea che indica il continuo assorbimento di LDL per tutta la durata del test afflusso fino a 4,33 h come endpoint finale (Figura 2A e Figura 3 ).

Omeostasi del colesterolo gioca un ruolo importante nella fisiopatologia delle varie nefropatie. Infatti, l'accumulo di colesterolo in tessuto renale è un contributore importante alla fibrosi renale che conduce alla malattia renale cronica ed è una patologia importante in varie nefropatie28,29,30,31. Quindi, abbiamo esaminato il nostro metodo in cellule epiteliali renali umane di (HK2) come una popolare e affidabile di cellula utilizzata nel campo della Nefrologia. I nostri dati supportata anche la fattibilità del sistema di imaging cellule vive per misurare l'afflusso di LDL nelle cellule HK2. Come illustrato nella Figura 2B, cellule HK2 ha preso il colesterolo LDL in modo lineare per tutta la durata dello studio afflusso (4 ore).

Data l'importanza del metabolismo del colesterolo nello sviluppo e nella progressione di aterosclerosi32,33,41, la principale causa di malattia cardiovascolare, che a sua volta è il killer numero uno in tutto il mondo 42, abbiamo mirato a convalidare il nostro metodo in un tipo di cella aterosclerosi-relativa. Abbiamo usato le cellule endoteliali arteriose coronariche umane (HCAECs), come queste sono uno dei tipi di cella primi di essere esposti a un insulto di colesterolo nel lume dell'arteria coronaria di un paziente di aterosclerosi. I nostri dati illustrati nella Figura 2C indicano che questo metodo di afflusso di LDL funziona efficacemente anche con HCAECs. Il grafico risultante è una curva sigmoidea-come simile a quello delle cellule HepG2.

Per testare la validità e la sensibilità di questo test di afflusso di LDL migliorato per lo screening di composti che influenzano l'assorbimento del LDL-colesterolo, abbiamo utilizzato tre controlli, agenti di riduzione assorbimento di LDL Dynasore e rPCSK9 e attivatore di LDL afflusso Simvastatin. Qui, siamo trattati sopra menzionate linee cellulari (HepG2, HK2 e HCAECs) con concentrazioni ottimizzate di Dynasore o rPCSK9 prima del dosaggio di afflusso. I nostri risultati hanno mostrato che tutte tre le linee cellulari testati ha risposto ai trattamenti con le riduzioni significative in afflusso di LDL sopra un corso di 4 ore di tempo (Figura 2). Per esempio, a 4,33 h come il punto finale di tempo, trattamento con Dynasore a 40 µM significativamente ridotto afflusso di LDL in cellule HepG2, HK2 e HCAECs da 53%, 68% e 54%, rispettivamente (p < 0,0001; Figura 2 A-C e Tabella 2A-C). Inoltre, rPCSK9 a 10 µ g/mL ha causato una profonda riduzione del 55% in afflusso di LDL nelle cellule HK2 (p < 0,0001; Figura 2 B e tabella 2B). Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che trattando le cellule HepG2 con simvastatina ha provocato un profondo aumento nell'assorbimento di LDL (Figura 3), sostenere la sensibilità di questo metodo per rilevare alterazioni significative dell'afflusso di LDL. Studi del trattamento con rPCSK9 in cellule HepG2 e HCAEC non sono inclusi nel presente protocollo come rPCSK9 è usato come un trattamento di controllo aggiuntivo con risultati ben documentati, ma è costoso da acquistare in piccole quantità. Pertanto rPCSK9 è stato utilizzato solo per convalidare questo protocollo in cellule HK2.

