Preparazione di nanoparticelle per l'analisi ToF-SIMS e XPS

Riepilogo

Vengono presentate diverse procedure per la preparazione di nanoparticelle per l'analisi superficiale (colata a goccia, rivestimento di spin, deposizione da polveri e criofissazione). Discutiamo le sfide, le opportunità e le possibili applicazioni di ciascun metodo, in particolare per quanto riguarda i cambiamenti nelle proprietà superficiali causati dai diversi metodi di preparazione.

Abstract

Le nanoparticelle hanno guadagnato una crescente attenzione negli ultimi anni a causa del loro potenziale e applicazione in diversi campi tra cui medicina, cosmetici, chimica e il loro potenziale per consentire materiali avanzati. Per comprendere e regolare efficacemente le proprietà fisico-chimiche e i potenziali effetti avversi delle nanoparticelle, è necessario sviluppare procedure di misurazione convalidate per le varie proprietà delle nanoparticelle. Mentre le procedure per misurare le dimensioni delle nanoparticelle e la distribuzione delle dimensioni sono già stabilite, i metodi standardizzati per l'analisi della loro chimica di superficie non sono ancora in atto, sebbene l'influenza della chimica di superficie sulle proprietà delle nanoparticelle sia indiscussa. In particolare, lo stoccaggio e la preparazione di nanoparticelle per l'analisi delle superfici influenzano fortemente i risultati analitici di vari metodi e, al fine di ottenere risultati coerenti, la preparazione del campione deve essere ottimizzata e standardizzata. In questo contributo presentiamo, nel dettaglio, alcune procedure standard per la preparazione delle nanoparticelle per l'analisi delle superfici. In linea di principio, le nanoparticelle possono essere depositate su un substrato adatto dalla sospensione o come polvere. I wafer di silicio (Si) sono comunemente usati come substrato, tuttavia, la loro pulizia è fondamentale per il processo. Per la preparazione del campione da sospensione, discuteremo di drop-casting e spin-coating, dove non solo la pulizia del substrato e la purezza della sospensione, ma anche la sua concentrazione giocano un ruolo importante per il successo della metodologia di preparazione. Per le nanoparticelle con gusci o rivestimenti di ligando sensibili, la deposizione come polveri è più adatta, sebbene questo metodo richieda particolare attenzione nel fissare il campione.

Introduzione

I nanomateriali sono definiti come materiali aventi una dimensione esterna compresa tra 1 nm e 100 nm o aventi una struttura interna o superficiale su questa ^scala1. A causa delle proprietà uniche derivanti dalla loro piccola scala e corrispondentemente ampia superficie (tra gli altri fattori), trovano un uso crescente in un'ampia varietà di campi tra cui agricoltura, chimica, edilizia automobilistica, cosmetici, ambiente, medicina, stampa, energia e tessuti. Questo aumento dell'uso significa che sia l'uomo che l'ambiente saranno esposti, su scala finora sconosciuta, a questi materiali le cui proprietà tossicologiche non sono ancora del tutto note e le cui dimensioni consentono la loro facile integrazione in sistemi biologici o ^ambientali2.

Dopo le proprietà fondamentali della superficie e della distribuzione granulometrica/dimensionale, la chimica superficiale e i rivestimenti sono stati identificati come la proprietà più cruciale dei nanomateriali3; le particelle più piccole hanno una superficie più elevata per unità di massa, e quindi un rapporto più elevato tra atomi di superficie e massa. Infatti, per le nanoparticelle di dimensioni di 1 nm, oltre il 70% degli atomi può essere trovato agli angoli o ai bordi; ciò influenza fortemente le proprietà superficiali come il chemisorbimento che dipende fortemente dalla morfologia superficiale su scala ^atomica4. Le normative relative ai nanomateriali richiedono dati accurati sulle proprietà fisico-chimiche e stime affidabili delle proprietà tossicologiche di questi materiali. Al fine di stimare in modo efficiente le proprietà tossicologiche dalle proprietà fisiche e chimiche dei nanomateriali, la comunità dei nanomateriali richiede procedure analitiche affidabili, standardizzate e verificate. Progetti come ACEnano5 mirano a raccogliere e correlare dati fisici accurati e verificabili dalle nanoparticelle in un quadro che consenta una migliore regolamentazione e caratterizzazione dei nanomateriali. Questa spinta verso procedure analitiche standardizzate è stata sostenuta anche dagli editori di ACS Nano, che desiderano "consolidare e concordare metodi di caratterizzazione e livelli minimi di analisi dei ^materiali6". Inoltre, XPS e ToF-SIMS offrono nuove possibilità per chiarire l'architettura delle particelle delle nanoparticelle ^{core-shell7,8}.

La spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) e la spettrometria di massa ionica secondaria a tempo di volo (ToF-SIMS), confrontate nella Tabella 1, sono metodi consolidati per lo studio degli atomi di superficie. In XPS, il campione viene irradiato con raggi X aventi un'energia compresa tra 1 e 2 keV, causando l'emissione di elettroni a causa dell'effetto fotoelettrico. Questi elettroni emessi, aventi un'energia cinetica nello stesso intervallo, sono correlati all'energia di legame degli elettroni nel solido; la comparsa di fotoelettroni a queste energie di legame definite e intensità misurabili consente quindi l'analisi quantitativa della composizione. Poiché la via libera media di questi fotoelettroni è inferiore a 10 nm, XPS è una tecnica altamente sensibile alla superficie per l'analisi quantitativa. Inoltre, l'analisi dettagliata delle energie di legame in spettri altamente risolti consente la determinazione quantitativa degli stati di valenza di questi elettroni.

In ToF-SIMS la superficie viene spruzzata con un fascio ionico focalizzato (ioni primari), con gli ioni espulsi dal materiale (ioni secondari) raccolti e analizzati in uno spettrometro di massa a tempo di volo. Il pattern massa/carica ottenuto permette la determinazione della composizione elementare, isotopica o molecolare. A causa della via libera media degli ioni secondari, questa tecnica è anche altamente sensibile alla superficie e ha una profondità di informazione di 1-2 nm, ma è nel migliore dei casi semi-quantitativa, a causa dell'effetto matrice per cui la probabilità di ionizzazione (e quindi la resa) degli ioni secondari è fortemente influenzata dalla loro matrice circostante. ToF-SIMS può essere utilizzato sia in modalità statica che dinamica; la differenza tra i due è il flusso ionico primario che colpisce la superficie. I SIMS statici mantengono il flusso ionico primario a un livello che impatta (cioè frammenti) al massimo dell'1%-10% della superficie; la superficie rimane relativamente indisturbata, il che consente l'analisi degli strati atomici superiori di materiale. Poiché anche il SIMS statico provoca una certa distruzione in superficie, è considerato meno "non distruttivo" dei due metodi.

