Applicazione del rilevamento delle impronte digitali del DNA utilizzando il locus D1S80 nelle classi di laboratorio

Riepilogo

Qui descriviamo un semplice protocollo per generare profili di impronte digitali del DNA amplificando il locus D1S80 VNTR dal DNA delle cellule epiteliali.

Abstract

Nelle scienze biologiche, il rilevamento delle impronte digitali del DNA è stato ampiamente utilizzato per test di paternità, applicazioni forensi e studi filogenetici. Qui descriviamo un metodo affidabile e robusto per genotipizzazione degli individui mediante analisi VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) nel contesto di classi di laboratorio universitarie. Il locus VNTR D1S80 umano è usato in questo protocollo come marcatore altamente polimorfico basato sulla variazione del numero di sequenze ripetitive.

Questo semplice protocollo trasmette informazioni utili per gli insegnanti e l'implementazione del rilevamento delle impronte digitali del DNA in lezioni pratiche di laboratorio. Nell'esercizio di laboratorio presentato, l'estrazione del DNA seguita dall'amplificazione PCR viene utilizzata per determinare la variazione genetica nel locus VNTR D1S80. Le differenze nella dimensione dei frammenti dei prodotti PCR sono visualizzate dall'elettroforesi del gel di agarosio. Le dimensioni dei frammenti e i numeri di ripetizione sono calcolati in base a una regressione lineare della dimensione e della distanza di migrazione di uno standard di dimensione del DNA.

Seguendo questa guida, gli studenti dovrebbero essere in grado di:

• Raccogliere ed estrarre DNA dalle cellule epiteliali della mucosa buccale
• Eseguire un esperimento PCR e comprendere la funzione di vari componenti di reazione
• Analizzare gli ampliconi per elettroforesi del gel di agarosio e interpretare i risultati
• Comprendere l'uso dei VNTR nel fingerprinting del DNA e la sua applicazione nelle scienze biologiche

Introduzione

Il rilevamento delle impronte digitali molecolari, noto anche come fingerprinting del DNA, è stato introdotto da Sir Alec Jeffreys mentre lavorava nel Dipartimento di Genetica dell'Università di Leicester nel 1984¹. Si basa sullo 0,1% del genoma umano che differisce tra gli individui ed è composto da circa tre milioni di varianti. Queste differenze uniche nel genotipo consentono la differenziazione tra gli individui e possono quindi funzionare come un'impronta genetica ad eccezione dei gemelli monozigotici. Di conseguenza, il rilevamento delle impronte digitali del DNA viene utilizzato per la stima della relazione di diversi individui che viene applicata, ad esempio, nei test di paternità o negli studi sulla diversità della popolazione. Nelle nostre lezioni di laboratorio abbiamo mirato a trasmettere il concetto di fingerprinting del DNA e frequenze alleliche. Il metodo qui descritto dimostra un metodo affidabile e robusto per il rilevamento delle impronte genetiche analizzando il numero variabile di ripetizioni tandem (VNTR) nel locus D1S80. Il metodo comprende l'estrazione del DNA dalle cellule epiteliali della mucosa buccale e la successiva reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare il locus D1S80, seguita dalla visualizzazione delle differenze di lunghezza dei frammenti su un gel di agarosio.

Il locus minisatellite VNTR D1S80 è altamente variabile e si trova nella regione telomerica del cromosoma 1 (1p36-p35). È stato identificato e descritto da Karsai e colleghi nel 1990 come un luogo con un'unità di ripetizione centrale di 16 bp, consentendo la separazione di alleli diversi da una sola unità². Inoltre, D1S80 mostra un alto grado di variazione con un tasso di mutazione di circa 7,77 x 10^-53. D1S80 ha un alto grado di eterozismo^4,5 (ad esempio, 80,8% eterozismo per caucasici⁶ e fino all'87% eterozismo per gli afroamericani⁷). Inoltre, il locus D1S80 è polimorfico nella maggior parte delle popolazioni, con tipicamente oltre 15 alleli diversi che trasportano da 14 a 41 ripetizioni ciascuno. La frequenza degli alleli D1S80 varia tra le popolazioni. L'allele con 24 unità ripetute (allele 24) è più frequente nelle popolazioni europee e asiatiche, mentre l'allele 21 è più comune nelle popolazioni^{africane 4,7,8,9,10}. Di conseguenza, le distribuzioni di frequenza allele sono diagnostiche per le diverse popolazioni umane e devono essere prese in considerazione per la stima della relativa (ad esempio, nei test di paternità). 