Live cell imaging analisi, oltre alla misurazione funzionale e tempestiva di afflusso di LDL, consentito per il monitoraggio continuo della salute e della morfologia delle cellule. Questo vantaggio in modo efficiente è in grado di rilevare potenziali citotossicità dei composti applicate, rendendo questo metodo una tecnica ideale per il monitoraggio contemporaneamente citotossicità ed attività farmacologica. Figure 5-7 illustrano immagini rappresentative delle tre linee cellulari testati presso l'endpoint finale (4,33 h) come riferimento visivo per l'effetto dei trattamenti di forte afflusso netto di LDL e Mostra anche la morfologia sana delle cellule seguendo il collaudato trattamenti. Si consiglia di ispezione visiva di tutte le immagini da ogni pozzetto per assicurare la coperta di Erica morfologia delle cellule per tutta la durata dello studio. Ad esempio, in dati non indicati, quando le immagini delle cellule HepG2 trattate con 80 μM Dynasore sono stati ispezionati, abbiamo osservato indicazioni di distacco delle cellule, come i bordi delle cellule è sembrato essere sollevamento fuori la piastra, suggerendo il distacco delle cellule alle concentrazioni più elevate di Dynasore. Inoltre, alte concentrazioni di simvastatina (3-10 μM) inoltre ha condotto ad alterata morfologia che indica degli apoptosi indotti, come segnalato per gli alti dosaggi di statine45. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire una titolazione del trattamento Dynasore a 20-80 μM e simvastatina alla concentrazione di 0,5-10 μM, in seguito alla quale le immagini delle cellule sono state utilizzate per analizzare la salute delle cellule e determinare potenziali ctotoxicity dei trattamenti presso varie concentrazioni. Risultati hanno suggerito l'uso di 40 μM per Dyansore e 1 μM per le simvastatine come concentrazioni ottimali.

Infine, suggeriamo di eseguire uno studio di titolazione di densità cellulare se un'altra linea cellulare deve essere testato con questo metodo al fine di identificare il numero di cellulare ottimale per pozzetto per ottenere risultati coerenti. Il nostro studio di ottimizzazione di densità delle cellule ha dimostrato che 10.000 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti portare a esiti di afflusso LDL coerente per le cellule HK2 e HCAE. È importante notare che per questo test di afflusso di LDL utilizzando live cell imaging system, un monostrato di cellule non-confluenti distribuito uniformemente sui pozzi è desiderabile come grumi di cellule possono dar luogo a errori nel finali valori di afflusso di LDL normalizzati. La ragione di questo è che per la normalizzazione dei dati di afflusso, l'area oggetto di fase è utilizzato come una misura della densità delle cellule e questo parametro possa essere influenzato negativamente quando si formano grumi di cellule. Abbiamo osservato che le cellule HepG2 hanno la tendenza a forma grumi quando seminate ad una densità superiore a 5.000 cellule/pozzetto provocando risultati incoerenti afflusso; di conseguenza, abbiamo usato 5000 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti come densità ottimale per cellule HepG2.

Collettivamente, il nostro metodo fornisce una piattaforma di medio-alta velocità effettiva per l'attività farmacologica e la citotossicità di composti regolare afflusso di LDL contemporaneamente di screening. Questo metodo può essere facilmente adattato per l'uso con altri leganti con etichetta fluorescente che entrare nel compartimento lisosomiale per valutare l'assorbimento di ligando in tempo reale. Mentre questo protocollo offre specifiche per InCucyte live imaging e sistema di analisi, il protocollo può essere adattato per sistemi di imaging alternativi come Cellomics.

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni a LAS: National Institute of Health (R56HL132209 e 1R01HL140468) e l'Istituto di ricerca del cuore di Miami. KY è un destinatario della American Heart Association Predoctoral Fellowship (18PRE33960070). Cellule HepG2 sono state gentilmente concesse da Dr. Emmanuel Thomas, Università di Miami Miller School of Medicine46,47,48.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
pHrodo Red-LDLThermoFisher ScientificL34356
HepG2 cellsE. Thomas Lab, U. MiamiHB-8065
MEMSigmaM0325
Sodium PyruvateSigmaP5280
L-Glutamine 200 mM solutionSigmaG7513
FBSAtlas BiologicalsFP-0500-A
HK2 cellsATCCCRL-2190
Keratinocyte SFM media kitGibco17005-042
Primary Coronary Artery Endothelial CellsATCCPCS-100-020
Vascular Cell Basal MediumATCCPCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-VEGFATCCPCS-100-041
Human Lipoprotein Deficient SerumMilliporeLP4
PBSSigmaD8537
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200056
Trypsin-EDTA (0.05%)Gemini Bio-Products400-150
Trypsin Neutralizing SolutionATCCPCS-999-004
24 well plateFalcon353226
40 μM mesh cell strainerVWR10199-654
15 mL conical tubesVWR89039-666
50 mL conical tubesVWR89039-658
Trypan Blue Staining (0.4%)Life TechnologiesT10282
Counting SlidesBio-Rad145-0011
Incucyte ZoomSartoriusZoomImaging and analysis platform
Dynasore HydrateSigmaD7693
PCSK9 Recombinant ProteinCayman Chemicals20631

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