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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo metodo è progettato per seguire la formazione di domini di cromatina mediati da PRC2 nelle linee cellulari e il metodo può essere adattato a molti altri sistemi.

Abstract

L'organizzazione e la struttura dei domini della cromatina sono uniche per le singole linee cellulari. La loro cattiva regolamentazione potrebbe portare a una perdita di identità cellulare e/o malattia. Nonostante gli enormi sforzi, la nostra comprensione della formazione e della propagazione dei domini della cromatina è ancora limitata. I domini di cromatina sono stati studiati in condizioni stabili, che non sono favorevoli a seguire gli eventi iniziali durante la loro istituzione. Qui, presentiamo un metodo per ricostruire indebitamente i domini della cromatina e seguire la loro ri-formazione in funzione del tempo. Anche se, prima applicato al caso di formazione del dominio cromatina repressiva mediata da PRC2, potrebbe essere facilmente adattata ad altri domini di cromatina. La modifica di e/o la combinazione di questo metodo con la genomica e le tecnologie di imaging fornirà strumenti preziosi per studiare in dettaglio la creazione di domini di cromatina. Crediamo che questo metodo rivoluzionerà la nostra comprensione di come i domini della cromatina si formano e interagiscono tra loro.

Introduzione

I genomi eucarioti sono altamente organizzati e i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina controllano direttamente la trascrizione genica1. Il genoma contiene diversi tipi di domini di cromatina, che sono correlati all'attività trascrizionale e alla temporizzazione della replicazione2,3. Questi domini di cromatina variano in dimensioni da pochi kilobase (kb) a più di 100 kb e sono caratterizzati da un arricchimento in distinte modifiche istoni4. Le domande centrali sono: come si formano questi domini e come vengono propagati?

Uno dei domini di cromatina più caratterizzati è favorito attraverso l'attività del complesso repressivo Polycomb 2 (PRC2). PRC2 è un complesso multi-sottounità composto da un sottoinsieme del Polycomb Group (PcG) delle proteine5,6, e catalizza la mono-, di- e trimetilazione di lisina 27 di istone H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sono associati a uno stato di cromatina repressiva, ma la funzione di H3K27me1 non è chiara6,11. Uno dei componenti fondamentali della PRC2, sviluppo ectodernico embrionale (EED), si lega al prodotto finale della catalisi PRC2, H3K27me3, attraverso la sua gabbia aromatica e questa caratteristica si traduce nella stimolazione allosteric della PRC212,13. L'attività enzimatica PRC2 è cruciale per preservare l'identità cellulare durante lo sviluppo in quanto l'espressione inappropriata di alcuni geni dello sviluppo che sono controindicati per un lignaggio specifico, sarebbe dannosa5,6 . Pertanto, svelare i meccanismi attraverso i quali la RPC2 favorisce la formazione di domini di cromatina repressiva nei mammiferi è di fondamentale importanza per comprendere l'identità cellulare.

Tutti i sistemi sperimentali passati progettati per studiare la formazione di domini di cromatina, compresi i domini di cromatina mediati dalla RPC, sono stati eseguiti in condizioni stabili, che non sono in grado di monitorare gli eventi di svolgimento della formazione del dominio della cromatina Cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per generare un sistema cellulare inducibile che monitora il reclutamento iniziale e la propagazione dei domini di cromatina. In particolare, ci concentriamo sul monitoraggio della formazione di domini di cromatina repressiva mediati da PRC2 che comprendono H3K27me2/3. Questo sistema in grado di cogliere i dettagli meccanicistici della formazione del dominio della cromatina, potrebbe essere adattato per incorporare altri domini della cromatina, come i domini ampiamente studiati che comprendono H2AK119ub o H3K9me. In combinazione con la genomica e le tecnologie di imaging, questo approccio ha il potenziale per affrontare con successo varie domande chiave nella biologia della cromatina.

