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  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l'accesso ottico all'ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l'imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall'attività per un periodo di diverse settimane.

Abstract

La microscopia a due fotoni è uno strumento fondamentale per le neuroscienze in quanto consente di soccorrere il cervello di animali vivi su scale spaziali che vanno dai livelli subcellulari aquelli di rete e su scale temporali da millisecondi a settimane. Inoltre, l'imaging a due fotoni può essere combinato con una varietà di compiti comportamentali per esplorare le relazioni causali tra la funzione cerebrale e il comportamento. Tuttavia, nei mammiferi, la penetrazione limitata e la dispersione della luce hanno un'imaging intravitale di due fotoni principalmente in regioni cerebrali superficiali, precludendo così lo studio longitudinale di aree del cervello profondo come l'ippocampo. L'ippocampo è coinvolto nella navigazione spaziale e nella memoria episodica ed è un modello di lunga data utilizzato per studiare i processi cellulari e cognitivi importanti per l'apprendimento e il richiamo, sia nella salute che nella malattia. Qui, una preparazione che consente l'accesso ottico cronico all'ippocampo dorsale nei topi viventi è dettagliata. Questa preparazione può essere combinata con l'imaging ottico a due fotoni a risoluzione cellulare e subcellulare in testa fissa, topi vivi anestesizzati per diverse settimane. Queste tecniche consentono l'imaging ripetuto della struttura neuronale o della plasticità evocata dall'attività in decine o centinaia di neuroni nell'ippocampale dorsale CA1. Inoltre, questa preparazione cronica può essere utilizzata in combinazione con altre tecniche come la micro-endoscopia, la microscopia a campo largo montata sulla testa o la microscopia a tre fotoni, espandendo così notevolmente la cassetta degli attrezzi per studiare i processi cellulari e di rete coinvolti nell'apprendimento e nella memoria.

Introduzione

Nei mammiferi, l'ippocampo è una regione chiave del cervello per la codifica e il richiamo di memorie episodiche e per la navigazione spaziale1,2,3,4. Per questo motivo, l'ippocampo è stato - ed è ancora - un modello molto importante per studiare i meccanismi di base che permettono al cervello di codificare e ricordare i ricordi5,6,7 o di navigare in un ambiente8 ,9 raccogliere ricompense ed evitare pericoli. Inoltre, la formazione dell'ippocampo è una delle regioni cerebrali in cui vengono generati nuovi neuroni per tutta la vita dei roditori10,11 e, eventualmente, degli esseri umani12,13. Infine, la degenerazione o la compromissione della formazione di ippocampali sono associati a disturbi neurologici e psichiatrici, tra cui il morbo di Alzheimer14.

Nei topi, l'ippocampo si trova a circa 1 mm sotto la superficie cerebrale15. La sua posizione ha impedito l'accesso ottico nel cervello intatto e, di conseguenza, gli studi longitudinali delle dinamiche ippocampali si sono affidati principalmente all'imaging a risonanza magnetica (MR), all'elettrofisiologia e alle analisi dell'imaging ex vivo. I metodi di imaging RM consentono di tracciare i processi biologici (ad esempio, l'espressione genica cambia16) nello stesso animale per più giorni, ma non hanno la risoluzione spaziale per discriminare i singoli neuroni. Le classiche tecniche elettrofisiologiche in vivo offrono una risoluzione temporale molto elevata e una squisita sensibilità ai cambiamenti nel potenziale della membrana. Tuttavia, hanno una risoluzione spaziale limitata e non hanno la capacità di tracciare in modo affidabile le stesse celle per periodi di tempo più lunghi. L'imaging ottico consente di studiare processi più diversificati in virtù delle sue elevate risoluzioni temporali e spaziali. Tuttavia, l'imaging ex vivo fornisce solo istantanee dei processi in corso, e quindi non è adatto per studi longitudinali durante i quali gli animali imparano e richiamano le informazioni.

L'imaging ottico in vivo combina alcuni vantaggi dell'imaging MR e dell'elettrofisiologia con quelli dell'imaging ottico. Pertanto, è molto adatto per analisi longitudinali e correlate delle dinamiche e del comportamento del cervello del topo. Questo è rilevante negli studi di processi biologici con scale temporali molto veloci (da millisecondi a secondi) o molto lente (da giorni a settimane). Esempi per tali processi che sono rilevanti per le neuroscienze sono la dinamica della tensione della membrana, i transitori Ca2,, la plasticità cellulare e i cambiamenti strutturali, che sono tutti ritenuti molto importanti per la formazione e il richiamo della memoria. Diversi metodi hanno esteso l'imaging in vivo all'ippocampo dorsale18,19,20,21,22. Preparazioni acute hanno permesso il monitoraggio dell'attività del neurone piramidale (PN) così come i loro dendriti e spine dendritiche per diverse ore20,22. Questo lasso di tempo temporale, tuttavia, non consente di studiare cambiamenti strutturali a lungo termine, che potrebbero essere alla base dell'apprendimento incrementale. I preparati cronici - in combinazione con micro-endoscopi23,24 o con obiettivi del microscopio standard a lunga distanza di lavoro (WD)21 - hanno permesso l'imaging ripetuto dell'ippocampo dorsale su diversi Settimane.

Qui, descriviamo una preparazione cronica che fornisce accesso ottico ricorrente al sottocampo CA1 dell'ippocampo dorsale dei topi viventi utilizzando una cannula di imaging permanentemente inserita. Questa preparazione consente l'accesso ripetuto al CA1 senza disturbi funzionali ed è adatta per l'imaging a due fotoni intravitali (2P) o ad epopeescenza ad ampio campo. Due esempi di imaging cronico del cervello profondo 2P nella CA1 dorsale dei topi vivi sono dettagliati: l'imaging longitudinale della struttura dendritica e la dinamica dendritica della colonna vertebrale e l'imaging longitudinale della plasticità articolata dall'attività. Vengono discussi i vantaggi e i limiti salienti della tecnica.