Queste tecniche sensibili alla superficie consentono l'analisi dei primi nanometri del materiale, compresi i rivestimenti intenzionali o non intenzionali, che, per i nanomateriali, possono influenzare in modo significativo le proprietà del materiale. Esempi di rivestimenti intenzionali sono la tappatura di strati su punti quantici per migliorare le rese quantistiche di fotoluminescenza e ridurre la reattività ^ambientale9, rivestimenti di allumina o silice per la prevenzione dell'attività fotocatalitica delle nanoparticelle di titania negli isolanti ^solari10, funzionalizzazione superficiale per consentire la bioconiugazione e la successiva attività ^biologica11, rivestimenti per applicazioni diagnostiche e di somministrazione di ^farmaci12 e rivestimenti in fluorocarbonio su particelle magnetiche per ferrofluidi e sistemi metallici core-shell per migliorare le proprietà del ^{catalizzatore13}. I rivestimenti non intenzionali, come l'ossidazione, la contaminazione superficiale o le corone proteiche nei sistemi biologici hanno un'influenza altrettanto forte sulle proprietà delle nanoparticelle ed è fondamentale che le procedure di preparazione sperimentale garantiscano che il rivestimento e più in generale la chimica superficiale del nanomateriale non vengano distrutti o trasformati. È anche fondamentale valutare le proprietà delle nanoparticelle in quanto sono in situ, poiché le loro proprietà possono essere drasticamente alterate dal cambiamento2,14,15. Inoltre, la concentrazione di stabilizzatori nella sospensione di nanoparticelle può influenzare notevolmente l'analisi e l'integrità strutturale delle nanoparticelle; la presenza di uno stabilizzatore può provocare grandi segnali indesiderati (ad esempio, C, H, O e Na) nell'analisi, mentre la sua rimozione può provocare danni o agglomerazione delle nanoparticelle.

A causa delle loro dimensioni e della loro superficie, le condizioni di conservazione delle nanoparticelle influenzano anche il loro comportamento, sia come polveri / sospensioni immagazzinate che come campioni preparati. L'effetto di condizioni di conservazione non ottimali, in particolare la conservazione a temperatura ambiente e l'esposizione alla luce, ha dimostrato in vari studi di causare la degradazione delle nanoparticelle che ha dimostrato di alterare le proprietà fisiche, chimiche e/o tossicologiche delle particelle14,15,16,17,18 . Le nanoparticelle più piccole hanno dimostrato di ossidarsi più rapidamente di quelle più grandi con tassi di ossidazione/degradazione dipendenti dalle condizioni di ^{conservazione15} e dalla chimica di ^superficie14. È stato dimostrato che gli effetti della degradazione delle nanoparticelle durante lo stoccaggio influenzano in modo significativo le proprietà fisico-chimiche, compresa la ^tossicità14, mentre la crescita ossidativa può procedere verso l'interno a spese del ^nucleo15.

L'attenta conservazione e preparazione dei nanomateriali è quindi essenziale per un'analisi accurata delle superfici e tutti i fattori che potrebbero influenzare la superficie del campione e/o la qualità delle misurazioni devono essere attentamente considerati. Va notato che a causa della risoluzione spaziale relativamente bassa di XPS (nell'intervallo μm) e ToF-SIMS (poche centinaia di nm), solo un piccolo sottoinsieme delle nanoparticelle può essere studiato; questi metodi fanno la media su un'area e non hanno la capacità di visualizzare singole particelle come è possibile con tecniche come la microscopia elettronica. Per questo motivo, qualsiasi analisi richiede la deposizione delle nanoparticelle in uno strato continuo per garantire che non vi siano interferenze dal substrato. La microscopia elettronica e XPS/ToF-SIMS sono quindi spesso utilizzati insieme come metodi complementari per l'analisi dei nanomateriali.

Oltre ai cambiamenti nella chimica delle superfici, le principali sfide per la preparazione di campioni di nanoparticelle per l'analisi XPS e ToF-SIMS sono la preparazione di uno strato che sia: omogeneo, per aumentare la riproducibilità; gapless, per ridurre al minimo il contributo del substrato agli spettri; abbastanza sottile da evitare effetti di carica (per campioni non conduttivi); e fissato saldamente al substrato, per evitare l'ingresso di nanoparticelle libere e danneggiare gli strumenti ad altissimo vuoto

Le nanoparticelle possono essere depositate sul substrato dalla sospensione o come polvere. In primo luogo, discuteremo i diversi metodi per depositare le nanoparticelle dalla sospensione. I wafer di silicio sono un substrato comunemente usato per la deposizione in sospensione, perché sono relativamente economici, prontamente disponibili come prodotto altamente puro costituito da silicio puro o drogato (il drogaggio evita effetti di carica), e per la maggior parte delle nanoparticelle i picchi spettrali non si sovrappongono ai picchi tipici delle nanoparticelle. Quest'ultimo punto è importante; prima dell'analisi si dovrebbe garantire che i picchi del substrato siano ben separati dai picchi attesi dalle nanoparticelle, altrimenti l'interpretazione degli spettri è complicata o impossibile e la copertura continua del substrato da parte delle nanoparticelle non può essere verificata. Prima di utilizzare i wafer di silicio, è necessaria un'ampia procedura di pulizia (descritta in questa pubblicazione) per rimuovere i contaminanti (organici) e aumentare la bagnabilità della superficie. Altri substrati adatti come film d'oro, grafite pirolitica altamente ordinata (HOPG) o fogli di indio sono stati utilizzati con successo, ma una discussione sulla loro preparazione esula dallo scopo di questo lavoro19,20,21,22.

In secondo luogo, presentiamo metodi per depositare polveri di nanoparticelle su un substrato per l'analisi XPS e ToF-SIMS e presentiamo i vantaggi e gli svantaggi di ciascun metodo, consentendo ai ricercatori nuovi alle tecniche di trovare il metodo di preparazione ottimale per i loro scopi. In terzo luogo, discutiamo della criofissazione, che è un metodo di preparazione adatto per conservare caratteristiche come il comportamento dell'agglomerazione, la corona organica, l'interfaccia solido/^acquosa23,24 o la distribuzione in mezzi ^biologici25 di NP. La criofissazione, tipicamente il congelamento rapido del materiale in un criogeno raffreddato ad azoto liquido e l'analisi allo stato congelato-idratato, consente l'analisi e la visualizzazione di nanoparticelle direttamente in matrici complesse. Questa procedura non causa la formazione di cristalli di ghiaccio ma forma ghiaccio amorfo che mantiene le membrane e le strutture cellulari e tissutali nel loro stato biologico nativo, evitando danni causati dai processi di cristallizzazione dell'acqua e consentendo di mantenere l'esatta distribuzione chimica di tutti i metaboliti cellulari e composti della membrana cellulare26,27,28 . Questo metodo di preparazione può essere di particolare interesse per presentare una mappa chimica esatta dell'agglomerato o dell'eteroagglomerato NP effettivo, visualizzando l'esatto spazio chimico in prossimità della nanoparticella direttamente in sospensione, o correlando le caratteristiche specifiche del tessuto cellulare o i compartimenti intracellulari all'interno di agglomerati NP o eteroagglomerati.

Come mostrato attraverso i risultati presentati in questo lavoro, la procedura più adatta in un caso particolare dipende da una varietà di parametri come l'idrofilia, la stabilità, la conduttività, lo stato (ad esempio, polvere o sospensione) delle nanoparticelle e la domanda analitica in questione (ad esempio, dimensioni, proprietà di massa o rivestimenti superficiali). Qui vengono presentati una varietà di metodi che possono essere utilizzati per la preparazione di NP per l'analisi delle superfici, nonché un confronto dei loro vantaggi e svantaggi.

