Preparazione degli elettrodi di stimolazione nervosa periferica per l'impianto cronico nei ratti

Riepilogo

Gli approcci esistenti per la costruzione di elettrodi per il bracciale nervoso periferico cronicamente impiantabili per l'uso in piccoli roditori spesso richiedono attrezzature specializzate e/o personale altamente qualificato. In questo protocollo dimostriamo un approccio semplice e a basso costo per la fabbricazione di elettrodi per bracciali cronicamente impiantabili e dimostriamo la loro efficacia per la stimolazione del nervo vago (VNS) nei ratti.

Abstract

Gli elettrodi del bracciale nervoso periferico sono stati a lungo utilizzati nelle neuroscienze e nei campi correlati per la stimolazione, ad esempio, di vago o nervi sciatici. Diversi studi recenti hanno dimostrato l'efficacia del VNS cronico nel migliorare la plasticità del sistema nervoso centrale per migliorare la riabilitazione motoria, l'apprendimento dell'estinzione e la discriminazione sensoriale. La costruzione di dispositivi cronicamente impiantabili per l'uso in tali studi è difficile a causa delle piccole dimensioni dei ratti, e i protocolli tipici richiedono un'ampia formazione del personale e metodi di microfabbricazione che richiedono molto tempo. In alternativa, gli elettrodi per polsini impiantabili disponibili in modo commerciale possono essere acquistati a un costo significativamente più elevato. In questo protocollo, presentiamo un metodo semplice e a basso costo per la costruzione di piccoli elettrodi per il traslitto nervoso periferico cronicamente impiantabile per l'uso nei ratti. Convalidiamo l'affidabilità a breve e lungo termine dei nostri elettrodi per polsini dimostrando che il VNS nei ratti anestetizzati chetamina/xylazina produce una diminuzione della frequenza respiratoria coerente con l'attivazione del riflesso Hering-Breuer, sia al momento dell'impianto che fino a 10 settimane dopo l'impianto del dispositivo. Dimostriamo inoltre l'idoneità degli elettrodi del bracciale per l'uso negli studi di stimolazione cronica accoppiando VNS con prestazioni di pressa a leva abile per indurre la plasticità della mappa corticale motoria.

Introduzione

Recentemente, la domanda di elettrodi per bracciali cronicamente impiantabili per la stimolazione dei nervi periferici è cresciuta, poiché gli studi dimostrano sempre più l'utilità preclinica di questa tecnica per il trattamento di numerose malattie infiammatorie^1,2,3 e disturbi neurologici^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Il VNS cronico, ad esempio, ha dimostrato di migliorare la plasticità neocorticale in una varietà di contesti di apprendimento, migliorando la riabilitazione motoria^4,5,6,7,8, l'apprendimento^{dell'estinzione 10,11,12,13,14}e la discriminazione sensoriale¹⁵. Gli elettrodi per bracciati nervosi periferici disponibili in vendita sono spesso associati a tempi prolungati per l'evasione degli ordini e a costi relativamente elevati, che possono limitarne l'accessibilità. In alternativa, i protocolli per la fabbricazione "in-house" di elettrodi per bracciali cronicamente impiantabili rimangono limitati e l'anatomia dei roditori presenta particolari sfide a causa delle loro piccole dimensioni. Gli attuali protocolli per la costruzione di elettrodi per i roditori cronici spesso richiedono l'uso di attrezzature e tecniche complesse, nonché di personale ampiamente addestrato. In questo protocollo, dimostriamo un approccio semplificato alla fabbricazione di elettrodi per bracciali basato sui metodi precedentemente pubblicati e ampiamente^{utilizzati 16,17}. Convalidiamo la funzionalità dei nostri elettrodi cronicamente impiantati nei ratti dimostrando che, al momento dell'impianto del polsino intorno al nervo vago cervicale sinistro, la stimolazione applicata agli elettrodi del bracciale ha prodotto con successo una cessazione della respirazione e della caduta in SpO2. Stimolazione di afferente recettore polmonare fibre vagali è noto per coinvolgere il riflesso Hering-Breuer, in cui l'inibizione di diversi nuclei respiratori nel tronco encefalico si traduce^{nell'ispirazione soppressione 18}. Così, la cessazione della respirazione coerente con il riflesso Hering-Breuer, e il conseguente calo in SpO2, forniscono un test semplice per un impianto di elettrodi corretto e la funzione del bracciale nei ratti aneti. Per convalidare la funzionalità a lungo termine degli elettrodi per bracciali impiantati cronicamente, le risposte riflesse sono state misurate al momento dell'impianto e confrontate con le risposte ottenute negli stessi animali sei settimane dopo l'impianto. Un secondo gruppo di ratti è stato impiantato con elettrodi a polsino VNS dopo l'allenamento comportamentale su un compito di pressione della leva. In questi ratti, VNS accoppiato con le prestazioni di attività corrette prodotto riorganizzazione della mappa motoria corticale, coerente con gli studi^{precedentemente pubblicati 19,20,21,22}. Al momento della mappatura corticale motoria in anestesia, che si è verificata 5-10 settimane dopo l'impianto del dispositivo, abbiamo ulteriormente convalidato la funzione del bracciale negli animali trattati con VNS confermando che il VNS ha indotto con successo una cessazione della respirazione e un calo superiore al 5% in SpO₂.