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Protocollo

Generazione di mESC di salvataggio EED inducibili

1. Cultura cellulare

  1. Utilizzare cellule staminali embrionali C57BL/6 topo senza alimentatore (mESC) in possesso di un transgene CreERT2 opportunamente integrato, che può traslocare nel nucleo dopo la somministrazione di 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.
  2. Crescere mESC in medio ESC convenzionale14,15, integrato con 1000 U/mL LIF, 1 inibitore ERK PD0325901 e 3 M GSK3 inibitore CHIR99021. Per il mezzo ESC convenzionale, utilizzare DMEM ad eliminazione diretta contenente 15% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 1X penicillina/streptomicina e 0,1 mM 2-mercaptoetanolo.
  3. Utilizzare piastre rivestite con soluzione di gelatina dello 0,1% per la coltura di mESC.

2. Generazione di mESC ePEC e EED clonale (KO)

  1. Guida di progettazione RNA (gRNA) per eliminare Exon 10 e Exon 11 di copia endogena di EED in mESC utilizzando lo strumento di progettazione CRISPR in Benchling16. EED-KO-gRNA-1 bersaglio dell'intron e'1 immediatamente a monte dell'esone 10 e dell'EED-KO-gRNA-2 bersaglia l'introne immediatamente a valle dell'Exon 11. L'applicazione simultanea di questi gRNA elimina sia Exon 10 che Exon 11 con un'unione finale non omologa (NHEJ).
  2. Clonare i gRNA in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) seguendo le istruzioni riportate in Ran et al., 201317.
  3. In un formato a 6 piani, transfect 2 x 105 mESC con 1 mg di ogni EED-KO-gRNA-1 e EED-KO-gRNA-2 (vedi Tabella dei materiali) utilizzando il reagente di trasfezione seguendo le istruzioni del produttore. Cambiare il supporto 24 h dopo la trasfezione.
  4. Due giorni dopo la trasfezione, isolare le cellule positive GFP utilizzando lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS). Aspettatevi che l'efficienza della trasfezione vari intorno al 10-30 %. Ordinare circa 5 x 105 celle per catturare sufficienti cellule positive GFP per la placcatura.
  5. Piastra i mESC positivi GFP isolati in piastre da 15 cm pre-rivestite con 0,1% di gelatina (10-20 x103 cellule per piastra) per la raccolta delle coccie.
  6. Far crescere le cellule in mezzo ESC per circa una settimana fino a quando le singole colonie sono visibili. Cambiare i media ogni 2 giorni.
  7. Scegli un minimo di 48 colonie utilizzando la punta di micropipetta da 20 . Raschiare la colonia mentre si aspira nella punta della micropipetta. Non suddividere la colonia in singole cellule. Trasferire la colonia in un piatto di accutasi contenente (20 mL) 96.
  8. Incubare le colonie per 10 min a 37 gradi centigradi fino a quando tutte le cellule sono dissociate.
  9. Aggiungere 200 mL di supporti ESC in ogni pozzo utilizzando pipetta multicanale.
  10. Mescolare bene e placcare le celle in due lastre di pozzo 96 separate utilizzando pipetta multicanale.
  11. Utilizzare una delle 96 lastre di pozzo per la genotipizzazione e mantenere l'altro in crescita fino a quando la genotipizzazione è conclusa. Utilizzare la soluzione di estrazione del DNA per estrarre il DNA dalla piastra da 96 pozzo seguendo le istruzioni del produttore.
  12. Utilizzare i numeri primi genotipizzati Gnt_EED-KO-up e Gnt_EED-KO_down, che si estendono sul sito eliminato ed eseguono la genotipizzazione della PCR con la polimerasi del DNA Taq seguendo le istruzioni del produttore.
    NOTA: Altri tipi di polimerasi del DNA possono essere utilizzati anche per la genotipizzazione, tuttavia, la polimerasi del DNA Taq offre comodità in quanto la reazione PCR può essere caricata direttamente su un gel quando viene utilizzato il suo buffer di reazione colorato.
    1. Osservare un prodotto di DNA con minore peso molecolare nelle cellule con una delezione omozia rispetto al caso wild-type (WT).
      NOTA: Per generare celle nulle PRC2, è necessaria la cancellazione omoziana degli esoni 10 e 11 per destabilizzare e degradare EED, una sottounità essenziale del core PRC213. L'efficienza mirata AL CRISPR è di circa il 10 %.
  13. Convalidare la cancellazione di EED exon 10 e 11 e la perdita di proteina EED da parte del sequenziamento e del gonfiamento occidentale, rispettivamente.
  14. Confermare l'esaurimento di EED e H3K27me2/me3 dalla cromatina nelle cellule EED KO da ChIP-seq utilizzando anticorpi contro H3K27me2/me3 ed EED. Utilizzare il protocollo indicato in Oksuz et al., 201715 per gli esperimenti ChIP-seq.