Protocollo

ATTENZIONE: Le proprietà tossicologiche delle nanoparticelle sono ancora in fase di studio; a causa delle loro dimensioni possono presentare pericoli unici nell'uomo e nell'ambiente anche quando sono costituiti da materiali intrinsecamente non pericolosi. Prima di intraprendere qualsiasi lavoro con le nanoparticelle, è necessario completare un'adeguata valutazione del rischio e mettere in atto adeguati controlli ingegneristici, procedure di laboratorio e DPI (dispositivi di protezione individuale), a seconda del livello di pericolo dei materiali da studiare29,30,31,32.

1. Preparazione dei wafer di Si

NOTA: questi passaggi sono necessari per rimuovere la contaminazione indesiderata (organica) e aumentare la bagnabilità superficiale. Tutti i solventi utilizzati devono essere almeno di grado ACS. È adatto un bagno di sonicazione standard (35 kH e 120 Watt).

1. Pulizia chimica a umido dei wafer Si
   1. Mettere il wafer Si in un becher con isopropanolo e ultrasuoni per 5 minuti.
   2. Trasferire il wafer Si in un becher con una soluzione detergente per vetro alcalino e ultrasuoni per 10 minuti.
   3. Metti il wafer in un becher con acqua ultrapura. Cambiare l'acqua 10 volte versando l'acqua e riempiendo il becher; i wafer Si rimarranno sul fondo a causa dell'effetto capillare.
   4. Asciugare il wafer con gas _N2 pulito.
      NOTA: L'essiccazione con _N2 impedisce la formazione di "anelli di caffè" e altri artefatti dall'essiccazione dell'acqua.
   5. Mettere il wafer in un secondo becher con isopropanolo e ultrasuoni per 10 minuti.
   6. Asciugare il wafer con gas _N2 pulito.
   7. Mettere il wafer in un becher con etanolo e ultrasuoni per 10 minuti.
   8. Asciugare il wafer con gas _N2 pulito. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Pulizia al plasma o UV/ozono di wafer di silicio
   1. Introdurre il wafer Si nel plasma o nel detergente UV/ozono e accendere per 30 minuti.
      NOTA: i wafer devono essere puliti al plasma o ai raggi UV/ozono immediatamente prima dell'uso.

2. Deposizione di nanoparticelle dalla sospensione

NOTA: La via di esposizione più comune per le nanoparticelle è per inalazione. Lavorare con le sospensioni può ridurre al minimo i rischi di esposizione.

1. Preparazione di sospensione di nanoparticelle da polvere
   NOTA: Tutte le quantità qui descritte sono esempi. Il metodo dovrebbe essere ottimizzato per le particolari nanoparticelle utilizzate in ciascun caso.
   1. Pesare accuratamente 15 mg di polvere di nanoparticelle (± 10%) in un tubo da 10 ml.
   2. Pesare con precisione in circa 8 ml di acqua ultrapura.
   3. Chiudere il tubo, imballare in un tubo centrifugo da 50 ml con carta assorbente e posizionare nel vortice a 3.000 giri / min per 15 minuti.
2. Drop-casting di nanoparticelle elettricamente conduttive da sospensione acquosa
   1. Posizionare il wafer nel detergente UV/ozono per 30 minuti.
   2. Posizionare il wafer in una metà del supporto del wafer e posizionare una goccia di 3 μL di sospensione di nanoparticelle al centro dell'anello.
   3. Montare un O-ring Viton da 6,07 mm di diametro sul wafer attorno alla goccia. Fare attenzione che l'anello non tocchi la goccia.
   4. Posizionare il wafer in un essiccatore sottovuoto sotto un vuoto di 4 mbar per 15 minuti per asciugare il wafer.
   5. Rimuovere il wafer dall'essiccatore ed esaminare utilizzando la microscopia ottica e XPS per determinare che lo strato di particelle è omogeneo e chiuso. Ripetere i passaggi 2.2.1 e 2.2.2 fino a quando l'analisi non mostra uno strato chiuso e omogeneo. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Spin-coating di nanoparticelle elettricamente non conduttive da sospensione acquosa
   1. Posizionare il wafer nel detergente UV/ozono per 30 minuti.
      NOTA: Con sospensioni spin-coating di diverse concentrazioni utilizzando lo stesso protocollo, è possibile ottenere diversi livelli di copertura superficiale.
   2. Programmare lo spin-coater. Un programma di esempio adatto è: passo 1: rampa da 500 rpm / s a 1.000 rpm (5 s); passo 2: rampa da 1.000 giri/min a 2.000 giri/min (3 min); fase 3: decelerazione a 2.000 giri/min a 0 giri/min.
   3. Inserire il wafer nello spin-coater e accendere il vuoto per la fissazione.
   4. Depositare 80 μL della sospensione sul wafer e avviare il programma.
   5. Rimuovere il wafer dallo spin-coater.
   6. Conservare il campione in un nuovo wafertra pulito. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   7. Analizzare il campione utilizzando SEM per confermare la copertura senza pause del substrato.

3. Deposizione di nanoparticelle dalla polvere

1. Deposizione di nanoparticelle su nastri biadesivi ("stick and go")
   1. Fissare l'adesivo biadesivo al portacampioni e rimuovere il rivestimento.
   2. Prendi una punta di spatola della polvere di nanoparticelle e immergila sull'adesivo.
   3. Stendere il campione sull'adesivo e premere nell'adesivo con la spatola, fino a quando la maggior parte della polvere è rispettata il più possibile.
   4. Verificare che la polvere sia fissata al rubinetto invertendo e picchiettando il portacampioni e soffiando un flusso di gas (ad esempio, azoto) attraverso di esso. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
      NOTA: In alternativa, una piccola quantità di polvere può essere posizionata su una superficie pulita (lamina di alluminio o vetrino) e pressata dall'alto con l'adesivo e il portacampioni a doppia faccia.
   5. Posizionare una punta a spatola della polvere sulla superficie pulita. Premere il portacampioni con l'adesivo sulla polvere dall'alto.
   6. Verificare che la polvere sia fissata al rubinetto invertendo e picchiettando il portacampioni e soffiando un flusso di gas (ad esempio, azoto) attraverso di esso. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Preparazione di pellet in polvere pressata
   1. Pulire accuratamente tutte le parti dello stampo del pellet, facendo attenzione a non graffiare la superficie levigata.
   2. Invertire lo stampo del pellet e riposare su un piccolo distanziatore.
   3. Inserire lo stantuffo e un pellet di acciaio inossidabile, con il lato lucido verso l'alto, e tirare lo stantuffo fino a quando non c'è abbastanza spazio per riempire con il campione in polvere.
   4. Riempire lo stampo con una piccola quantità di campione (1 grande punta di spatola), quindi inserire il secondo pellet di acciaio inossidabile con il lato lucido rivolto verso il campione.
   5. Posizionare la base sul corpo e invertire con cura. Se si desidera e si dispone di un vuoto, collegare la pompa per vuoto alla base dello stampo del pellet.
   6. Metti il dado in una pressa, assicurandoti che sia centrato.
   7. Applicare un carico leggero (2 kN) per circa 20 s e rilasciare.
   8. Applicare un carico più pesante (6 kN) per 2 minuti e rilasciare.
   9. Dopo che il carico è stato rilasciato, rilasciare la pompa per vuoto.
      NOTA: A causa delle diverse proprietà del materiale di varie nanoparticelle, può essere vantaggioso preparare una serie di pellet con carichi e tempi di caricamento diversi per determinare le condizioni ottimali di pressatura del pellet.
   10. Capovolgere lo stampo, posizionare l'anello di estrazione in posizione e posizionare un carico leggero (fino a 1 kN) tra lo stantuffo e l'anello di estrazione.
   11. Rimuovere le parti dello stampo dalla pressa ed estrarre con cura il pellet campione con una pinzetta.
   12. Montare delicatamente il campione su un wafer Si pulito utilizzando biadesivo. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Criofissazione di sospensioni di nanoparticelle

