Implementazione di precisione dei test di dose minima di erithema (MED) per valutare la variazione individuale nella risposta infiammatoria umana

Riepilogo

Il test minimo della dose di erithema (MED) viene utilizzato per stabilire orari di dosaggio per la fototerapia delle radiazioni ultraviolette. Può valutare la variazione individuale nella risposta infiammatoria, ma manca di metodologia per ottenere risultati riproducibili. Qui, presentiamo un'implementazione di precisione di MED e dimostriamo la sua capacità di catturare variazioni individuali nella risposta infiammatoria.

Abstract

Il test minimo della dose di erithema (MED) viene spesso utilizzato in ambienti clinici per determinare la minima quantità di irradiazione ultravioletta (UV) necessaria per produrre l'erithema (arrossamento infiammatorio) sulla superficie della pelle. In questo contesto, il MED è considerato un fattore chiave nel determinare le dosi iniziali per la fototerapia UV per condizioni comuni della pelle come la psoriasi e l'eczema. Nelle impostazioni di ricerca, il test MED ha anche il potenziale per essere un potente strumento per valutare la variazione all'interno e tra le persone nelle risposte infiammatorie. Tuttavia, i test MED non sono stati ampiamente adottati per l'uso in contesti di ricerca, probabilmente a causa della mancanza di linee guida pubblicate, che è un ostacolo per ottenere risultati riproducibili da questo saggio. Inoltre, i protocolli e le attrezzature per stabilire il MED variano ampiamente, rendendo difficile confrontare i risultati tra i laboratori. Qui descriviamo un metodo preciso e riproducibile per indurre e misurare l'erithema superficiale utilizzando protocolli e metodi di nuova progettazione che possono essere facilmente adattati ad altre apparecchiature e ambienti di laboratorio. Il metodo qui descritto include dettagli sulle procedure che consentiranno l'estrapolazione di un programma di dosaggio standardizzato ad altre apparecchiature in modo che questo protocollo possa essere adattato a qualsiasi fonte di radiazione UV.

Introduzione

Il test minimo della dose di erythema (MED) è una procedura approvata dalla FDA per valutare la sensibilità cutanea alle radiazioni tipicamente nella gamma UVB, anche se il MED può essere determinato ad altre lunghezze d'onda nei raggi UV e nello spettro visibile¹. L'erythema è definito come arrossamento superficiale sulla superficie della pelle causato dall'ingorgo dei capillari (le fasi successive dell'erythema sono più comunemente conosciute come scottature solari). I test MED sono stati ampiamente utilizzati nella letteratura dermatologica e nelle impostazioni di fototerapia clinica per identificare la quantità minima di radiazioni ultraviolette (UV) che produrranno la più piccola unità di cambiamento misurabile nel rossore della pelle. I test MED possono essere effettuati con una lampada UV disponibile in commercio, equivalente a quella utilizzata nella maggior parte degli impianti di concia commerciali.

Il test MED comporta la dispersione continua della radiazione UV o della luce dallo spettro visibile sulla superficie della pelle per un periodo di tempo predeterminato, con programmi di dosaggio a seconda principalmente della pigmentazione della pelle e dell'intensità e del tipo di radiazioni . Questa procedura è comunemente utilizzata in ambienti clinici per determinare gli orari di dosaggio per i pazienti che ricevono radioterapia UV per condizioni della pelle come la psoriasi e l'eczema^2,3. Le procedure di base per determinare il MED in ambienti clinici sono state descritte altrove⁴e possono essere utilizzate per regolare il dosaggio totale delle radiazioni UV verso l'alto o verso il basso, a seconda della variazione individuale nella sensibilità della pelle.

La pigmentazione della pelle è forse la variabile più importante specifica del soggetto nel condurre e misurare i risultati della procedura MED⁶. Questo perché la durata dell'esposizione ai raggi UV necessaria per evocare la risposta minima dell'erithema è determinata principalmente dalla leggerezza o dall'oscurità della pelle del partecipante, come definito dal tipo di pelle Fitzpatrick (FST) del partecipante. FST⁷ è uno schema numerico per classificare il colore della pelle umana. La scala Fitzpatrick è uno strumento riconosciuto per la ricerca dermatologica sulla pigmentazione della pelle umana^8,9, e classifica la pelle umana in una delle sei categorie dalla più leggera (FST I) alla più scura (FST VI).