3. Ingegneria degli eED knockout mESC per ospitare l'espressione EED inducibile basata su Cre-ERT2

  1. Progettare gRNA (EED-gRNA-inducible) per introdurre un taglio all'interno dell'intron seguendo l'esone 9 di EED utilizzando lo strumento di progettazione CRISPR in Benchling16 (vedere Tabella dei materiali).
  2. Clonare i gRNA in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) seguendo le istruzioni riportate in Ran et al., 201317.
  3. Progettare un DNA modello donatore che comprenda la sequenza EED cDNA dopo l'esone 9 e un tag Flag-HA del terminale C a monte di una sequenza T2A-GFP, il tutto in orientamento inverso rispetto alla sequenza genica endogena.
    1. Affiancare la cassetta con un accettatore di giunzione e una sequenza poliadenilazione annidata tra siti loxP invertiti etelologi (lox66 e lox71)18.
    2. Includere almeno 500 bp di bracci di omologia da ogni estremità. Dividere il modello donatore in 2 segmenti di frammenti genici gBlocks (vedere gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" e gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") e assemblarli in vettore PCR Blunt utilizzando la clonazione Gibson seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: gblock-2 contiene un residuo aromatico (Y365) all'interno della gabbia di EED che è importante per l'interazione con H3K27me312. gBlock-2-Wt contiene residui di tipo selvaggio, mentre gblock-2-gabbia-mutante contiene la gabbia-mutante di EED (Y365A), incapace di legarsi a H3K27me3. Il salvataggio inducibile di WT EED è indicato come i-WT-r e il salvataggio EED indotbile in gabbia-mutante è indicato come i-MT-r per comodità.
  4. In un formato a 6 piani, trasfect 2 x 105 mESC con 1 mg di gRNA (EED-gRNA-inducibile) e 1 mg dei modelli donatore (i-WT-r o i-MT-r) utilizzando la reagente di trasfezione e isolare le cellule positive GFP utilizzando FACS.
  5. Segui i passaggi 2.3-2.11 per isolare le singole colonie pronte per la genotipizzazione per il targeting di successo.
  6. Utilizzare i primer di genotipizzazione Inducible_Genotype-FW-1 e Inducible_Genotype-REV-1, che si estendono sulla cassetta inserita ed eseguono la genotipizzazione PCR utilizzando la polimerasi del DNA Taq.
    NOTA: l'efficienza di targeting per CRISPR è di circa il 10 %.
    1. Confermare la corretta integrazione della cassetta da PCR utilizzando i primer Inducible_Genotype-FW-2 e Inducible_Genotype-REV-2, che si trovano al di fuori dei bracci omeologia.
      NOTA: L'integrazione omozigotale della cassetta è necessaria per realizzare un salvataggio efficiente di EED. Si noti che le cellule con integrazione omozio produrranno un singolo prodotto di DNA di grandi dimensioni rispetto a WT EED, che produrrà un prodotto corto.
  7. Confermare l'integrazione della cassetta da parte del sequenziamento Sanger.
  8. Confermare il lancio della cassetta e l'espressione di EED e di altri componenti di base PRC2 (ad es., E-H-2 e SU-12) sull'amministrazione 4-OHT mediante gonfiore occidentale.
  9. Confermare l'espressione di T2A-GFP e la percentuale di capovolgimento per citometria di flusso. Si noti che l'espressione di GFP è indicativa di capovolgimento della cassetta e l'espressione di EED.