1. Riempire la camera principale del dispositivo di congelamento rapido con azoto liquido.
2. Riempire la camera di congelamento rapido raffreddata con il criogeno (propano).
3. Lasciare che il dispositivo a congelamento rapido si raffreddi alla sua temperatura operativa.
   NOTA: il dispositivo di congelamento rapido richiede un po 'di tempo per raggiungere la temperatura operativa prima della preparazione del campione, pertanto è necessario un lasso di tempo ragionevole (alcune ore) per la criofissazione dei campioni.
4. Drop-cast 10-20 μL di sospensione NP su un wafer Si pulito con una pipetta.
5. Tenendo il wafer Si con una pinzetta di fissaggio, posizionarlo all'interno del dispositivo di congelamento a tuffo.
6. Spostate le pinzette di fissaggio in posizione di immersione.
7. Premere il pulsante per rilasciare il campione all'interno del criogeno.
8. Attendere alcuni secondi fino a quando il campione non è completamente congelato.
9. Trasferire i campioni congelati il più velocemente possibile in un ambiente raffreddato.
10. Posizionare il campione criofissato (wafer Si) nel portacampioni e trasferirlo all'interno dello strumento.
    NOTA: per il trasporto, si consiglia il ghiaccio secco ed è possibile conservare il campione a breve termine. I campioni possono essere misurati allo stato congelato con uno strumento raffreddato o con le impostazioni toF-SIMS convenzionali dopo la stabilizzazione mediante liofilizzazione del campione.

Risultati

Questo documento presenta una varietà di metodi di preparazione del campione per l'analisi superficiale delle nanoparticelle. Poiché le proprietà fisico-chimiche di uno specifico NP definiranno sia il metodo ottimale per la preparazione del campione (ad esempio, drop-casting vs spin coating) sia la procedura migliore per tale metodo (ad esempio, richiedendo substrati o solventi diversi), l'idoneità del metodo utilizzato dovrebbe essere convalidata tramite metodi analitici alternativi e ottimizzata se necessario. I risultati osservati in questa pubblicazione sono coerenti con la letteratura precedentemente pubblicata nel mostrare la necessità di protocolli e procedure coerenti per la preparazione dei campioni, nonché la necessità di controlli di qualità per garantire che i metodi di preparazione e purificazione del campione siano appropriati, di successo e non danneggino le nanoparticelle22,33,34,35,36.

I metodi di campionamento e conservazione delle NP non sono stati qui affrontati, in quanto sono descritti in dettaglio in vari altri riferimenti14,15,16,17,18,34,37,38,39. Naturalmente, si dovrebbe prestare molta attenzione affinché i campioni analizzati siano rappresentativi della distribuzione complessiva delle nanoparticelle e dei metodi di campionamento adeguati sviluppati e convalidati. È stato anche dimostrato che le condizioni di conservazione influenzano fortemente le proprietà delle nanoparticelle per un periodo di mesi e dovrebbero pertanto essere attentamente considerate. Ad esempio, raccomandiamo che le nanoparticelle siano conservate in piccole quantità in contenitori sigillati al riparo dalla luce, idealmente al di sotto dei 4 °C. È inoltre fondamentale che la conservazione, il campionamento e la preparazione dei campioni siano eseguiti in modo coerente secondo procedure convalidate e siano documentati in dettaglio. Questa documentazione dovrebbe includere i metadati delle NP stesse, come le informazioni sulla provenienza e le condizioni di ^{conservazione40}. Strumenti come i quaderni di laboratorio elettronici (ELN) possono essere utili per una documentazione coerente delle procedure e dei metadati NP, oltre a consentire la produzione di dati secondo il principio FAIR (Trovabile, Accessibile, Interoperabile e Riutilizzabile).

Un'analisi accurata e corretta della superficie delle NP richiede in primo luogo una scelta adeguata del substrato. Abbiamo utilizzato wafer di Si puliti come substrati perché sono facilmente disponibili, durevoli, facilmente pulibili, conduttori e sufficientemente piatti, tuttavia a seconda degli obiettivi dell'analisi lo strato superficiale di ossido può essere un inconveniente, in quanto gli idrocarburi avventizi sul substrato non possono essere differenziati da quelli sulle nanoparticelle. Quando necessario, è possibile utilizzare altri materiali come rivestimenti in oro o polimerici su wafer Si, wafer _Si3N4 o HOPG (grafite pirolitica altamente orientata^)19,20,21,22. Il primo passo nella preparazione del campione descritto in questo documento è la pulizia del wafer Si, mostrato come schema nella Figura 1. L'efficacia del processo di pulizia può essere verificata con una varietà di metodi tra cui XPS, come mostrato nella Figura 2. Il principale contaminante (carbonio avventizio) è tipico dei campioni conservati nell'aria e viene significativamente ridotto dopo il processo di pulizia. Inoltre, l'idrossilatazione della superficie del wafer tramite trattamento UV o ozono evita l'effetto anello del caffè dalla deposizione da sospensione acquosa migliorando la bagnabilità e portando, quindi, a una distribuzione più omogenea delle nanoparticelle come mostrato in Figura 3. Metodi alternativi di pulizia chimica a umido per i wafer si possono essere utilizzati secondo necessità; qui è necessaria solo una superficie riproducibilmente pulita piuttosto che la rimozione completa di tutti i contaminanti organici o dello strato di ossido. Se il protocollo viene sospeso tra le fasi di pulizia e deposizione in sospensione, il wafer deve essere nuovamente trattato sotto plasma o UV / ozono e la sospensione depositata idealmente entro 15 minuti dal trattamento.

La sospensione di nanoparticelle a guscio centrale Au-Ag da 60 nm mostrata nel paragrafo 2.2 conteneva una quantità significativa di citrato di sodio come stabilizzatore, che è un evento comune nelle sospensioni di nanoparticelle. Per un'analisi accurata di queste particelle e delle loro proprietà superficiali, in particolare tramite XPS, è necessario rimuovere il maggior numero possibile di stabilizzatori, in quanto attenua il segnale dalle nanoparticelle e provoca effetti di carica. Al fine di stabilire il metodo di purificazione ottimale per queste nanoparticelle, mostrate come micrografie SEM nella Figura 4, sono state dializzate in acqua ultrapura o purificate utilizzando la centrifugazione e la ri-dispersione in triplice copia. Sebbene la dialisi sembri un metodo più delicato e la centrifugazione e la ridispersione abbiano maggiori probabilità di causare agglomerazione e aggregazione delle particelle, le immagini SEM mostrano una deformazione e un danno significativi delle nanoparticelle Au-Ag dopo la dialisi (Figura 4B), mentre le particelle centrifugate/ridisperse sono ancora intatte (Figura 4C ). Ciò è particolarmente notevole con le nanoparticelle metalliche; la nostra ipotesi è che ci sia una quantità ottimale di citrato di sodio che consente una certa stabilizzazione della soluzione senza interferire con il segnale per le nanoparticelle, e la rimozione di troppo stabilizzatore provoca danni alle nanoparticelle. Un rapporto precedente mostra che esiste un numero ottimale di cicli di centrifugazione per la rimozione della maggior parte del citrato di sodio; il superamento di questo numero causa una certa aggregazione ^NP33. In questo studio, sono stati necessari nove cicli di dialisi (per un totale di 36 ore) per ottenere una concentrazione di citrato simile; tuttavia, questo metodo ha comportato una maggiore quantità di aggregazione rispetto alla centrifugazione e ha causato una diminuzione della funzionalizzazione della superficie. Questi risultati dimostrano l'importanza di verificare ogni fase della procedura di preparazione per ogni diverso tipo di nanoparticelle, in particolare con campioni sconosciuti.