I protocolli recentemente pubblicati da Childs et al.¹⁷ e Rios et al.¹⁶ forniscono un punto di partenza ben convalidato per un approccio semplificato di fabbricazione di elettrodi per bracciali, poiché questo metodo popolare è stato utilizzato da più laboratori che conducono studi VNS cronici nei roditori^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Il metodo originale prevede diversi passaggi ad alta precisione per manipolare i microfili fini in modo tale che la fabbricazione di elettrodi per polsini richiede più di un'ora per essere completata e un'ampia formazione per funzionare in modo affidabile. L'approccio semplificato qui descritto richiede un numero significativamente inferiore di materiali e strumenti e può essere completato in meno di un'ora da personale con una formazione minima.

Protocollo

Tutte le procedure descritte nel presente protocollo sono eseguite in conformità con la NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Texas a Dallas.

1. Stimolazione della fabbricazione di elettrodi per bracciali

1. Preparare il tubo del bracciale.
   1. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare un pezzo di tubo polimero di 2,5 mm di lunghezza. Inserire punte di forno o una graffetta attraverso il tubo e utilizzare la lama per fare una fessura lungo la parete del tubo su un lato il bracciale.
   2. Rimuovere le forze dal tubo e inserire un grande ago da cucito attraverso la linea mediana del bracciale, perpendicolare all'asse lungo. Inserire l'ago attraverso la fessura (in alto) e al centro del tubo opposto (in basso). Posizionare l'ago nella scheda di schiuma per fissare il bracciale in posizione durante le fasi di assemblaggio rimanenti.
2. Posizionare la sutura per fissare la chiusura del bracciale durante l'impianto.
   1. Inserire il piccolo ago da cucito attraverso la parete del bracciale, sulla linea mediana, a circa 0,5 mm dalla fessura superiore su un lato. Inserire l'ago dall'interno all'esterno per evitare di danneggiare il tubo del polsino. Inserire una lunghezza di 2 cm di 6/0 di sutura attraverso l'occhio dell'ago e tirare l'ago attraverso la parete del tubo per infilare la sutura nel bracciale.
   2. Lasciando il filo in posizione, rimuovere l'ago e forare un secondo foro attraverso la parete del tubo circa 0,5 mm sotto il primo foro, lungo la linea mediana del bracciale. Inserire la sutura attraverso l'occhio dell'ago e tirare l'ago attraverso la parete del tubo per infilare nuovamente la sutura attraverso il bracciale.
   3. Entrambe le estremità del filo di sutura dovrebbero ora essere sul lato esterno del bracciale. Regolare la sutura in modo che 1,5 cm di euro si estenda dal foro superiore e che si estenda di 0,5 mm dal foro inferiore.
   4. Applicare una piccola quantità di adesivo di cura UV all'estremità corta della sutura che si estende dal foro inferiore e tirare l'estremità di sutura più lunga fino a quando la coda inferiore è quasi a filo con la parete esterna del tubo. Utilizzare la bacchetta UV per curare l'adesivo e tenere saldamente in posizione la sutura.
   5. Ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.3 sul lato opposto del bracciale.
3. Posizionare i cavi di filo Platinum:Iridium (Pt:Ir).
   1. Utilizzare il piccolo ago da cucito per fare 4 fori nella parete del bracciale. Ogni coppia di fori deve essere posizionata approssimativamente 0,5–0,8 mm dalla linea mediana perpendicolare, con un foro di circa 0,5–0,8 mm dalla fessura superiore su entrambi i lati del bracciale.
      CAUTION: Per il posizionamento più coerente e preciso dei cavi, inserire l'ago dall'interno all'esterno per creare tutti i fori, utilizzando il posizionamento della sutura come guida.
   2. Inserire nuovamente l'ago da cucire, questa volta lavorando dall'esterno all'interno, attraverso il foro di piombo 1. Inserire circa 0,5 cm di una lunghezza di 7,5 cm di filo Pt:Ir attraverso l'occhio dell'ago e tirare l'ago attraverso il tubo per infilare il filo attraverso la parete del polsino. Regolare il filo in modo che si estenda 4,5 cm sul lato esterno del bracciale (Figura 1A).
   3. Inserire nuovamente l'ago attraverso il foro di piombo 1, lavorando di nuovo da esterno a interno, e inoltre inserire l'ago attraverso il foro di piombo 2 direttamente di fronte al foro di piombo 1. Inserire 0,5 cm dell'estremità più corta (interna) del filo Pt:Ir attraverso l'occhio dell'ago e tirare l'ago attraverso il tubo per infilare il filo attraverso le pareti del bracciale.
      NOTA: Entrambe le estremità del filo Pt:Ir dovrebbero ora essere sul lato esterno del bracciale, e un loop di filo si forma intorno al bordo della fessura e attraverso il foro di piombo 1 (Figura 1B).
   4. Ripetete i passaggi da 1.3.1 a 1.3.3 per posizionare il filo Pt:Ir attraverso i fori di piombo 3 e 4.