Protocollo

Tutti i metodi descritti sono stati approvati dal governo dell'Alta Baviera (licenza 2016_ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-16-48) e dallo Stanford and Max Planck Florida Institute for Neuroscience Administrative Panels on Laboratory Animal Care.

1. Preparazione della cannula di imaging

  1. Tenere un trapano di precisione su un supporto di perforazione fornito con un tavolo righello mobile.
  2. A clamp un tubo in acciaio inossidabile di 3,0 mm di diametro sul tavolo righello mobile.
  3. Tagliare il tubo a un anello metallico lungo 1,6 mm. Se i bordi dell'anello non sono smussati dopo il taglio, archiviare le irregolarità.
  4. Sciacquare l'anello metallico e un coperchio di vetro circolare di 4 mm di diametro in acetone 100% e lasciare asciugare per 5 min.
  5. Posizionare l'anello di metallo e il coperchio di vetro su un luogo di lavoro liscio, uniforme e pulito, sotto uno stereoscopio.
  6. Posizionare una goccia di adesivo ottico che cura i raggi UV su una superficie liscia, come una parabola Petri. Utilizzare un ago o una spatola per stendere l'adesivo per formare uno strato sottile (<0,5 mm).
  7. Utilizzare le pinze per immergere un lato dell'anello metallico nell'adesivo. Prestare particolare attenzione a non sigillare l'interno dell'anello. In questo caso, utilizzare un ago per rompere l'adesivo ottico nell'anello.
  8. Utilizzando lo stereoscopio, posizionare l'anello metallico al centro della vetrina di vetro con il lato dell'anello coperto da adesivo toccando il coperchio. Un sottile anello di adesivo dovrebbe formarsi all'interfaccia tra l'anello metallico e il coverslip. Evitare qualsiasi diffusione adesiva al centro della coverslip.
  9. Accendere l'unità di guida LED UV-curing e illuminare (365 nm) per 1 min.
    AVVISO: la luce UV provoca ustioni cutanee ed è un agente mutageno. Indossare occhiali anti-UV e coprire mani e braccia con guanti e un lab-coat per evitare l'esposizione della pelle.
  10. Per curare l'adesivo in modo uniforme, assicurarsi che tutti i lati dell'anello siano uniformemente illuminati cambiando la direzione della sorgente luminosa.
  11. Lasciare indurire l'adesivo per almeno 2 h, preferibilmente, durante la notte.
  12. Tenere saldamente la cannula dall'estremità aperta dell'anello metallico per mezzo di un emofuta. Utilizzando un trapano dentale dotato di un file rotante e lavorando sotto lo stereoscopio, file fuori la copertina di vetro in eccesso fino a filo con i lati dell'anello (Figura 1A).