Le nanoparticelle a guscio au-ag da 60 nm utilizzate in questo esempio sono adatte per il drop-casting a causa della loro conduttività elettrica, perché gli effetti di carica non sono un problema e un punto spesso può essere generato da deposizioni ripetute utilizzando relativamente poche apparecchiature. Questo strato più spesso ha il vantaggio di fornire misurazioni più riproducibili e la fusione da una sospensione più concentrata può far risparmiare tempo riducendo il numero di fasi di deposizione. La deposizione può essere influenzata dalla bagnabilità del substrato; una scarsa bagnatura può produrre una spessa macchia di nanoparticelle che è vantaggiosa per i campioni conduttivi, mentre una buona bagnatura può produrre uno strato di nanoparticelle più omogeneo, che può essere utile sia per i campioni conduttivi che isolanti. Come descritto nel protocollo, il drop-casting di sospensioni di nanoparticelle di solito richiede ripetute applicazioni per ottenere uno spesso strato con copertura completa; questo dovrebbe essere verificato utilizzando XPS, ma può anche essere verificato rapidamente e facilmente utilizzando la microscopia ottica. La Figura 5 mostra l'evoluzione della copertura delle goccioline in un drop-casting di nanoparticelle di guscio centrale Au-Ag da soluzione acquosa; in questo caso, sono necessarie 13 fasi di drop-casting per ottenere una copertura completa. Il drop casting è particolarmente adatto per le particelle conduttive, ovvero quelle in cui gli effetti di carica possono essere adeguatamente compensati. Come per gli altri metodi descritti in questa pubblicazione, il drop-casting dovrebbe essere ottimizzato per ciascun campione in quanto diversi materiali NP avranno proprietà diverse per quanto riguarda la profondità e la concentrazione delle informazioni e i limiti di spessore del film. È importante evitare film troppo spessi che possono causare l'accatastamento di sostanze organiche a loro volta inibendo il segnale NP.

Un rivestimento omogeneo e di buona qualità aiuta a garantire risultati coerenti e riproducibili. Oltre alla concentrazione della sospensione, al solvente e ai parametri di spin-coating, la qualità delle sospensioni rivestite di spin può anche essere influenzata negativamente dalla presenza di polvere o altre particelle macro o microscopiche di grandi dimensioni. La Figura 6 mostra il miglioramento della qualità dello spin-coating di una sospensione di nanoparticelle dopo filtrazione con un filtro a siringa da 0,45 μm. Il filtro deve essere selezionato per garantire che non rimuova le nanoparticelle dalla sospensione. Le tre diverse concentrazioni di sospensione descritte nel protocollo (90, 9,0 e 0,9 mg/mL di nanoparticelle nucleo-guscio PS-PTFE da 135 nm) sono state spin-cast nelle stesse condizioni e analizzate utilizzando SEM e XPS. L'immagine superiore e lo spettro nella Figura 7 mostrano il film proiettato dalla sospensione da 90 mg/mL, che mostra una copertura multistrato spessa e senza pause nell'immagine SEM e una notevole assenza di picchi di Si negli spettri CPS, indicando nessun contributo del substrato allo spettro. Questo esempio è ideale per l'analisi XPS o ToF-SIMS; inoltre, i picchi F1 più piccoli dal guscio delle particelle possono essere chiaramente visti in assenza di un grande segnale dal substrato. Il secondo campione proiettato dalla sospensione da 9,0 mg/ml mostra le particelle in piccoli agglomerati monostrato, che non coprono completamente la superficie. Questo esempio è troppo sottile e disomogeneo per l'analisi XPS o ToF-SIMS. Inoltre, l'analisi quantitativa può essere compromessa a causa dell'apporto di carbonio avventizio sul substrato anche dopo un'attenta pulizia; per lo meno, tale effetto deve essere considerato nel bilancio di incertezza della misurazione. Questo campione sarebbe, tuttavia, ideale per l'analisi SEM o TEM della distribuzione granulometrica utilizzando un software di analisi delle immagini, poiché le particelle esistono in un singolo strato e in un numero sufficiente (all'interno dell'immagine) per fornire una valutazione statisticamente significativa. Il campione fuso dalla concentrazione più bassa (0,9 mg/ml) non fornisce né una copertura continua né una densità di particelle sufficiente per renderlo adatto per l'analisi della chimica superficiale o della distribuzione granulometrica. Un'analisi quantitativa affidabile non è affatto possibile a causa dell'influenza dominante del substrato.

Le NP core-shell _al2O3-TiO2 con uno strato esterno PDMS o glicerolo sono state preparate tramite drop-casting dalla sospensione e dalla polvere utilizzando il metodo "stick-and-go" al fine di confrontare gli effetti dei diversi metodi di preparazione sullo strato esterno sensibile. I campioni sono stati analizzati con ToF-SIMS, dove negli spettri è stato analizzato utilizzando l'analisi dei componenti principali (PCA). PCA è una tecnica statistica per ridurre la dimensionalità di grandi set di dati creando nuove variabili non correlate (i componenti principali), che massimizzano la varianza nei dati41,42,43,44,45. La separazione di diversi set di campioni sul grafico dei componenti principali consente di analizzare e raggruppare più facilmente i risultati. Nel grafico dei punteggi PCA nella Figura 8B, che mostra il potere di discriminazione di ciascun set di dati rispetto a tutti gli altri set di dati (cioè tra diversi set di campioni) i due campioni preparati dalla polvere mostrano punteggi molto diversi, mentre i campioni preparati dalla dispersione mostrano punteggi molto simili. I grafici di carico mostrati nella Figura 8C indicano la relazione tra le variabili, cioè quali picchi contribuiscono maggiormente alle rispettive componenti principali. Tutti i componenti principali sono ordinati in base al loro contributo alla differenza osservata tra i set di dati, cioè PCA1 contribuisce maggiormente alla separazione osservata dei diversi set di dati. Pc1 è dominato dalla presenza (NP rivestite di PDMS preparate in polvere) o dall'assenza (tutti gli altri campioni) di picchi PDMS, mentre PC2, il fattore che rappresenta la seconda più grande variazione all'interno dei set di dati, consente la differenziazione dell'Al2O3 e il capping organico sulle NP. Ciò indica che gli spettri misurati delle NP preparate dalla sospensione sono molto simili e suggerisce che gli strati di PDMS e glicerolo potrebbero essere stati rimossi o danneggiati dalla preparazione dalla sospensione, dalla sospensione stessa o dal processo di essiccazione, con segnali dominanti _dall'Al2O3 o dal _TiO2.