   5. Utilizzando un accendino butano, rimuovere con attenzione l'isolamento da una lunghezza di 5-6 mm alla fine dei fili Pt:Ir che si estendono dal foro di piombo 2 e dal foro di piombo 4.
      CAUTION: Isolare attentamente le estremità dei cavi dal resto dell'assieme del bracciale per evitare danni al bracciale. Utilizzare gli strumenti per tenere i fili per evitare lesioni.
   6. Allineare il filo nudo all'interno del bracciale per posizionare i cavi nelle loro posizioni finali. Per fare questo, tirare delicatamente sull'estremità del filo Pt:Ir che si estende dal foro 1 fino a quando la porzione non isolata di filo viene a filo con il foro 1. Ripetere con l'altro cavo per allineare l'estremità non isolata del filo filettato attraverso i fori di piombo 3 e 4.
   7. Applicare una piccola quantità di adesivo di cura UV sui loop di filo sul lato esterno del bracciale ai fori di piombo 1 e 3. Utilizzare la bacchetta UV per curare l'adesivo e fissare i cavi in posizione.
   8. Utilizzare una piccola punta di pipetta per spingere i cavi di filo Pt:Ir non isolati contro la parete interna del bracciale. Una volta che i cavi sono in posizione, tagliare le estremità dei fili che si estendono dai fori di piombo 2 e 4 in modo che circa 1 mm di filo si estende oltre l'esterno della parete del bracciale.
   9. Piegare le code di 1 mm del filo piatto contro la superficie esterna del bracciale, facendo attenzione a non a corto insieme. Applicare una piccola quantità di adesivo di cura UV per coprire solo le due code e curare l'adesivo per garantire il posizionamento del piombo e fornire l'isolamento elettrico.
      CAUTION: È importante coprire completamente le superfici Pt:Ir esposte esternamente con adesivo per isolare i fili ed evitare la stimolazione fuori bersaglio.
4. Fissare i cavi di filo Pt:Ir in posizione con sicurezza di sutura.
   1. Rimuovere l'ago grande con il manicotto dalla scheda di schiuma. Inserire una lunghezza di 3 cm di 6/0 sutura attraverso l'occhio dell'ago e tirare l'ago attraverso il tubo per infilare la sutura attraverso il fondo del polsino al punto medio.
   2. Passare al piccolo ago da cucito per completare la filettatura di sutura per la protezione del piombo Pt:Ir. Inserire l'ago attraverso lo stesso foro della linea mediana, lavorando di nuovo dall'interno all'esterno per evitare la deformazione del tubo e dei cavi del filo. Inserire la coda esterna della sutura attraverso l'occhio dell'ago e tirare l'ago attraverso la parete del polsino per creare un anello di sutura intorno al bordo del bracciale (Figura 1C).
      NOTA: Utilizzare le fopinge e lavorare al microscopio per garantire che la sutura sia orientata lungo il lungo asse del bracciale e si trovi piatta contro il tubo. Questo passo assicura che i cavi rimangano separati sul lato interno del bracciale e siano tenuti in posizione laterale alla linea mediana del bracciale.
   3. Creare un secondo anello intorno all'estremità opposta del bracciale legando le estremità della sutura in un mezzo nodo, sul lato esterno del bracciale. Assicurarsi che la sutura corre lungo il lungo asse del bracciale e si trova piatta contro il tubo. Tenendo stretto il nodo in modo che si posa piatto contro il tubo, applicare una piccola quantità di adesivo cura UV al mezzo nodo e curare per tenere in posizione.
   4. Tagliare con attenzione le estremità del filo di sutura il più vicino possibile al nodo. Se necessario, utilizzare una piccola quantità di adesivo di cura UV supplementare per incollare le brevi estremità della sutura in modo che si stendono piatto contro il tubo (Figura 1D).
5. Pin del connettore di vendita ai cavi del filo Pt:Ir.
   1. Utilizzando un accendino butano, rimuovere l'isolamento da 3 mm alla fine di ciascuno dei cavi del filo Pt:Ir. Venduto il lato coppa di un perno d'oro (vedi Tabella deimateriali ) all'estremità non isolata di ogni piombo.
6. Verificare l'impedimento del dispositivo assemblato.
   1. Collegare i perni d'oro agli ingressi di un misuratore LCR o di un modulo di controllo dell'impedimento dell'elettrodo e impostare la frequenza di prova su 1 kHz. Immergere il tubo del polsino (e la stimolazione Pt:Ir contatta l'interno del bracciale) in un piccolo becher pieno di salina, facendo attenzione a mantenere asciutti i perni di piombo d'oro e i connettori della sonda. Verificare che il bracciale assemblato abbia un'impedenza a 1 kHz inferiore a 2 kΩ di procedere con l'impianto.
      NOTA: L'elevata impedimento spesso indica una superficie Pt:Ir esposta inadeguata, che può sorgere a causa di fattori quali la rimozione insufficiente dell'isolamento, l'applicazione accidentale dell'adesivo all'interno del bracciale, i fili di filo rotti, ecc. I polsini devono anche essere ispezionati alla ricerca di fili rotti o mal posizionati che potrebbero portare a contatti brevi con l'uso a lungo termine.