Le tipologie FST più scure richiedono una durata UV più lunga, quindi è importante una classificazione accurata del FST. Esiste una vasta letteratura sui metodi per una valutazione accurata dell'FST, utilizzando un'ampia varietà di approcci, tra cui l'auto-report, l'intervista dermatologica e la valutazione basata sulla strumentazione. Le valutazioni degli osservatori di FST hanno dimostrato di essere correlate con l'attuale colore della pelle^10,ma non il colore naturale della pelle 10, tuttavia l'FST può essere determinato soggettivamente¹¹ utilizzando l'auto-report tramite questionario¹² e/o valutazione oggettiva tramite Spettrofotometria. Fitzpatrick digitazione da spettrofotometria ha dimostrato di correlare strettamente all'auto-relazione dei partecipanti in una serie di studi^10,13,14,15.

Nonostante l'utilità e l'uso diffuso dei test MED nei servizi clinici, questa procedura non è stata ampiamente adottata in ambienti di laboratorio per la misurazione della variazione individuale in risposta alla stimolazione pro-infiammatoria. Lo scopo della metodologia qui delineata è quello di fornire tecniche e procedure passo-passo che aumentino la precisione e la riproducibilità della procedura di test MED, al fine di facilitare il lavoro futuro in ambienti di laboratorio incentrati su valori la quantificazione della variabilità intra-individuale nella risposta infiammatoria. Forniamo inoltre risultati rappresentativi che illustrano la capacità di questo protocollo standardizzato di catturare con precisione la variazione da persona a persona nell'infiammazione.

Protocollo

Tutti i metodi descritti di seguito, compreso l'uso di volontari umani, sono stati esaminati e approvati dal Comitato di revisione istituzionale locale (IRB) e sono conformi alla Dichiarazione di Helsinki e al rapporto Belmont. Tutti i partecipanti (N. 72) hanno firmato il consenso informato come indicato dal protocollo IRB. I criteri di inclusione/esclusione e le procedure di interruzione sono stati concepiti per massimizzare la sicurezza dei partecipanti e qualsiasi deviazione da queste procedure dovrebbe essere considerata alla luce del loro impatto sul rischio e sulla tollerabilità dei soggetti umani. Nel contesto del lavoro qui presentato, i criteri di esclusione limitavano la partecipazione agli individui senza storia personale o familiare di condizioni infiammatorie, o a sostanze lecite o illecite. La giustificazione è che questi fattori possano influenzare le risposte alla procedura di test MED.

1. Selezione dei partecipanti

1. Utilizzare i seguenti criteri di inclusione: 18-55 anni; in buona salute generale come determinato da Medical Symptom Checklist (MSCL)⁵; può comprendere e comunicare il protocollo di sicurezza di laboratorio presentato in inglese; può fornire il consenso scritto.
2. Utilizzare i seguenti criteri di esclusione: Fitzpatrick skin type I, come determinato dall'auto-segnalazione; utilizza regolarmente attrezzature concia commerciali; ferite cutanee o lesioni nel sito di esposizione previsto; cancro della pelle attuale, o storia personale del cancro della pelle; storia familiare del cancro della pelle; diabete; psoriasi o altre condizioni infiammatorie della pelle; malattia vascolare periferica, malattia arteriosa periferica, malattia di Raynaud, o qualsiasi altro disturbo circolatorio diagnosticato; eventuali disturbi motori involontari; allergico al nastro adesivo; prende steroidi inalati per l'asma (ad esempio, Fluticasone); prende qualsiasi corticosteroidi; 2 o più dei seguenti (ipertensione diagnosticata, iperlipidemia, colesterolo alto, sigarette di fumo, storia familiare di malattia coronarica o aterosclerotica (genitori/fratelli prima dei 55 anni)); dipendenza da sostanze attive - legale o illecito; persone con dipendenza da sostanze nuove al recupero (meno di un anno); uso di farmaci che colpisce la funzione del SNC, compresi psicotropi, farmaci oppiacei o corticosteroidi, durante gli ultimi 3 mesi; eventuali farmaci psicotropi prescritti, attualmente o durante gli ultimi 3 mesi (Questi includono farmaci per l'ansia, depressione, o altri problemi psicologici).