Mentre i pellet pressati possono fornire vantaggi per la preparazione di campioni in polvere come la facilità di manipolazione e la stabilità negli strumenti ad altissimo vuoto (compresa la capacità di sputter senza spostare le NP nella camera ad alto vuoto), le forze elevate coinvolte possono anche danneggiare le nanoparticelle sensibili, come è già stato visto con altri metodi di preparazione. Un protocollo adeguato dovrebbe essere preparato e convalidato.

Nel caso di dispersioni NP, la criofissazione delle sospensioni di campioni drop-cast evita gli effetti dell'anello di caffè (a causa del fissaggio istantaneo della sospensione NP e quindi dell'eliminazione degli effetti di essiccazione) nonché la conservazione di strutture più grandi presenti nella sospensione. Inoltre, viene evitata l'applicazione di nastro adesivo. Ciò a sua volta si riflette in segnali ridotti, che possono essere attribuiti a sali, contaminanti o altri artefatti della procedura di preparazione del campione nei rispettivi spettri di massa come mostrato nella Figura 9. Il principale vantaggio della criofissazione è la capacità di conservare "così com'è" lo spazio chimico intorno alle nanoparticelle e/o l'entità chimica degli agglomerati o degli eteroagglomerati delle particelle, nonché la loro correlazione con le caratteristiche biologiche all'interno dei tessuti o delle singole cellule o anche la co-localizzazione ai compartimenti intracellulari, senza interruzioni dovute alle fasi di manipolazione del campione come l'essiccazione, drop-casting, ^ecc46'47. Abbiamo dimostrato l'applicabilità della tecnica di criofissazione all'interno dell'attuale articolo e abbiamo evidenziato i vantaggi della criofissazione per le nanoparticelle di _TiO2. Sottolineiamo che la criofissazione è particolarmente adatta per l'analisi di campioni biologici dovuti al loro stato naturale senza la dislocazione di sostanze chimiche dovute a manufatti di preparazione del campione. Per informazioni più approfondite sulle tecniche di fissazione per campioni biologici si rimanda alla letteratura19,25,27,48,49.

	XPS ·	ToF-SIMS
Fascio sonda	Fotoni	Ioni
Fascio di analisi	Elettroni	Ioni
Risoluzione spaziale*	> 1 μm	0,1 μm
Profondità di campionamento	0,5 – 7,5 nm	<2 nm
Limite di rilevamento	0,01 -0,1 atomo %	Ppb
Quantificazione	Eccellente (semi quantitativo)	Impegnativo (effetti matrice)
Contenuto informativo	Elementare Legame chimico	Elementare Molecolare
Analisi Organica	Eccellente	Eccellente in modalità statica
* specificato dal produttore

Tabella 1: Confronto di vari metodi per l'analisi delle superfici.

Metodo	Adatto per	Dà	Vantaggi	Difetto	Cautela	Controlli	Assegno
Dialisi	Purificazione	Rimozione di stabilizzanti/impurità	Semplice, a basso sforzo, senza attrezzature complicate	Mancanza di controllo sul processo	Può causare danni alle nanoparticelle	Ore	Danni alle nanoparticelle (SEM)
Centrifugazione/ridispersione	Purificazione	Rimozione di stabilizzanti/impurità	Più controllo sul processo, concentrazione simultanea	Ad alta intensità di manodopera, richiede centrifuga	Può causare aggregazione o agglomerazione	Velocità di rotazione della centrifuga, quantità di solvente	Agglomerazione/aggregazione/danno alle nanoparticelle (SEM)
Drop casting (sospensione)	NP conduttive senza strato esterno sensibile	Punto rivestito relativamente spesso	Attrezzatura semplice, senza complicazioni	Può dare spessore disomogeneo, dispendioso in termini di tempo	La preparazione delle sospensioni può danneggiare i gusci NP sensibili	Concentrazione di sospensione, solvente (bagnabilità del substrato)	Copertura (microscopia ottica/XPS)
spin coating (sospensione)	NP conduttive o non conduttive senza strato esterno sensibile	Strato sottile omogeneo o particelle singole	Impostazioni coerenti	Richiede la determinazione sperimentale dei parametri ottimali	Filtrare polvere / impurità, la copertura potrebbe essere incoerente	Concentrazione, parametri di spin coating, solvente	Prefiltrazione, copertura, spessore dello strato (SEM/XPS)
"stick and go" (polvere)	NPS inorganico conduttivo e non conduttivo con strato esterno sensibile	Spot in polvere sull'adesivo	Semplice, a basso sforzo, senza attrezzature complicate	Non adatto per NP organici o contenenti C, spessore del film incoerente	Pericolo di rilascio di NP negli strumenti	Fissazione delle NP sull'adesivo	Stabilità in condizioni di alto vuoto
deposizione nel foro di un mozzicone (polvere)	Analisi XPS; particelle organiche o inorganiche conduttive/non conduttive	Campione di nanoparticelle leggermente pressato	Nessun contatto con altri materiali	Nessuna fissazione sicura delle NP; non adatto per ToF-SIMS	Dager di RILASCIO NP negli strumenti	Nessuno	Leggermente inclinato di lato, per garantire che la polvere sia compattata
Pellet pressato (polvere)	NPS conduttivi e non conduttivi, NP polimerici	Pellet solido	Consente l'analisi di NP polimeriche come polvere	Può danneggiare o contaminare la superficie NP	I materiali devono essere puliti accuratamente per evitare la contaminazione superficiale; può danneggiare la superficie	Dimensioni, pressione, tempo	Stabilità in condizioni di alto vuoto
Crio-fissazione (sospensione)	Sospensioni NP con strato legante sensibile; campioni biologici	Campione solido	Conserva la morfologia, lo stato biologico nativo e la corona, riduce l'effetto anello del caffè	Preparazione sofisticata e costosa e gestione dei campioni, richiede un utente esperto	alto grado di competenze richieste per la gestione e la conservazione dei campioni	Concentrazione, dimensione delle gocce, temperatura	Conservazione della vetrificazione

Tabella 2: Confronto tra i diversi metodi di preparazione dei campioni.