2. Costruzione head-cap

NOTA: le procedure di assemblaggio Headcap sono simili a quelle pubblicate in precedenza (Childs et al.¹⁷) e sono riassunti qui per comodità.

1. Assemblare il^{copricapo 17}
   1. Tagliare due piccoli pezzi di 30 agg wrap di filo AWG, uno di lunghezza di 13 mm e uno di lunghezza di 10 mm. Togliere l'isolamento di 1,5 mm da ciascuna estremità di entrambi i fili. Venduto il lato pin di un perno d'oro ad un'estremità di ogni filo, il più vicino possibile alla tazza. Utilizzare frese per tagliare la lunghezza in eccesso del perno oltre il giunto di saldato.
   2. Saldare le altre estremità dei fili AWG alle due tazze di saldatore centrale di un connettore microstrip a 4 pin.
   3. Piegate il front-up del filo verso il connettore e posizionate i perni doati piatti rispetto al connettore, paralleli l'uno all'altro, come illustrato nella figura 2A. Il perno collegato al filo più corto deve essere posizionato sotto il perno collegato al filo più lungo. Utilizzare acrilico chiodo, cemento dentale, o adesivo cura UV per fissare i cavi headcap in posizione.

3. Utilizzo del dispositivo

1. Impiantare gli elettrodi del bracciale per la stimolazione cronica del nervo vago.
   NOTA: Tutte le procedure chirurgiche devono essere eseguite con tecnica sterile o asettica in anestesia appropriata, in conformità con le linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio e con l'approvazione locale IACUC. Le seguenti procedure hanno lo scopo di illustrare un utilizzo rappresentativo del dispositivo e non sono destinate ad essere complete.
   1. Posizionare il ratto in un telaio stereotassico e fare un'incisione sagittale sulle ossa parietale e occipitale per rivelare la superficie del cranio per l'impianto della testata / connettore. Praticare con cura 4 fori nel cranio e posizionare le viti del gioielliere. Utilizzare acrilico dentale per fissare il copricapo al cranio e viti.
   2. Rimuovere il ratto dal telaio stereotassico e sdraiarsi sul lato destro. Fare un'incisione verticale nella pelle sul lato sinistro del collo, e sezionare attentamente il nervo vago sinistro dall'arteria carotide, situata tra i muscoli sternomastoid e sternohyoid e sotto il muscolo omoidoide.
   3. Tunnel il bracciale conduce sottocutaneamente verso il cranio. Collegare i cavi al copricapo utilizzando i perni d'oro.
   4. Posizionare il nervo vago all'interno del bracciale e fissare il dispositivo chiuso legando un doppio nodo nelle suture del bracciale. Fare attenzione a evitare di danneggiare il nervo durante l'impianto manipolando il nervo con ganci smussati e non conduttivi o afferrando il tessuto connettivo che circonda il nervo.
   5. Testare l'impianto applicando la stimolazione al dispositivo (10 s treno di 0,8 mA, 30 Hz, 100 impulsi bifasici). Un impianto corretto comporterà la cessazione della respirazione e un calo di SpO_{2 del} 5% o più.