2. Impianto della cannula di imaging sopra l'ippocampo dorsale

  1. Preparazione dell'attrezzatura e configurazione
    1. Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano puliti e sterili. Se si utilizza uno sterilizzatore di perline di vetro per la sterilizzazione, pulire gli strumenti e metterli nello sterilizzatore (impostato a 250 gradi centigradi) per 10 minuti, prima dell'uso. In alternativa, autoclave gli strumenti prima dell'uso.
    2. Preparare tutti i materiali necessari per l'intervento chirurgico, così come gli strumenti chirurgici, in modo che possano essere raggiunti facilmente.
    3. Assicurarsi che ci sia abbastanza farmaci appena preparati come antidolorifici o farmaci antinfiammatori.
    4. Assicurarsi che ci sia abbastanza isoflurane per tutta la durata dell'intervento chirurgico (circa 1 h per intervento chirurgico).
    5. Accendere il tappeto riscaldante e impostarlo a 37 gradi centigradi per mantenere stabile la temperatura animale durante l'anestesia.
    6. Assicurarsi che il sistema di scavenging per isoflurane funzioni.
    7. Aprire la valvola del flusso di ossigeno.
  2. Induzione dell'anestesia e fissazione animale
    1. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia al 3% di isoflurane in 1 L/min O2 e attendere che perda conoscenza. Valutare l'anestesia utilizzando il test di riflesso del pizzico della dita dei dei pezzi.
    2. Pesare l'animale.
    3. Applicare farmaci antinfiammatori (Meloxicam, 1mg/Kg) e antidolorifici (Vetalgin, 200mg/kg).
    4. Posizionare il mouse sul tappeto riscaldante. Assicurarsi che l'animale non sia a contatto diretto con il tappeto riscaldante per evitare ustioni termiche.
    5. Fissare la testa all'apparato stereotassico e posizionare il cono naso per coprire il muso. Per mantenere l'anestesia, diminuire l'isoflurane a 1,5-2%. Durante l'intervento, monitorare lo stato del mouse monitorando visivamente la respirazione e testando il riflesso del pizzico dei tipi. Regolare la percentuale di isoflurane, se necessario.
    6. Applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la disidratazione e la potenziale cecità.
      NOTA: Per l'anestesia e i farmaci per animali, sono possibili metodi alternativi e farmaci. Si prega di fare riferimento alla licenza animale e alla relativa letteratura.
  3. Impianto di cannula ottica
    1. Accendere la sorgente luminosa in fibra ottica.
    2. Rimuovere i capelli e disinfettare la pelle sopra la testa del topo.
    3. Utilizzando forbici e pinze, rimuovere il cuoio capelluto del mouse. Inizia facendo un piccolo taglio nel cuoio capelluto in una posizione vicino a lambda. Continuare aprendo il cuoio capelluto sui due lati. Prima muoversi lateralmente nella direzione delle orecchie, poi rotrally, nella direzione delle orbite oculari, per formare un triangolo sull'asse sagittale, circa 4 mm rostral a bregma. Prestare attenzione a non tagliare troppo vicino a orecchie e occhi, ma esporre bregma e lambda, così come le ossa parietali e la metà posteriore delle ossa frontali.
    4. Applicare una goccia di lidocaina (28,9% v/v in alcool) al cranio.
    5. Svuotare il periosteo e asciugare il cranio con un tampone di cotone.
    6. Posizionare le barre dell'orecchio, per fissare la testa del mouse.
    7. Fare una piccola craniotomia, utilizzando un micro-drill con una bava di 0,5 mm di larghezza. Posizionare il foro nell'osso frontale opposto all'ippocampo immagine, a circa 1,5 mm dalla sutura sagittale e a 2 mm di distanza dalla sutura coronale.
    8. Alveare una vite ossea in acciaio inossidabile di 0,86 mm nel foro del cranio.
    9. Se necessario, pulire i detriti e asciugare il cranio.
    10. Preparazione di una miscela di cemento adesivo rapido
      1. Con un cucchiaio piccolo (4,5 mm di diametro), erogare 1-1,5 palchi di l-polvere in un pozzo di miscelazione.
      2. Distribuisci 3-4 gocce di Base Rapida nel pozzo.
      3. Distribuisci 1 goccia di Universal Catalyst nel pozzo.
      4. Mescolare il mix per 5-10 s utilizzando un applicatore di precisione.
        NOTA: sono disponibili cementi alternativi. Si prega di fare riferimento alle istruzioni del produttore.
    11. Utilizzare applicatori di precisione per applicare rapido cemento adesivo sopra il cranio, vite e pelle circostante. Lasciare asciugare per 30 s a 1 min.
    12. Utilizzare un trapano trephine di 3,0 mm di diametro per fare una craniotomia nell'osso parietale. Posizionare il foro distante circa 1,5 mm dalla sutura sagittale e distante 2 mm dalla sutura lambdoide.
    13. Rimuovere con attenzione il lembo osseo.
    14. Controllare le dimensioni della craniotomia utilizzando la cannula per assicurarsi che si adatti. Utilizzare un micro-drill di 0,5 mm o 0,9 mm di larghezza per ingrandire la craniotomia, se necessario.
    15. Rimuovere le meningi con pinze Dumont.
    16. Ablate materia corticale, per raggiungere la capsula esterna. Utilizzare un ago contundente di 0,9 mm (calibro 19) collegato a una pompa a vuoto. Irrigare con salina per evitare la disidratazione del tessuto esposto e per lavare via il sangue residuo dopo il sanguinamento è risolto. Succhiare lentamente il tessuto corticale, 50-100 m alla volta, fino a quando la corteccia si stacca dalla capsula, esponendo le fibre del cingulum o del corpo callosum. Cambiare spesso l'ago, per evitare intasamenti.
    17. Le fibre si estendono principalmente in tre direzioni (Figura 1B). Sbucciare con attenzione le fibre dorsali fino a quando non sono esposte le fibre più profonde(alveus dell'ippocampo).
    18. Sciacquare il tessuto con la salina. Utilizzare pinze sottili per immergere la cannula inferiore in salina e posizionarlo sopra il foro del cranio. Cannula e tessuto devono essere sigillati dalla salina per evitare di intrappolare le bolle d'aria tra la cannula e il tessuto.
    19. Spingere la cannula nel cranio (Figura 1C) fino a quando il coperchio di vetro è a contatto con le fibre.
    20. Asciugare bene il cranio con triangoli di assorbimento, tamponi di cotone e/o la pompa a vuoto.
    21. Preparazione di una miscela di cemento adesivo rapido (fare riferimento al passaggio 2.3.10).
    22. Utilizzare applicatori di precisione per applicare un rapido cemento adesivo sul cranio. Applicare l'adesivo anche sul bordo della cannula. Fare attenzione a non far correre l'adesivo nella cannula. Lasciare asciugare per 30 s a 1 min.
    23. Utilizzare un braccio stereotassico per posizionare una piastra porta testa sopra la cannula, a contatto con il cranio.
    24. Preparazione di una miscela di acrilico dentale
      1. Con un cucchiaio di 9 mm di diametro, erogare un misurino di 1 livello (1 parte) di polvere in un pozzo di miscelazione.
      2. Distribuisci 2-3 parti di liquido nello stesso pozzo. Coprire l'intera polvere con il liquido.
      3. Mescolare per 1 min utilizzando una spatola.
        NOTA: sono disponibili acrilici alternativi. Si prega di fare riferimento alle istruzioni del produttore.
    25. Utilizzare una spatola o un applicatore di precisione per applicare l'acrilico attraverso il cranio. Coprire l'intero cranio esposto, la vite e la pelle aperta con acrilico dentale. Questo rende stabile la preparazione. Non lasciare che l'acrilico corri giù per il collo, le orecchie e gli occhi.
    26. Lasciare asciugare e indurire l'acrilico per circa 15 min.
    27. Applicare una pellicola adesiva rimovibile sulla piastra del supporto della testa, per evitare che i detriti entrino nella cannula. Si raccomanda che la dimensione della pellicola corrisponda a quella della piastra.
    28. Spegnere il flusso isoflurane, rimuovere l'animale dall'apparato stereotassico e posizionarlo su una piastra di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea fisiologica mentre si sveglia dall'anestesia.
    29. Monitorare l'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente consapevolezza per mantenere la recumbency sternale.
    30. Restituire l'animale che ha subito un intervento chirurgico alla compagnia di altri animali solo quando completamente recuperato.