Figura 1: Processo di pulizia per i wafer Si. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Spettri XP del wafer Si prima e dopo la pulizia. Sondaggio prima (grigio) e dopo (rosso) pulizia, che mostra la diminuzione della quantità di carbonio dal 13% al 2 at%. Gli spettri sono stati ottenuti con un Kratos Supra DLD (Manchester, Regno Unito) con una radiazione monocromatica Al Kα. I campioni sono stati fissati con nastro biadesivo sul portacampioni, l'energia di passaggio era di 80 eV, larghezza del gradino 1 eV, tempo di permanenza 500 ms. È stata utilizzata la "modalità obiettivo ibrido". La dimensione dello spot a raggi X era di 300 x 700 μm². Una pistola alluvionale è stata utilizzata per il risarcimento della carica. Per l'analisi quantitativa, è stato utilizzato il pacchetto software UNIFit ²⁰²⁰⁵⁰ , utilizzando le aree di picco dei corrispondenti picchi fotoelettronici corretti con uno sfondo di Tougaard e normalizzati con fattori di Scofield, percorsi liberi medi anelastici e la funzione di trasmissione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto della pulizia UV/Ozono sull'omogeneità della dispersione di particelle nella colata di nanoparticelle nucleo-guscio di PTFE-PMMA da sospensione acquosa. I wafer puliti con UV/ozono mostrano una significativa diminuzione degli anelli del caffè, nonché una migliore adesione delle particelle alla superficie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Opzioni di trattamento per la rimozione delle impurità (ad esempio, stabilizzanti) dalle sospensioni di nanoparticelle Immagini SEM che mostrano l'effetto della dialisi (in alto a destra) e della centrifugazione e ridispersione in triplice (in basso a destra) su nanoparticelle a guscio centrale Au-Ag da 60 nm. Le nanoparticelle sono chiaramente danneggiate dalla dialisi, mentre la centrifugazione non ha alcun effetto visibile. Tutte le barre della scala sono 100 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini al microscopio ottico da drop-casting di nanoparticelle a guscio Au-Ag da 60 nm di diametro da sospensione acquosa su wafer di silicio, che mostrano una copertura sufficiente dopo 13 gocce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Sospensione di nanoparticelle rivestite con spin, prima (a sinistra) e dopo (a destra) della filtrazione con un filtro a siringa da 0,45 μm. Il miglioramento della qualità dopo la filtrazione può essere visto chiaramente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Immagini SEM e spettri XPS di nanoparticelle nucleo-guscio PMMA-PTFE spin-cast a varie concentrazioni, mostrando l'effetto dei picchi di substrato (da copertura insufficiente) sugli spettri XPS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Grafico del punteggio PCA (Principal Component Analysis), derivato dagli spettri ToF-SIMS delle NP core-shell Al2O3-TiO2 rivestite in glicerolo e PDMS. (A) Schema della struttura NP; (B) Punteggi e (C) Grafici di carico dopo l'analisi ToF-SIMS dei metodi di preparazione drop-cast (dispersione) e "stick-and go" (polvere). PC1 rappresenta picchi correlati a frammenti PDMS; PC2 separa i campioni con un rivestimento organico (campioni preparati dalla polvere) da Picchi di _Al2O3 apparentemente senza rivestimento superficiale. Gli spettri sono stati misurati in modalità positiva su uno strumento IONTOF ToF-SIMS IV (ION-TOF GmbH, Münster, Germania) in modalità spettrometria (HCBU) con un fascio ionico _Bi3⁺ da 25 kV con una densità di dose massima di ¹⁰¹² ioni/^cm2. Un campo visivo di 150 x 150 μm è stato scansionato in modalità a dente di sega con 125 x 125 pixel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Sezione degli spettri di massa ToF-SIMS delle NP _TiO2. (A) preparato in polvere con il metodo "stick and go" e (B) dopo criofissazione della dispersione NP. Uno strumento ToF-SIMS (ION-TOF V; Ion-TOF GmbH, Münster, Germania) è stato utilizzato per analisi di spettrometria di massa con una pistola pulsata a ioni di metallo liquido _Bi3⁺ da 30 keV (LMIG, corrente continua (dc), 16 nA). Ogni spettro è stato acquisito scansionando il fascio ionico su un'area campione di 500 × 500 μm. Gli ioni secondari positivi sono stati acquisiti nell'intervallo di massa 0-1.200 Da utilizzando 106 ^impulsi _Bi3+. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Sono stati presentati diversi metodi per la preparazione di nanoparticelle per l'analisi delle superfici utilizzando XPS e ToF-SIMS. Abbiamo riassunto i vantaggi e gli svantaggi di questi metodi, nonché le possibili fonti di errore e idoneità per materiali diversi, nella Tabella 2. Come mostrato nei risultati rappresentativi, la preparazione di nanoparticelle può influenzare fortemente il successo dell'analisi superficiale risultante. Inoltre, non tutti i metodi sono adatti a tutti i tipi di particelle a causa di fattori quali l'interferenza del segnale con il substrato o i materiali di montaggio, gli effetti di carica in film spessi non conduttori, lo stato delle nanoparticelle come polvere o sospensione, il potenziale danno agli strati esterni sensibili, la distruzione di strutture biologiche e informazioni sull'aggregazione e le interfacce, o la vulnerabilità di strumenti sensibili ad altissimo vuoto per liberare nanoparticelle.

Poiché le misurazioni XPS e ToF-SIMS fanno la media su un'area piuttosto che misurare singole particelle, è possibile ottenere risultati riproducibili solo da strati omogenei; occorre pertanto evitare l'aggregazione o l'agglomerazione delle particelle sul substrato. Inoltre, strati troppo spessi di materiali non conduttivi causano effetti di carica durante l'analisi, che possono portare a artefatti indesiderati negli spettri, in particolare la carica parziale che non può essere compensata con una pistola di inondazione. D'altra parte, le pellicole incomplete mostrano forti segnali dal substrato o dai materiali di montaggio (ad esempio, adesivi), che possono interferire con picchi sensibili dalla superficie delle particelle. Lo spessore ideale del film dipende dal materiale e deve essere determinato sperimentalmente mediante analisi di film di diversi spessori. In particolare, i campioni preparati utilizzando lo spin coating devono essere analizzati con SEM per garantire la completezza del rivestimento.

Lavorare con sospensioni NP presenta meno rischi di esposizione e requisiti di sicurezza rispetto al lavoro con polveri NP. Il drop-casting è un metodo relativamente semplice con bassi requisiti di equipaggiamento ed è particolarmente adatto per le nanoparticelle conduttive in sospensione in cui lo spessore del film non è un problema. Mentre i campioni possono essere facilmente essiccati in condizioni atmosferiche, l'essiccatore sottovuoto serve a ridurre il tempo di asciugatura per le goccioline e a proteggere i wafer dalla contaminazione. L'anello Viton viene utilizzato per modificare i modelli di evaporazione della goccia e quindi ridurre al minimo la formazione di anelli di caffè. I modelli di evaporazione possono anche essere influenzati variando l'idrofilia del substrato utilizzando protocolli di pulizia o applicando rivestimenti ^{alternativi51,52}, evaporando in atmosfere di ^solvente53 o anche riscaldando il ^substrato54. Lo spin-coating è consigliato per le sospensioni di nanoparticelle non conduttive in sospensione perché è in grado di generare uno strato di particelle omogeneo che è abbastanza sottile da evitare effetti di carica ma ancora abbastanza spesso da impedire al substrato di Si di contribuire agli spettri XPS e ToF-SIMS. Per ogni singolo sistema NP e concentrazione, sia i parametri della centrifuga che quelli di spin-coating devono essere ottimizzati, ma possono quindi essere riprodotti in modo molto affidabile anche su strumenti diversi. Poiché la goccia rivestita di spin è sempre nel mezzo del wafer, il raggio di rotazione è irrilevante e l'unità "giri al minuto" (rpm) può essere utilizzata. La sospensione potrebbe in alternativa essere depositata sul wafer dopo l'avvio del programma; tuttavia, ciò richiederebbe diversi parametri di spin-coating e una maggiore quantità di sospensione per ottenere un rivestimento più spesso.