   6. Coprire i perni d'oro e cavi esposti con acrilico dentale, ferite da vicino con suture, e pulire i siti di incisione con soluzione di iodio salina, alcol e povidone.
   7. Fornire fluidi sostitutivi, analgesici e cure postoperatorie in linea con le linee guida NIH e l'approvazione IACUC.
2. Stimolare il nervo vago durante il comportamento sveglio.
   NOTA: la consegna di VNS come animali svolgono compiti motori specifici è stato precedentemente dimostrato di espandere la rappresentazione della mappa del motore di muscolatura compito-rilevante. Usiamo questo paradigma convalidato per fornire un esempio rappresentativo di utilizzo del dispositivo, ma molti altri paradigmi comportamentali e/o parametri di stimolazione possono essere rilevanti per le applicazioni alternative. I ratti sono stati addestrati a competenza sul compito di pressa a leva utilizzato qui prima dell'impianto del dispositivo. Dopo la chirurgia, buone prestazioni sono state nuovamente verificate prima della consegna del VNS: i ratti hanno eseguito almeno 100 prove di successo in due sessioni di allenamento di 30 minuti al giorno. VNS è stato accoppiato con presse a leva corrette durante 10 sessioni di allenamento successive per 5 giorni.
   1. Collegare il ratto a un generatore di stimolo tramite il tappo della testa impiantato e regolare le impostazioni di stimolazione appropriate. Per la riorganizzazione indotta da VNS della mappa corticale motoria, accoppiare ogni pressa a leva corretta con un singolo treno di 15 impulsi bifasici, ciascuno con una larghezza di 100 s e un'ampiezza di 800 Hz, erogati ad una frequenza di 30 Hz.
   2. Un treno di stimolazione viene consegnato immediatamente dopo il rilevamento di ogni pressa a leva di successo durante dieci sessioni di allenamento di 30 minuti. Durante la consegna VNS, utilizzare un oscilloscopio per monitorare la corretta consegna della stimolazione corrente.
3. Convalidare la funzione del bracciale cronicamente impiantata.
   1. Entro 24 h dall'ultima sessione di allenamento accoppiata VNS, utilizzare la microstimolazione intratrarrenica (ICMS) per quantificare la mappa somatotopica funzionale nella corteccia motoria^19,20,21,22.
   2. Dopo l'induzione dell'anestesia per la mappatura ICMS della corteccia motoria, convalidare nuovamente la funzione del bracciale applicando un treno da 10 s di 30 Hz, stimolazione di corrente di 0,8 mA (100 impulsi bifasici), che dovrebbe comportare la cessazione della respirazione e la riduzione dei livelli di SpO₂ di almeno il 5%, coerente con il riflesso Hering-Breuer.
      NOTA: A seconda dell'applicazione, la funzione del bracciale può essere considerata accettabile se si osserva un calo affidabile di SpO₂ inferiore al 5% o se ampiezze di corrente più elevate (fino a 1,6 mA) producono in modo affidabile almeno una riduzione del 5% in SpO₂. La mancata osservanza di una cessazione della respirazione e/o di una diminuzione affidabile della SpO_{2 è} indicativa dell'insufficienza dell'impianto.