3. Cura postoperatoria

  1. Controllare lo stato del mouse per 2 giorni dopo l'intervento chirurgico, monitorando il peso e il comportamento generale.
  2. Applicare farmaci antinfiammatori (Meloxicam, 1mg/Kg) e antidolorifici (Vetalgin, 200mg/kg) sottocutaneamente per 2 giorni dopo l'intervento chirurgico
    NOTA: procedure di monitoraggio alternative, farmaci e dosaggi sono possibili per le cure postoperatorie. Si prega di fare riferimento alla licenza animale e alla relativa letteratura.

4. Preparazione della sessione di imaging

  1. Accendere in anticipo la configurazione dell'imaging e lasciare che il laser si riscaldi e si stabilizzi, se necessario.
  2. Anestesizzare il mouse (fare riferimento al passaggio 2.2.1).
  3. Utilizzare le pinze per rimuovere con attenzione la pellicola adesiva dalla piastra del supporto della testa. Tenere il mouse in una mano e la piastra porta testa con le dita. Rimuovere delicatamente la pellicola, per evitare di danneggiare la preparazione.
  4. Posizionare il mouse sotto il microscopio, sopra il tappeto di riscaldamento e fissare la piastra di testa al supporto (Figura 1D).
  5. Posizionare il cono nasale per coprire il muso e diminuire l'isoflurane al 1,5-2%.
  6. Applicare unguento oftalmico agli occhi del mouse.
  7. Pulire la cannula di imaging risciacquando con acqua deionizzata. Utilizzare una siringa e un ago sottile per far cadere l'acqua nella cannula e una pompa a vuoto per rimuoverla.

5. Sessione di imaging

  1. Utilizzare obiettivi a bassa ingrandimento e lunga distanza di lavoro per controllare visivamente la cannula per l'acqua residua, sporcizia, integrità e la presenza di fluorescenza.
  2. Allineare la cannula all'asse ottico regolando gli angoli dei bracci del portatesta.
  3. Passare agli obiettivi di immersione in acqua 25X 1.0 NA, 4 mm o 40X 0,8 NA, WD 3 mm. Aggiungere abbastanza acqua deionizzata per riempire la cannula e mantenere l'acqua in eccesso sulla parte superiore della cannula. Evitare la formazione di bolle d'aria.
  4. Utilizzare segnali fluorescenti a 2P e immagini.
    NOTA: il protocollo di imaging dipende fortemente dal tempo e dalle scale spaziali da immaginare. Fare riferimento alle sezioni risultati rappresentativi e discussione per i dettagli sulle impostazioni di imaging che abbiamo utilizzato per produrre le immagini mostrate in questo articolo.

Risultati

Poiché la cannula è posta appena dorsale a CA1, l'aspetto dorsale del CA1 è più prossimale al microscopio rispetto a quello ventrale. L'alveo è la struttura più prossimale seguita in ordine da stratum oriens (SO), strato piramidale (SP), strato radiato (SR) e strato lacunosum molecolare (SLM), lo strato più distale (Figura1B , C). L'imaging longitudinale 2P della struttura neuronale con risoluzione subcellulare e della plasticità evocata dall'attività con risoluzione cellulare è presentata come risultati rappresentativi. Per eccitare la proteina fluorescente verde fluoreres fluoreres fluoreres (GFP), d2Venus e TurboFP635, viene utilizzato un laser Ti:Sapphire a impulsi femtosecondi sintonizzato a 920 nm e la potenza media del laser viene regolata a 5-25 mW nel campione. Le diverse lunghezze d'onda di emissione sono separate utilizzando filtri di emissione e diversi tubi fotomoltiplicatori.

Imaging longitudinale della struttura dendritica e della dinamica delle spine dendritiche.

Per etichettare raramente i PN ippocampali e visualizzarne la struttura, viene utilizzata una linea di topo transgenico Thy1-GFP (linea M). I topi Thy1-GFP esprimono la GFP potenziata citoplasmica sotto il controllo del promotore Thy1 in una popolazione scarsa e casuale di PN25. In genere, l'asse principale dei CA1 PN è approssimativamente perpendicolare al piano xY-imaging (Figura1B, Figura 2A e Film supplementare 1). I dendriti basali si estendono nel SO, dal soma verso la cannula, mentre i dendriti di ciuffo apico e apicale estendono distacreto alla cannula, nella direzione opposta (Supplementary Movie 1). Poiché la preparazione lascia intatte le fibre più profonde dell'alveo, alcune fibre fluorescenti che attraversano il campo visivo, appena sotto la cannula, dovrebbero essere visibili (Figura 2A e Film 1). La preparazione consente l'imaging di dendriti PN con risoluzione della colonna vertebrale (Figura 2 A-C). Per immagini dendriti e spine dendritiche, viene utilizzato un obiettivo commerciale 25X 1.0 NA, 4 mm WD, immersione in acqua.

Per il tracciamento longitudinale, diverse regioni cerebrali nel campo visivo della cannula sono definite durante la prima sessione di imaging. Ogni regione corrisponde a un'area di circa 240 x 240 m e contiene tra 1 e 7 segmenti dendritici (Figura 2B). Queste regioni vengono mappate manualmente a uno stack tridimensionale a basso ingrandimento che mostra il modello di espressione GFP nel volume al di sotto della cannula di imaging (Figura 2A). Quindi, 1 stack di immagini z-step di dendriti basali CA1 PN vengono acquisiti a intervalli di tempo diversi (da 24 h a 3 giorni) per un massimo di circa 14 giorni (Figura 2C). Sono possibili durate e intervalli di imaging più lunghi26. Ogni sessione di imaging dura circa 60-90 min. Anche se la maggior parte delle immagini sono di spine dendritiche nel SO, è anche possibile immagini di spine dendritiche nei dendriti obliqui di SR (Figure 2D-F). Oltre alla densità della colonna vertebrale, questo metodo consente lo studio delle dinamiche della colonna vertebrale quantificandone la sopravvivenza, i tassi di guadagno e perdita26,27,28,29,30, 31 Milia , 32. Per segnare e tenere traccia delle spine dendritiche nel tempo (Figura 2C), viene utilizzata un'interfaccia MATLAB personalizzata. Ciò consente l'allineamento delle pile di immagini acquisite in diversi punti temporali e supporta l'etichettatura manuale di dendriti e spine monitorando le lunghezze dendritiche e le posizioni della colonna vertebrale nel tempo26. È importante sottolineare che questo metodo può essere utilizzato per distinguere (per ogni punto temporale, escludendo il primo) tra spine dendritiche preesistenti e neonate. Questo è importante in quanto le diverse classi di spine dendritiche sono pensati per avere ruoli diversi nell'acquisizione della memoria e conservazione33.