A causa delle loro dimensioni estremamente ridotte, le nanoparticelle possono staccarsi dal substrato e muoversi liberamente all'interno della camera ad altissimo vuoto quando vengono colpite con un fascio di ioni o raggi X. Questo è un problema particolare per i campioni preparati con polvere. In alcuni casi, le nanoparticelle possono penetrare nei componenti sensibili dello strumento richiedendo una manutenzione costosa e dispendiosa in termini di tempo. A causa della tensione di accelerazione applicata, il pericolo di danneggiare le parti sensibili è maggiore con ToF-SIMS che con XPS. I campioni in polvere, in particolare quelli preparati con il metodo "stick and go", devono essere attentamente controllati per garantire che le polveri siano fissate in modo abbastanza sicuro, in particolare per l'analisi ToF-SIMS. Ciò può essere confermato, ad esempio, tenendo il campione a testa in giù e soffiando un flusso di gas (ad esempio, _N2) attraverso di esso. Prima dell'analisi, i campioni possono anche essere lasciati durante la notte nella camera d'aria o in un'altra camera di ingresso iniziale del campione dello strumento, dove un vuoto stabile può indicare che non ci sono particelle sciolte dal campione. Le nanoparticelle preparate come pellet, tuttavia, possono anche essere sputtered (a basse tensioni di accelerazione) senza danneggiare lo strumento; questo metodo può eliminare i contaminanti, in particolare gli idrocarburi, introdotti dalla pressa e può anche consentire l'analisi di massa delle particelle.

La preparazione di polveri NP nello stub del portacampioni consente la preparazione di campioni con geometria definita e una superficie macroscopicamente piana. I punti critici sono la pulizia dello strumento per la pressione del campione e l'uso di una bassa pressione per evitare cambiamenti nella superficie delle nanoparticelle a causa di questa procedura. Ha gli svantaggi di aver bisogno di una quantità relativamente elevata di materiale e potenziali problemi con la perdita di materiale negli strumenti ad alto vuoto. Non raccomandiamo questo metodo per l'analisi ToF-SIMS, poiché le particelle non vengono compresse o fissate in alcun modo.

Per quanto riguarda il materiale NP, la prima considerazione per la preparazione del campione è l'eliminazione o la minimizzazione delle interferenze tra NP e substrati di materiale simile; ad esempio, i wafer Si sono un substrato inadatto per l'analisi di NP _SiO2 utilizzando XPS e ToF-SIMS, anche con una copertura del campione sufficiente. Le nanoparticelle metalliche o inorganiche possono essere facilmente analizzate come polvere su un adesivo (supponendo che non contengano strati organici o rivestimenti) a causa della mancanza di interferenze di segnale tra le nanoparticelle e l'adesivo fronte/retro, un metodo di preparazione che non sarebbe adatto per le NP polimeriche. Le nanoparticelle metalliche hanno una maggiore flessibilità in termini di possibile spessore del film utilizzato a causa dell'assenza di effetti di carica, e può essere drop-cast con relativamente poca attrezzatura; tuttavia, è probabile che contengano grandi quantità di impurità e stabilizzanti dalla loro sintesi, che devono essere accuratamente rimossi senza danneggiare le particelle. Le nanoparticelle polimeriche possono essere più facilmente danneggiate dalla pressatura dello stampo, ma possono anche essere tenute insieme più facilmente nel pellet, a seconda delle pressioni utilizzate. Anche i pellet o i rivestimenti organici morbidi sulla superficie NP possono essere sensibili ai danni. La deposizione diretta dalla soluzione ha il potenziale di danneggiare i rivestimenti sensibili sia attraverso la sospensione che il processo di essiccazione, ma è vantaggiosa per l'analisi delle NP già presenti in sospensione. La criofissazione è un metodo adatto per l'analisi di strutture chimiche, superfici o interfacce in sospensione che verrebbero danneggiate o distrutte da varie altre tecniche di preparazione del campione, ma richiede una crioequipment specializzata sia per XPS che per ToF-SIMS46'47.

Mentre questo documento descrive diversi metodi esemplari che possono essere utilizzati per la preparazione del campione, in ogni caso il metodo dovrebbe essere ottimizzato e convalidato utilizzando metodi analitici alternativi. Recentemente è stata pubblicata una panoramica dettagliata dell'influenza dei diversi ^fattori22. Oltre allo sviluppo e alla convalida di metodi di preparazione adeguati, anche la documentazione di queste fasi è di fondamentale ^importanza40. Questa pubblicazione presenta alcuni metodi facili da gestire ed è una guida per modificare o sviluppare nuovi metodi in base ai requisiti del compito specifico.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-figure Laboratory balance	Kern & Sohn GmbH	ADB200-4A
5 mm Pellet die	Specac	GS03060
Alkali glass cleaning solution	Sigma-Aldrich	Hellmanex™ III Z805939	Special cleaning solution for cuvettes
Carbon adhesive tabs	Plano	"Leit-Tabs" G3347
Clean laboratory beakers	any		e.g. 300 mL
Cryo-freezer	Electron Microscopy Sciences	EMS-002 Cryo Workstation
Dialysis tube with fasteners	Medicell Membranees Ltd	DTV12000.06.30	Molecular weight cut-off (MWCO) 12-14 kDa
Die press	any		Capable of 2 kN force
Disposable syringe, 1 mL, Luer-slip	TH Geyer	Labsolute 7657545	Any appropriate volume can be used
Double-sided adhesive	3M	Removable Repositionable Tape 665
Dry ice	Linde AG	ICEBITZZZ®	For short term storage/cooling
Eppendorf transfer pipette and tips	Eppendorf	various	Check correct size for planned pipetting volume
Ethanol, ACS grade	Merck KGaA	1009832500
FFP2 or FFP3 mask	various		For working with nanoparticles from non-hazardous materials, when not in a fume hood or glove box
Isopropanol, ACS grade	Merck KGaA	1096342500
Lab coat, gloves and goggles	any
Laboratory centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Laboratory fume hood	any		necessary for working with nanoparticles
Laboratory stirrer & stirrer bar	NeoLab	D-6010
Lint-free wipes	Kimberley Clark Professional	Kimtech Science Precision wipes	Recommended for working with Si wafers
Liquid Nitrogen	Linde AG	Stickstoff flüssig 5.0	Only for cooling of the cryogen.
Microtube/centrifuge tube 1,5 mL	T.H. Geyer GmbH & Co. KG	Labsolute 7696751
Nitrogen 5.0	any		99.999% purity
Pasteur pipette, PE, plastic 3 mL	TH Geyer	Labsolute 7 691 203
Pasteur pipette, PE, plastic 3 mL	TH Geyer	Labsolute 7 691 203
Powder sample holder	BAM workshop		"Home-made" sample holder
Propane	Sigma-Aldrich	769037	The cryogen should be of highest possible purity.
Sample vial or centrifuge tube 1 mL	Greiner Bio-One GmbH	Cellstar 188 261	Should be capable of being fixed in the Vortexer
Silicon wafers	any		ideally 1cm2 pre-cut
Spin-coater	SPS Europe	SPIN150i-NPP
Syringe filter 0,45 µm	Th Geyer	Labsolute 7699803	For smaller samples; larger versions exist for larger sample volumes
ToF-SIMS	IONTOF GmbH	ToF-SIMS IV or V, equipped with Bi LMIG and flood gun
Tweezers for handling Si wafers	any
ultrapure water	TKA	MicroPure 08.1202
Ultrasonicator	Bandelin	Sonorex Super
UV/Ozone cleaner	NanoBioAnalytics	UVC-1014
Vacuum dessicator	any
Vacuum pump (membrane/diaphragm)	Vacuubrand GmbH	Type MD-4T
Viton O-ring 6.07 x 1.78 mm	Betech GmbH	2-010, FKM 80
Vortexer	Heathrow Scientific	Vortexer HS120212
Wafer Holder 25mm coin style	Semiconductor Production Systems Europe	eWB0091-ASSY-1
XPS	Kratos	Kratos Axis Ultra DLD