4. A seguito della nucleazione e della diffusione dell'attività della RPC2 sulla cromatina

  1. Verificare che i-WT-r e i-MT-r mESC non abbiano un'espressione perdente di GFP per citometria di flusso. In caso di espressione perdente di GFP, isolare le cellule GFP-negative da FACS prima di iniziare l'esperimento.
  2. Espandere i mESC i-WT-r e i-MT-r in cinque piastre da 15 cm (5x 106 celle per piastra).
  3. Indurre l'espressione di WT o gabbia-mutante EED per somministrazione di 0,5 mM 4-OHT per 0 h, 12 h, 24 h, 36 h e 8 giorni (una piastra di 15 cm per condizione). Cambiare il supporto dopo 12 h per trattamenti più lunghi di 12 h. Isolare le cellule ricombinate con successo utilizzando GFP. Regolare il tempo dei trattamenti in modo che tutte le condizioni siano raccolte contemporaneamente.
  4. Eseguire ChIP-seq per H3K27me2, H3K27me3 per indagare la loro deposizione temporale alla cromatina in risposta alla riequisetta di WT o EED a gabbia-mutante. Utilizzare il protocollo ChIP-seq, inclusa la preparazione della libreria descritta in Oksuz et al., 201715.
  5. Utilizzare il controllo spike-in in ogni campione per consentire il confronto quantitativo tra diversi punti temporali19.
    1. Per il controllo del picco, utilizzare la cromatina dalla Drosophila melanogaster (in un rapporto 1:50 rispetto alla cromatina derivata da mESC) e l'anticorpo H2Av specifico di Drosophila (1 Luna di anticorpo H2Av per 4 g di istruzioni del produttore) in ogni campione.
    2. Preparare la cromatina dalla Drosophila in un modo simile a quello da mESC utilizzando il protocollo dettagliato in Oksuz et al., 201715.
  6. Mappare la sequenza di ChIP-seq al genoma di mm10 con Bowtie 2 utilizzando i parametri di default20.
  7. Normalizzare le letture di ChIP-seq del mouse in Drosophila read conta21. Calcolare il fattore di normalizzazione spike-in utilizzando la seguente formula: 1 x 106/univoco Drosophila read conta. Aspettatevi di ottenere circa 1 x 106Drosophila conteggio delle letture e 20 x 106 conteggi di lettura del mouse per esperimento.
    1. Non includere la cromatina di Drosophila durante il sequenziamento dei campioni di input.
  8. Utilizzare lo strumento genomecov dei bedtools per convertire il file bam nel bedgraph22. Successivamente, convertire il bedgrafa in file bigwig utilizzando lo strumento bedGraphToBigWig da USCS23,24. Vedere lo script seguente:
    "percorso al genoma di mm10"
    "percorso verso le dimensioni dei cromosomi mm10"
    inp_bam"percorso del file bam di input "
    multiply: "calcola il fattore di normalizzazione del picco"
    bedtools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph
    sort -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph
    bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
  9. Visualizza le densità di lettura ChIP-seq caricando i file bigwig sul browser genoma USCS24.