Imaging longitudinale della plasticità evocata dall'attività.

Per immagini di plasticità evocata dall'attività nei CA1 PN, l'area dorsale ca1 ippocampale viene iniettata con un vettore virale che esprime d2Veneto fluorescente verde attraverso una forma potenziata dell'elemento sinaptico che risponde all'attività (E-SARE) all'interno dell'Arco esolvatore/promotore e fluorescente rosso TurboFP635 tramite il promotore ePGK 34. Ciò consente di imaging livelli di plasticità di centinaia di CA1 PN in ogni animale35. Data l'etichettatura molto densa dei PN, in genere non è possibile risolvere i dendriti dei CA1 PN (Supplementary Movie 2).

Per immaginare il somata dei CA1 PN, viene utilizzato un obiettivo 40X 0.8 NA, 3 mm WD, obiettivo di immersione dell'acqua. Per il tracciamento longitudinale, da 1 a 9 regioni cerebrali sono definite per mouse durante la prima sessione di imaging. Ogni regione corrisponde a un'area di circa 300 x 300 m e contiene tra 50 e 150 celle (Figura 3A). Queste regioni sono mappate manualmente ai punti di riferimento del tessuto locale visibili con un ingrandimento inferiore. Quindi, vengono acquisiti 3 stack di immagini z-step, che comprendono il SP di CA1 PN (Figura3A e Supplementary Movie 2) a intervalli di tempo diversi (da 24 h a 6 giorni) per un massimo di circa 30 giorni. Ogni sessione di imaging dura circa 60-90 min. Così, generalmente immagine 6 a 8 h dopo l'esperienza e consentono per 5 giorni tra le sessioni di imaging35.

Per quantificare i valori di fluorescenza d2Venus e TurboFP635, viene disegnata una regione circolare di 4,64 m di diametro, che è più piccola di un corpo cellulare neurale, centrata sul soma cellulare. Quindi avanziamo al momento successivo, descriviamo il soma della stessa cella nello stesso modo e iterare questa procedura per tutti i punti temporali e tutte le celle visibili nel set di dati longitudinale. Il valore medio dell'emissione di d2Venus di ciascun neurone (dipendente dall'attività) è normalizzato dalla sua emissione media (indipendente dall'attività) di TurboFP635. Questo metodo consente di sforare le dinamiche a lungo termine della plasticità dell'insieme di CA1 PN35 (Figura 3C).

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Figura 1: Preparazione per l'imaging ottico profondo del cervello in vivo. (A). Viste in alto (a sinistra) e laterali (destra) di esempio di imaging cannuals. Le cannule di imaging hanno un fondo in vetro trasparente per consentire l'accesso ottico all'ippocampo. (B). Descrizione schematica della preparazione evidenziando la posizione relativa della cannula di imaging, un CA1 PN e i tre strati di fibre da dorsale a ventrale. (C, D). Descrizione schematica della configurazione di imaging (C) e della fissazione animale (D) durante una sessione di imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Imaging longitudinale della struttura dendritica e della dinamica delle spine dendritiche. (A). 2P stack di immagini (Maximum Intensity Projection (MIP) di 59 piani di immagine, 2 z-spacing) di neuroni e dendriti etichettati da GFP in un mouse vivo Thy1-GFP. (B). Ingrandimento superiore (MIP di 53 piani di immagine, 1 z-spacing) che dettagliano i dendriti basali situati in SO. (C). Sequenza di immagini time-lapse di un segmento dendritico immagine su 14 giorni. Le punte delle frecce indicano spine dendritiche tracciate nell'arco di 14 giorni. (D, E). pila di immagini 2P di neuroni e dendriti etichettati da GFP in un topo vivo Thy1-GFP; (D) Proiezione y (31 piani d'immagine, 3 xm z-spacing) e (E) proiezioni XY (17 piani dell'immagine, 3 z-spacing). (F). L'ingrandimento più alto (piano a immagine singola) che descrive i dendriti apici e le spine dendritiche situate in SR. Arrowheads indicano spine dendritiche. Eccitazione: 920 nm; picco di emissione: 510 nm. Barre della scala: A, 50 m; B, 10 m; C, 2 m; D ed E, 15 m; F, 4 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Imaging longitudinale della plasticità evocata dall'attività. (A). 2P immagini (piani immagine singola) da un mouse dal vivo, mostrando le stesse celle il giorno di base 0 e dopo EE il giorno 1. (B). 2P pile di immagini (MIP di 4-6 piani di immagine, 3 z-spacing) che mostrano i modelli di attivazione E-SARE specifici per l'ambiente A (giorni 1, 19 e 25) e l'ambiente B (giorni 7 e 13). Verde: fluorescenza di d2Venus. Rosso: fluorescenza TurboFP635. Eccitazione: 920 nm; d2Venus picco di emissione: 530 nm; Picco di emissione TurboFP635: 635nm. Barre della scala: A, 20 m; B, 10 m. Questa cifra è stata modificata da Attardo et al., 201835. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Imaging della struttura neuronale nella DG ippocampale utilizzando la microscopia a tre fotoni (3P). (A-H). Immagini 3P (piani a immagine singola) di neuroni e dendriti etichettati da GFP in un mouse dal vivo Thy1-GFP che dettaglia (A-E) PN nelle cellule di granulosa CA1 e (F-H) nella DG. Eccitazione: 1400 nm; picco di emissione: 510 nm. Barra della scala: 40 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare Film 1: Campo visivo in un mouse dal vivo Thy1-GFP. Pila di immagini 2P (83 piani di immagine, 7 z-spacing) di neuroni e dendriti etichettati da GFP (bianco) in un mouse vivo Thy1-GFP che si estende dal fondo della cannula a SLM. Per tenere conto del decadimento del segnale di fluorescenza con un aumento della profondità, abbiamo usato un gradiente non lineare del guadagno dei tubi fotomoltiplicatori. Fare clic qui per scaricare questo file.