2. Pianificazione e preparazione del MED

1. Programmare i partecipanti per due appuntamenti: il primo, l'evento di esposizione MED (circa 45 min) e il secondo, un follow-up per raccogliere le letture spettrofotometria (circa 10 min). Programmare l'appuntamento di follow-up per 24 h dopo il primo appuntamento.
2. Prima dell'arrivo dei partecipanti, disporre e predisporre attrezzature essenziali, tra cui due polsini per la prova delle dosi e attrezzature di sicurezza. Avere una varietà di indumenti UV-protettivi (come maniche sportive UV-protettive, guanti UV-protettivi, scrub medici a maniche lunghe, fogli protettivi UV e nastro adesivo per apporre i fogli) sia per il partecipante che per il ricercatore per coprire tutta la pelle esposta ai raggi UV radiazione.
3. Calibrare lo spettrofotometro in base alle specifiche del produttore. Eseguire questa operazione per ogni argomento e per ogni sessione.

3. Determinazione del tipo di pelle Fitzpatrick (FST)

1. Quando il partecipante arriva per l'evento di esposizione MED (Visita 1), identificare l'FST tramite auto-report o spettrofotometria. Per massimizzare la sicurezza dei partecipanti, non condurre test MED sui partecipanti classificati come FST 1. Per tutti gli altri tipi di pelle Fitzpatrick (2-6), utilizzare il punteggio FST per determinare quale programma di esposizione deve essere utilizzato.

4. Applicazione del bracciale 1

1. Spiega al partecipante come funziona il test MED e sollecita domande prima di procedere.
2. Generalmente, eseguire la procedura MED all'interno dell'avambraccio non dominante.
3. Posizionare Cuff 1 (con tutti i rivestimenti di apertura rimossi) evitando lentiggini, talpe, cicatrici, capelli (nella misura possibile), e eventuali tagli, lividi o lesioni sulla pelle. Rimuovere solo il sostegno protettivo della carta cerata dalle porzioni laterali (non centrali) del bracciale 1. È importante che la carta cerata dalla parte centrale di Cuff 1 non venga rimossa, in quanto l'adesivo ha un forte potenziale per irritare la pelle quando viene staccata dopo le letture del basale, causando l'arrossamento della pelle prossimale alle aperture.
4. Dopo aver collocato Cuff 1 presso il sito di esposizione previsto, posizionare i punti di riferimento utilizzando un indicatore permanente per garantire che Cuff 2 sarà situato esattamente nella stessa posizione. Contrassegnare la pelle in quattro punti all'esterno delle pieghe di ciascuno dei lembi laterali di Cuff 1, i punti in alto a destra, in alto a sinistra, in basso a destra e in basso a sinistra.
   1. Rendere questi segni abbastanza scuro per sopravvivere circa 24 h, in quanto saranno utilizzati anche per posizionare Cuff 3 esattamente nella stessa posizione all'appuntamento di follow-up 24 h più tardi.

5. Lettura di base: Applicazione del bracciale 1

1. Utilizzando uno spettrofotometro che è stato calibrato secondo le specifiche del produttore, ottenere e registrare in modo permanente le letture a ciascuna delle sei aperture aperte in sequenza.
2. Assicurarsi che lo spettrofotometro sia posizionato al centro delle aperture del polsino evitando talpe, cicatrici o altre imperfezioni nella misura possibile.
3. Registrare in modo permanente tutti i valori "SCI" (L, A, B). Per garantire letture coerenti con lo stesso punto di calibrazione, mantenere lo spettrometro nell'ON per tutta la durata della procedura MED e non spegnerlo fino al completamento delle letture post-esposizione.
4. Dopo aver registrato le misurazioni della spettrometria di base, rimuovere Polsino 1. Per ridurre al minimo il disagio del partecipante, applicare il solvente adesivo medico al perimetro di Cuff 1 in quanto è staccato, che impedirà la rimozione dolorosa dei capelli sul braccio.