5. Monitoraggio dell'emergere e della crescita dei foci H3K27me3 nei nuclei mESC

  1. Piatto 1x 104 mESC in scivoli a camera 8-well pre-rivestiti con gelatina dello 0,1%.
  2. Il giorno successivo, iniziare a eseguire induzioni consecutive 4-OHT (0,5 mM) per raccogliere le cellule che esprimono EED per i punti temporali indicati (0 h, 12 h, 24 h e 36 h). Cambiare il supporto dopo 12 h per trattamenti più lunghi di 12 h.
  3. Fissare i mESC con 4% paraformaldeide in salina tamponati di fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
  4. Permeabilizzare le celle con PBS/0.25% Triton X-100 a RT per 30 min.
  5. Bloccare le celle con siero d'asino PBS/5%/0,1% Triton X-100 (buffer di blocco) a RT per 30 min.
  6. Diluire l'anticorpo primario H3K27me3 1:500 nel buffer di blocco e aggiungere alle cellule.
  7. Incubare le cellule con anticorpo primario durante la notte a 4 gradi centigradi.
  8. Il giorno successivo, eseguire 3 lavatori con PBS/0.1% Triton X-100.
  9. Diluire l'anticorpo secondario (Alexa fluor 595) 1:1000 nel buffer di blocco e aggiungere alle cellule.
    1. Eseguire tutte le incubazioni al buio nei passaggi successivi come anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor sono sensibili alla luce.
  10. Incubare l'anticorpo secondario per 2 h a RT.
  11. Esegui 3 lavamenti con PBS/0,1% Triton X-100.
  12. Diluire DAPI (1 mg/mL) 1:4000 con PBS/0.1% Triton X-100 e aggiungere alle celle.
  13. Incubare le cellule con DAPI per 10 min a RT.
  14. Montare le celle con Aqua mount.
  15. Immagina le cellule con microscopia confocale con ingrandimento 63X.
  16. Elaborare e pseudo-colorare le immagini utilizzando una distribuzione di ImageJ, Fiji25.

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Risultati

Un sistema generale del sistema di salvataggio condizionato
La figura 1 mostra lo schema di targeting per salvare in modo condizionale le cellule EED KO con WT o EED (Y365A) echeggiato dal locus EED endogeno. Dopo aver eliminato EED, viene introdotta una sottounità centrale di PRC2 essenziale per la sua stabilità e attività ezimatica, viene introdotta una cassetta all'interno dell'intron dopo l'esone 9 di EED (Figura 1). La cassetta è cos...

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Discussione

Un approccio potente per comprendere i dettagli meccanicistici durante la formazione di un dato dominio cromatico, è quello di interrompere prima il dominio e poi monitorare la sua ricostruzione in corso all'interno delle cellule. Il processo può essere sospeso in qualsiasi momento durante la ricostruzione per analizzare in dettaglio gli eventi in corso. Studi precedenti sui domini di cromatina non sono stati in grado di risolvere tali eventi in quanto sono stati eseguiti in condizioni di stato costante (ad esempio, co...

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Divulgazioni

D.R. è co-fondatore di Constellation Pharmaceuticals e Fulcrum Therapeutics. Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Ringraziamo i dottori L. Vales, D. Ozata e H. Mou per la revisione del manoscritto. Il D.R. Lab è supportato dall'Howard Hughes Medical Institute e dal National Institutes of Health (R01CA199652 e R01NS100897).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg)SigmaH7904-5MGFor induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml)Electron Microscopy Sciences15710For immunofluorescence
2-mercaptoethanolLifeTechnologies21985-023For mESCs culture
2% Gelatin SolutionSigmaG1393-100mlFor mESCs culture
Accutase 500 MLInnovative Cell Tech/FISHERAT 104-500For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresaerch711-585-152For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting MediumFISHER/VWR41799-008For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PKFisher Sci177445PKFor immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mgLife TechD1306For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901Stemgent04-0006For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF ProteinMillipore/FisherESG1107For mESCs culture
FBS Stem Cell QualifiedAtlantaS10250For mESCs culture
Gibson Assembly Master MixNEBE2611LFor Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021Stemgent04-0004For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mABCell Signaling9728SAntibody for ChIP-seq
H3K27me3Cell Signaling9733SAntibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb)Active motif39715Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEMInvitrogen10829-018For mESCs culture
L-glutamineSigmaG7513For mESCs culture
Lipofectamine 2000LifeTech11668019For transfection
MangoTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21079For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL)Jackson ImmunoResearch017-000-121For immunofluorescence
Penicillin-StreptomycinSigma/RocheP0781For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction SolutionLucigenQE0905TFor Genotyping PCR
Triton X-100SigmaT8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning KitThermo FisherK270020For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducibleSequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donorhttps://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducibleSequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donorhttps://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.

Riferimenti

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