Filmo supplementare 2: Imaging della plasticità evocata dall'attività. Stack di immagini 2P (28 piani di immagine, 3 z-spacing) di neuroni che esprimono il reporter E-SARE dell'espressione IEG in un topo vivo che comprende la fluorescenza SP. Green: d2Venus. Rosso: fluorescenza TurboFP635. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Qui, viene descritta una procedura per l'imaging 2P ripetuto del CA1 dorsale nei topi vivi. Dopo l'intervento chirurgico, il topo di solito si riprende entro 2 giorni. La procedura induce astrogliosi minima26,43. Emorragia ed edema che potrebbero seguire l'intervento chirurgico sono di solito ri-adsorbito entro 10 a 14 giorni. In generale, da 14 giorni dopo l'impianto in poi la preparazione è sufficientemente chiara per eseguire l'imaging intravitale. Il successo dell'intervento chirurgico non dipende dal lavoro in un ambiente sterile. Tuttavia, è fondamentale mantenere un alto livello di igiene, per evitare complicazioni dovute a infezioni associate alla chirurgia. Ciò si ottiene pulendo meticolosamente gli strumenti chirurgici prima e dopo l'intervento chirurgico e sterilizzandoli a caldo immediatamente prima di ogni utilizzo (passaggio 2.1.1). La cannula ottica viene conservata in un contenitore pulito e sterilizzato e sciacquata con salina sterile poco prima dell'impianto. Anche l'esecuzione di pratiche chirurgiche comuni di disinfezione delle mani e pulizia della stazione chirurgica è molto importante. La preparazione rimane stabile e consente l'imaging a risoluzione cellulare e subcellulare per diverse settimane26,35.

Passaggi critici, modifiche e risoluzione dei problemi.

È importante sbucciare la capsula esterna fino a quando le fibre più profonde sono esposte. La mancata esposizione dell'alveo potrebbe comportare l'incapacità di concentrarsi sul soma dei PN o in spine dendritiche di imaging a risoluzione ridotta, quando si utilizzano obiettivi commerciali con WD da 3 o 4 mm. A questo scopo, è utile ablate la neocorteccia molto lentamente utilizzando un ago di 0,9 mm di diametro e quindi passare a un ago di 0,3-0,5 mm di diametro (24-29 gauge) per un controllo più fine dell'aspirazione quando si rimuovono le fibre più dorsali. In alternativa, le pinze sottili possono essere utilizzate per rimuovere la corteccia rimanente dopo l'esposizione alle fibre36.

Sanguinamento durante l'intervento chirurgico può essere problematico, come il sangue ostruisce la vista. Si raccomanda l'attesa che il coagulo si formi e poi si risciacqua con salina per lavare via il sangue residuo. Se necessario, ripetere l'operazione.

Un aderente tra la cannula e la craniotomia aiuta ad aumentare la stabilità della preparazione mantenendo la cannula in posizione prima dell'applicazione del cemento, soprattutto se il bordo esterno della cannula è a filo con il cranio. Poiché le dimensioni del trapano trephine e della cannula sono abbinate, una vestibilità libera può sorgere a causa di irregolarità sul lato della cannula - che richiedono craniotomie leggermente più grandi per adattarsi (vedi passo 2.3.14) - o da una craniotomia irregolare. Eventuali irregolarità della cannula devono essere archiviate (passaggi 1.3 e 1.12) e la trefine deve essere tenuta perpendicolare al cranio fino al completamento della cranio (passaggio 2.3.12). La rimozione della trefina dal cranio prima del completamento della craniotomia può provocare craniotomie irregolari.

Limitazioni... Invasività e stabilità della preparazione.

È difficile valutare l'effetto dell'ablazione corticale in quanto è difficile definire con precisione le aree colpite direttamente e indirettamente. In generale, l'intervento chirurgico rimuove parte della corteccia parietale e parte della corteccia sensoriale arti visivi e posteriori21. La corteccia ablatata non si proietta direttamente nell'ippocampo e il tessuto ippocampale non viene né toccato né ferito. È importante sottolineare che l'impianto di una cannula di imaging non altera grossolanamente la funzione ippocampale e in particolare l'apprendimento dipendente dall'ippocampo21,36,37,38, 39. Tuttavia, sarebbe importante quantificare in che misura sia la cannula che la parte esterna dell'impianto (piastra del supporto della testa e tappo acrilico dentale) sono fattori di stress cronici valutando i livelli ematici del corticosterone e il peso della ghiandola surrenale rispetto topi non impiantati.

La preparazione rimane generalmente stabile da settimane a mesi26. A lungo termine, la crescita della pelle e delle ossa tende a sposto il cappuccio acrilico e ad aumentare l'instabilità della preparazione dell'imaging.