Risultati

Gli elettrodi e le headcaps dei polsini nervosi vagus sono stati cronicamente impiantati nei ratti secondo le procedure chirurgiche pubblicate in^{precedenza 17,19,20,21,22}. Prima dell'impianto, l'impedenza a 1 kHz è stata misurata attraverso i cavi del polsino con il tubo del polsino immerso in salina (impedenza 1,2 x 0,17 kΩ [media - std]; N - 9). Sono stati...

Discussione

Qui descriviamo un approccio semplice e a basso costo per l'assemblaggio di elettrodi di braccianti stimolanti cronicamente impiantabili per l'uso nei roditori, facilitando le indagini preclinici di questa terapia emergente. Questo metodo semplificato non richiede formazione o attrezzature specializzate e utilizza un piccolo numero di strumenti e forniture facilmente accessibili alla maggior parte dei laboratori di ricerca, riducendo sia i costi monetari che di manodopera della produzione dei dispositivi rispetto ad altr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocompatible polyurethane-based polymer tubing, 0.080" OD x 0.040" ID	Braintree Scientific	MRE080 36 FT
Dissecting microscope	AM Scopes	#SM-6T-FRL
Fine Serrated Scissors, straight, 22mm cutting edge	Fine Science Tools	#14058-09	for cutting Pt/Ir wire and suture thread
Forceps, #5 Dumont forceps, straight, 11 cm, 0.1 x 0.06 mm tip	Fine Science Tools	#11626-11
Forceps, ceramic tipped forceps, 0.3 mm x 30 mm tips	Electron Microscopy Sciences	#78127-71
Gold Pins, PCB Press Fit Socket	Mill-Max	#1001-0-15-15-30-27-04-0	or similar small pins for connecting cuff leads to headcap
Isobutane lighter	BIC	#LCP21-AST	for de-insulating Pt/Ir wire
Micro strip connector with latch, 4-pin	Omnetics	A24002-004 / PS1-04-SS-LT
Pipette tip, 10 uL	VWR	89079-464
Platinum-Iridium (90/10%) Wire, 0.001" (diameter) x 9 strands, PTFE insulated	Sigmund Cohn	10IR9/49T
Razor Blade, Single Edge, Surgical Carbon Steel No.9	VWR	#55411-050	for cutting MicroRenathane tubing
Sewing needle, ca. 4.0 cm length x 0.7 mm diameter (size 6-7)	Singer	00276	Smaller needle for threading Pt/Ir wire
Sewing needle, ca. 4.5 cm length x 0.8 mm diameter (size 2-3)	Singer	00276	Larger needle for pinning cuff during assembly and for threading suture
Small foam board	Juvo+/Amazon	B07C9637SJ	for fabrication platform; our dimensions are ca. 2.5" x 3.5" x 1" (L x W x H)
Solder, multicore lead-free, 0.38mm diameter	Loctite/Multicore	#796037
Soldering station	Weller	WES51	or similar soldering iron compatible with long conical tips (this part has been discontinued)
Soldering tip, long conical, 0.01" / 0.4 mm	Weller	1UNF8
Suture, nonabsorbable braided silk ,size 6/0	Fine Science tools	#18020-60
UV (405 nm) spot light	Henkel/Loctite	#2182207
UV Light Cure Adhesive 25 ml	Henkel/Loctite	AA 3106	or similar biocompatible UV cure adhesive
Wire wrapping wire, 30 AWG	Digikey	K396-ND