6. Lettura pre-esposizione: Applicazione del bracciale 2

1. Dopo la rimozione di Cuff 1, situato Cuff 2 nella stessa posizione utilizzando i punti di riferimento disegnati sulla pelle per Polsino 1. Il supporto adesivo completo può essere esposto e applicato per garantire che Cuff 2 sia sufficientemente sigillato per impedire l'esposizione incrociata tra le aperture a causa dell'insufficiente aderenza alla pelle.
2. Chiedi al partecipante che al ricercatore di indossare indumenti UV-protettivi e accessori di sicurezza. Come minimo, il partecipante, il tecnico che amministra la procedura e tutte le altre parti nella stanza devono indossare occhiali UV-protettivi. I tecnici devono indossare maniche lunghe o indossare una custodia UV-protettiva.
3. Prima di attivare la lampada, chiedi al tecnico di assistere il partecipante nel coprire tutta la pelle esposta, compreso il braccio sopra la patch, il braccio e il polso sotto la patch, la mano e parti della parte anteriore o posteriore del braccio che possono essere esposte ai lati del cerotto (UV- fogli protettivi e nastro adesivo per apporre i fogli possono essere utili per questo). Inoltre, alcuni partecipanti che indossano camicie con scollature aperte potrebbero voler drappeggiare panno UV-protettivo sul collo e sul torace se queste aree saranno vicine alla fonte UV.
4. Stendere un panno UV-protettivo sotto il braccio del partecipante (per ridurre la riflessione fuori dalla superficie del tavolo).

7. Procedura MED: Pre-esposizione

NOT: I raggi della lampada devono essere perpendicolari al sito di esposizione. In generale, il movimento fisico della lampada è meno possibile del movimento o della disposizione dell'angolo del braccio dei partecipanti.

1. Prima di attivare la lampada, disporre il braccio del partecipante in modo che i raggi UV della lampada siano perpendicolari all'angolo di Bracciale 2 sul braccio del partecipante.
2. Identificare la distanza corretta tra la lampada e il bracciale 2 sul braccio del partecipante. Posizionare il sensore del radiometro rivolto verso la lampada UV parallelamente alla superficie della pelle e il più vicino possibile alla posizione di Cuff 2.
3. Coprire il braccio dei partecipanti con un panno a prova di UV per evitare l'esposizione e attivare brevemente la lampada per regolare la distanza a Cuff 2 fino a quando il sensore del radiometro non legge 270 w/cm².
   1. Per ottenere questa lettura, regolare la distanza tra la lampada e la superficie della pelle fino a quando il radiometro non legge 270 W/cm² (10 gradi). Una volta determinata la distanza corretta, disattivare la lampada.
      NOT: È importante notare qui che piccole differenze nell'angolo del radiometro influenzeranno notevolmente la lettura. Pertanto, l'angolo del radiometro dovrebbe essere il più vicino possibile al parallelo alla superficie della pelle.
4. Effettuare ulteriori regolazioni a distanza durante tutta la sessione di esposizione per evitare deriva nella posizione del braccio. Ad ogni lettura, confermare la distanza e riadattare in base alle esigenze per mantenere le letture del radiometro a circa 270 w/cm² (10 w).

8. Procedura MED: Esposizione

1. Utilizzare un cronometro per implementare la pianificazione MED. Rimuovere il primo rivestimento di apertura prima di attivare la sorgente UV. Attivare contemporaneamente la sorgente e il cronometro e rimuovere ogni rivestimento di apertura su Cuff 2 in base alla pianificazione specificata di seguito, in base all'FST.
2. Nel punto di rimozione per ogni rivestimento di apertura, registrare la lettura del radiometro quando il radiometro è tenuto parallelo alla superficie della pelle e puntato verso la lampada. Se la distanza è cambiata, regolare la distanza dalla lampada per assicurarsi che il radiometro legga ancora una volta 270 (10) - cm².
3. Chiedi al tecnico di monitorare il braccio del partecipante per garantire un posizionamento coerente. In particolare, riregolare il braccio se il braccio ruota, come molti partecipanti ruoteranno il braccio come si rilassano. In seguito a eventuali regolazioni, riconfermare che il radiometro legge 270 W/cm² (o 10 W).
4. Spegnere la lampada all'ora precisa specificata dal programma di dosaggio nella Tabella 1. Non disattivare il cronometro, come descritto di seguito, deve essere raccolta una serie aggiuntiva di letture spettrofotometrie esattamente 7 minuti dopo la disattivazione della lampada.