Limitazioni ottiche.

La microscopia 2P convenzionale consente di imaging fino a circa 1 mm di profondità nel tessuto neocorticale40,41. Coerentemente con questo, è possibile immagine dendriti e spine dendritiche situate nella SR (Figura 2D-F) o SLM36. Tuttavia, l'imaging attraverso una cannula pone limitazioni all'efficace NA. Per ottenere la massima risoluzione, il diametro e la profondità delle cannule di imaging devono essere abbinati all'imaging NA, poiché diametri più piccoli e profondità più lunghe imlimiteranno la luce di alti obiettivi NA. Ad esempio, quando si crea un obiettivo di immersione dell'acqua di 1,0 NA attraverso una cannula lunga 1,6 mm, è necessario un diametro interno di 3,65 mm per mantenere il NA completo. Tuttavia, utilizzando una cannula di questo diametro aumenterà la compressione sull'ippocampo e potrebbe influenzare la salute del tessuto, per questo motivo, usiamo una cannula con un diametro più piccolo. Quando si crea un obiettivo di immersione dell'acqua di 0,8 NA attraverso una cannula lunga 1,6 mm, un diametro interno di 2,5 mm sarebbe sufficiente per mantenere l'intero NA. Tuttavia, gli obiettivi di immersione dell'acqua 0,8 NA hanno un WD più corto (3 mm nel nostro caso), che può impedire di concentrarsi sul SP.

Questi calcoli si applicano al centro del campo visivo nella parte inferiore della cannula. Tuttavia, spostando il campo di imaging della vista lateralmente - più vicino ai bordi della cannula - o concentrandosi più in profondità nel tessuto - più lontano dalla superficie di vetro della cannula - diminuisce ulteriormente la NA efficace al piano focale e quindi riduce la risoluzione. Questo porterà a una risoluzione non omogenea tra i diversi volumi di tessuto immagine e può essere una preoccupazione per l'imaging quantitativo a risoluzione subcellulare, soprattutto quando si utilizzano tecniche di super-risoluzione come la microscopia 2P-STED42. Questi problemi sono meno importanti quando si esegue l'imaging a risoluzione cellulare.

Movimento dei tessuti.

Il movimento all'interno del tessuto - proveniente dalla respirazione e dal battito cardiaco negli animali anestesi - tende a diventare più grave con una maggiore distanza dalla cannula di imaging. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che la cannula di imaging applica una pressione meccanica al cervello contrastando così parte del movimento nelle vicinanze della cannula (simile alle preparazioni neocorticali). Così, anche se l'imaging delle spine dendritiche è possibile in SR e SLM, nelle nostre mani, è più robusto dorsale alla SO fino a 200 m dalla superficie della cannula. Per compensare il movimento, utilizziamo scanner risonanti e una media offline. Diverse immagini (da 4 a 6 ripetizioni) vengono acquisite per piano di immagine di una z-stack alla velocità massima disponibile (30 fotogrammi/s). Tutte le ripetizioni per ogni z-plane vengono quindi deconvolved (utilizzando il software commerciale, AutoQuant), registrato (utilizzando ImageJ) e mediato in una singola immagine26. Per l'imaging di somata, il movimento è spesso trascurabile su anestesia35 e due medie sono spesso sufficienti per compensare gli artefatti di movimento.

Applicazioni future o indicazioni del metodo .

La preparazione può essere combinata con micro-endoscopi26,43. I microendoscopi sono sonde ottiche rigide che utilizzano microlenti indice di refrattivo a gradiente (GRIN) per guidare la luce da e verso il tessuto profondo18. L'uso di micro-endoscopi permette cannule di diametri più piccoli o addirittura nessuna cannula. Tuttavia, i micro-endoscopi commerciali sono meno ben corretti per le aberrazioni ottiche e hanno NA inferiore rispetto agli obiettivi commerciali. Le sonde di corrente raggiungono risoluzioni laterali e assiali di 0,6-1 m, 10-12 m, rispettivamente17,18,44. L'uso di micro-endoscopi consente anche la combinazione di questa preparazione con microscopi widefield integrati montati sulla testa45,46,47.

Il metodo si presta anche all'uso in topi non anestesizzati, ed è stato utilizzato per studiare l'attività cellulare utilizzando sensori Ca2 o nei topi svegli fissati alla testa21,37,48,49. In questi casi, a causa delle scale temporali veloci dei cambiamenti di fluorescenza, si consiglia di implementare la registrazione della linea50. È anche possibile adattare la preparazione per l'imaging di altre sottoregioni ippocampali come il giro dentato (DG)39,51,52. Combinando questa preparazione con eccitazione 3P53,54 con 1 MHz frequenza pulsato laser sintonizzato a 1400 nm, siamo stati in grado di immagine più in profondità nella formazione ippocampale raggiungendo lo strato molecolare, strato di cellule di granulo e il dell'DG (Figura 4) senza rimuovere la sovrapposizione CA1.