9. 7 Lettura post-esposizione

1. Esattamente 7 minuti dopo la disattivazione della lampada, registrare le letture dello spettrofotometro finale da ogni apertura in Cuff 2. Lo scopo della raccolta dei dati immediatamente successiva alla procedura di esposizione è quello di confermare prima nessuna reazione avversa alla radiazione UV, e il secondo valutare le risposte iniziali, che in alcuni casi possono essere lievi, ma misurabilmente diverse dalla linea di base ( pre-esposizione). Qualsiasi aumento del rossore dopo 7 minuti è probabile che sia un effetto termico e non un erythema.
   NOT: Una reazione avversa all'esposizione alle radiazioni UV dopo 7 minuti è probabilmente correlata alla dose urticarica minima di orticaria solare, un disturbo fotosensibilità acquisito. I disturbi di fotosensibilità vengono valutati prima della procedura MED e i soggetti con questi disturbi dovrebbero essere esclusi. Tuttavia, se questo viene osservato in qualsiasi momento durante il test, il protocollo di esposizione deve essere interrotto immediatamente.
2. Dopo l'esposizione alle radiazioni UV, Cuff 2 può essere particolarmente difficile da rimuovere. Utilizzare un solvente adesivo di qualità medica, se necessario, per ridurre al minimo il disagio ai partecipanti durante la rimozione del bracciale 2. I partecipanti con una pelle particolarmente irsuta o altrimenti sensibile possono trovare utile applicare l'olio d'oliva o l'adesivo a base di alcol sotto il bordo di Cuff 2, in quanto rimuovono lentamente la patch. Dopo Cuff 2 viene rimosso i partecipanti possono avere adesivo residuo sulla pelle, che può anche essere rimosso con olio d'oliva o solvente adesivo medico.
3. Prima della partenza dalla sessione di esposizione, ricordare ai partecipanti di non lavare i punti di riferimento e di non applicare lozioni al sito di esposizione.

10. Appuntamento di follow-up: Applicazione del bracciale 3

1. Prima dell'arrivo del partecipante, calibrare lo spettrofotometro in base alle specifiche del produttore.
2. Preparare Polsini 3 rimuovendo tutti i rivestimenti di apertura (lasciando la carta cera bianca appoggiata sulla parte centrale del cerotto). Quando si posiziona Polsini 3 sul braccio del partecipante, rimuovere la carta cererosa bianca che si appoggia dai due lembi laterali del cerotto. Utilizzando i punti di riferimento sull'avambraccio del partecipante, posizionare Cuff 3 nella stessa posizione delle due patch precedenti.
3. Prendere una lettura a ciascuna delle sei aperture aperte in sequenza. Inoltre, ispezionare visivamente ogni apertura e registrare se sembra esserci prova visiva di una risposta dell'erithema in ciascuna delle sei aperture (la pelle rossa o rosa indica l'erithema). Dopo aver registrato in modo permanente le letture spettrofotometrie, rimuovere Cuff 3, utilizzando il solvente se necessario.
4. Per migliorare ulteriormente il comfort e la sicurezza del partecipante, fornire 4-6 gel di ustione monouso o aloe vera, e indicare al partecipante che se il sito di esposizione diventa prurito o scomodo, può essere trattato come una scottatura solare con questi o simili sopra i prodotti contatore.

Risultati

Il programma di cronometraggio presentato nella Tabella 1 è un nuovo programma di dosaggio che è stato calcolato per catturare il MED, in media, al punto medio dell'evento di esposizione (cioè, apertura 3 o 4) per ogni FST. La base per la programmazione calcolata è la seguente.

I lavori precedenti hanno stabilito che per gli individui con FST 2, il MED mediano per le radiazioni nella gamma UVB è 66,9 milliwatt (mW) per cm², 77.429 mW/cm² per FST 3 e ...

Discussione

L'implementazione di precisione dei test MED come descritto qui potrebbe offrire diversi vantaggi rispetto ad altre sfide infiammatorie esistenti in laboratorio che hanno raggiunto l'uso popolare. Ad esempio, i protocolli di blister di aspirazione^17,18,19 sollevano un blister pieno di liquidi sulla pelle che viene successivamente aspirato con una siringa per ottenere l'accesso diretto al microambiente citochine. Anche se la vesc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aperture dose testing patch (“Cuff”)	Daavlin
Medical grade adhesive solvent
Non-reflective UV proof cloth
Radiometer	SolarLight	Model 6.2 UVB Meter
Single use aloe or burn gel
Spectrophotometer	Konika-Minolta	CM-2600D
Stopwatch
UV lamp – Fiji Sun	Sperti		Emission spectrum 280 nm-400 nm, approximately 25% UVB
UV-proof safety glasses (2 pair)
UV-proof sleeve
White cotton gloves (2 pair)