In conclusione, presentiamo un metodo che fornisce l'accesso ottico all'ippocampo dorsale e permette studi longitudinali e correlati delle dinamiche della struttura e dell'attività ippocampale. Questa tecnica estende le possibilità di analisi della funzione ippocampale in condizioni fisiologiche e patologiche.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

U. A. F. è sostenuta dalla fondazione Schram; C.-W. T. P. e W. G. sono supportati dalla Max Planck Society; L.Y. e R.Y. sono supportati dalla Max Planck Society e dal National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. è sostenuto da una sovvenzione del 7PQ del Consiglio europeo delle ricerche, dei programmi ERANET e I-CORE, dell'Ufficio Capo Scienziato del Ministero della Salute israeliano, del Ministero federale dell'istruzione e della ricerca, di Roberto e Renata Ruhman, di Bruno e Di Simone Lich, Nell e Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, l'Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, the Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt e Irving I. Moskowitz fondazioni; A. A. è supportato dalla Max Planck Society, dalla fondazione Schram e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Le immagini 3P sono state acquisite durante il Corso Avanzato sulle Tecniche di Neuroimaging presso il Max Planck Florida Institute for Neuroscience. Il corso avanzato sulle tecniche di neuroimaging è supportato dalla Max Planck Society, il programma Florida State Max Planck Scientific Fellowship e dal max Planck Florida Institute Corporation Partnership Program. Ringraziamo Thorlabs, Coherent e SpectraPhysics per aver fornito supporto e attrezzature per il sistema di imaging 2P / 3P durante il corso. Siamo anche grati a Henry Haeberle e Melissa Eberle per l'assistenza con il sistema durante il corso.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Professional drill/grinder IBS/EProxxon GmbH28481Pecision drill
MICROMOT drill stand MB 200Proxxon GmbH28600Movable ruler table
MICRO compound table KT 70Proxxon GmbH27100Movable ruler table
Machine vice MS 4Proxxon GmbH28132Movable ruler table
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mmSawadeR00303Stainless steel tube for the cannula metal ring
Microscope Cover glass (4 mm round)Engelbrecht Medizin and LabortechnikGlass coverslips for the cannula glass
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im BlechetuiHoffmann Group713750 160Manual files
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4Hoffmann Group527230 4Manual files
UV-Curing Optical AdhesivesThorlabsNOA81UV-curing adhesive
UV Curing LED System, 365 nmThorlabsCS2010UV-curing LED driver unit
Stemi 305ZeissStereoscope
Presto IINSK-Nakanishi GermanyZ307015Dental drill
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 feinMF DentalF837.014.FGFiles for the dental drill
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grobMF DentalG837.014.FGFiles for the dental drill
Graefe Forceps - Straight / SerratedFine Science Tools11050-10Forceps for the surgery
Burrs for Micro DrillFine Science Tools19008-050.5 mm width burr for the micro-drill
Burrs for Micro DrillFine Science Tools19008-090.9 mm width burr for the micro-drill
MicroMotor mit HandstückDentaTecMM11Micro-drill for the craniotomy
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11231-30Dumont forceps for the surgery
Fine Scissors - ToughCutFine Science Tools14058-09Scissors for the surgery
TrephineMW Dental229-020Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill
Stainless Steel Self-Tapping Bone ScrewsFine Science Tools19010-100.86 mm width bone screws
Stereotaxic apparatusKopfStereotaxic apparatus
3-D-GelenkarmHoffmann Group442114Stereotaxic arm and plate holder
Aufnahme 2SMHoffmann Group442100 2SMStereotaxic arm and plate holder
Hot Bead SterilizersFine Science Tools18000-45Glass beads sterilizer
Isofluran CP, Flasche 250 mlHenry Schein VET GmbH798932Liquid isoflurane for anesthesia
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill VaporizerHarvard Apparatus GmbH34-1040Isoflurane vaporizer
Lab Active ScavengerGropper MedizintechnikUV17014Isoflurane scavenger system
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 mlHenry Schein VET GmbH798566Meloxicam, anti-inflammatory
Vetalgin 500 mg/mlMSD TiergesundheitVetalgin, pain killer
CMA 450 Temperature ControllerHugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH8003770Heating blanket
Bepanthen Augen- und NasensalbeBayer AGOphtalmic ointment
KL 1500 LCDSchottFiber optic light source
Xylocain PumpsprayAstraZeneca GmbHLidocain, local anesthetic
Absorption Triangles - UnmountedFine Science Tools18105-03Absorption triangles for the surgery
Parkell C&B Metabond clear powder LHofmeester dental013622Quick adhesive cement
Parkell C&B Metabond Quick Base BHofmeester dental013621Quick adhesive cement
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst CHofmeester dental013620Quick adhesive cement
Adjustable Precision Applicator BrushesParkellS379Precision applicators for the surgery
Blunt needles 0.9x23 mmDentina0441324Blunt needles
Blunt needles 0.5x42 mmDentina0452155Blunt needles
Blunt needles 0.3x23 mmDentina0553532Blunt needles
Kallocryl A/CSpeiko1615Acrylic liquid component
KallocrylSpeiko1609Acrylic powder
Hydrofilm transparent rollHartmannAdhesive film
Head platesCustom made30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium
Head plate clampCustom madeHead plate holder
Pedestal post holdersThorlabsPH20E/MHead plate holder
Stainless steel postThorlabsTR30/MHead plate holder
Stainless steel postThorlabsTR75/MHead plate holder
Stainless steel postThorlabsTR150/MHead plate holder
Post connector clampsCustom madeHead plate holder
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 TapsThorlabsMB3045/MMicroscope stage
7" x 4" Lab JackThorlabsL490/MMicroscope stage
Low profile face mask small miceEmka TechnologiesVetFlo-0801Anesthesia facemask holder
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical TableNewportFloating table
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-LevelingNewportFloating table
Power Meter Model 1918-RNewportPower meter
X-Cite 120QExcelitas TechnologiesFluorescence lamp
Two-photon microscopeBrukerUltima IVTwo-photon microscopes
Two-photon microscopeThorlabsBergamoTwo-photon microscopes
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22OlympusObjectives
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22OlympusObjectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5OlympusObjectives
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18OlympusObjectives
Ultafast tunable laser for 2P excitationSpectraphysicsMai Tai Deep SeeExcitaiton lasers
Ultafast tunable laser for 2P excitationSpectraphysicsInSight DS+ Dual beamExcitaiton lasers
Ultafast tunable laser for 3P excitationCoherentMonacoExcitaiton lasers

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