L'amplificazione basata su PCR del locus VNTR D1S80 è stato un metodo molto utile nelle scienze forensi, nei test di paternità, nell'analisi delle malattie e negli studi sulla^{diversità della popolazione 11,12,13,14}. Mentre in medicina legale oggi l'uso dei VNTR è stato sostituito da brevi ripetizioni in tandem, il locus VNTR D1S80 è ampiamente utilizzato nella determinazione delle origini e delle relazioni genetiche tra e^{tra le popolazioni 4,8,9,11}. Inoltre, viene spesso utilizzato per insegnare il rilevamento delle impronte digitali del DNA nelle esercitazioni^{pratiche di laboratorio 15,16}. Il metodo qui descritto rappresenta un metodo robusto, economico e facile da usare con un tasso di successo molto elevato nelle classi di laboratorio universitarie. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire una panoramica del flusso di lavoro per l'analisi molecolare del locus minisatellite D1S80 umano dalle cellule epiteliali della mucosa buccale. Comprende la dimostrazione di tecniche, protocolli semplificati e suggerimenti pratici descritti nei lavori^{precedentemente pubblicati 2,17}.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo deve essere utilizzato solo se studenti o rispettivi tutori legali hanno accettato la conduzione di questo protocollo poiché i profili genotipiche forniscono approfondimenti sulle relazioni genetiche. Il rilevamento delle impronte digitali del DNA è un metodo comune di biologia molecolare applicato principalmente agli studi sulla popolazione e alle questioni forensi. Pertanto, occorre prestare attenzione a mantenere i rischi di contaminazione il più bassi possibile. Per evitare la contaminazione del campione con DNA proveniente da una fonte esterna o da dna, i guanti devono essere indossati, gli strumenti devono essere accuratamente puliti o sterilizzati e le soluzioni devono essere sterilizzate con filtro o autoclavate prima dell'uso.

1. Raccolta di cellule epiteliali della mucosa buccale

ATTENZIONE: Il lavoro con la saliva e le cellule epiteliali può portare a una trasmissione di malattie infettive. Pertanto, dovrebbero essere applicate precauzioni standard e basate sulla trasmissione (ad esempio, l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale).

NOTA: Includere un controllo positivo, fornito dall'istruttore (ad esempio, DNA estratto dall'istruttore) e incluso nelle fasi di lavorazione a valle.

1. Attendere almeno 1 h dopo aver mangiato o lavato i denti prima della raccolta del campione.
2. Etichettare un tubo di microcentrifugo vuoto e sterile da 2,0 ml.
3. Rimuovere un tampone buccale sterile dalla confezione e strofinare vigorosamente all'interno della guancia per 30-40 volte o 30-40 secondi per raccogliere cellule epiteliali della mucosa buccale.
4. Posizionare la punta del tampone di raccolta nel tubo di microcentrifugo sterile precedentemente etichettato e rompere la lunghezza della plastica che si estende oltre il bordo, a mano o utilizzando forbici sterili.
5. Posizionare il cappuccio saldamente sul tubo, sigillando il tampone di raccolta all'interno.

2. Estrazione di DNA genomico da cellule umane

1. Prima dell'estrazione, impostare un miscelatore termico o un blocco riscaldante a 65 °C per lalisi del campione.
   ATTENZIONE: Alcune sostanze chimiche utilizzate sono classificate come pericolose. Leggere attentamente la scheda di dati di sicurezza e adottare le misure di sicurezza appropriate prima della manipolazione.
   1. Preparare e sterilizzare filtrando o autoclavando tutti i tamponi e le soluzioni richieste (soluzione di lisi, acetato di potassio da 8 M, 2-propanolo, 70% di etanolo e tampone di eluizione).
      NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione devono essere eseguite a temperatura ambiente (20-30 °C) se non specificato.
2. Aggiungere 500 μL di soluzione di lisi (50 mM Tris/HCl, pH 8.0; 10 mM di acido tetra-acetico di etilendiammina (EDTA); 2% di solfato di dodecil di sodio (SDS)) al tampone buccale, assicurandosi che il campione sia completamente immerso nella soluzione di lysis.
   1. Vortice vigorosamente per almeno 5 s.
   2. Incubare campioni a 65 °C in un miscelatore termico per 10 minuti.
   3. Mescolare il campione 3-4 volte con il vortice di impulsi per 5 s durante l'incubazione.
   4. Rimuovere il tampone dal tampone di lysis, premere il tampone contro l'interno del tubo per ottenere il massimo volume del campione.
3. Aggiungere 100 μL di acetato di potassio da 8 M alle cellule lisci.
   1. Mescolare accuratamente invertendo il tubo fino a quando non c'è un precipitato bianco.
   2. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Centrifugare il campione per 5 minuti a 18.000 x g.
5. Trasferire 450 μL del supernatante in un tubo di microcentrifugo pulito e sterile da 1,5 ml.
6. Aggiungere 450 μL di 2-propanolo e mescolare accuratamente invertendo il tubo (precipitazione del DNA).
7. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Centrifuga per 5 min a 18.000 x g.
9. Scartare il supernatante e invertire il tubo su un tovagliolo di carta pulito per asciugare il pellet ed evitare la contaminazione incrociata.
10. Incubare il DNA per 5 minuti a 65 °C in un blocco riscaldante per asciugare completamente il pellet.
11. Per lavare il DNA, aggiungere 500 μL di 70% di etanolo.
12. Centrifuga per 1 min a 18.000 x g.
13. Scartare il supernatante e invertire il tubo su un tovagliolo di carta pulito per asciugare il pellet.
14. Aggiungere 30 μL di tampone di resuspensione (10 mM Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) al pellet.
15. Incubare il DNA per 10 minuti a 65 °C in un blocco riscaldante per inattivare le DNasi.

3. Amplificare il locus VNTR D1S80 utilizzando PCR

NOTA: registrare il numero di campioni che verranno utilizzati e preparare un foglio di lavoro con i reagenti richiesti e i loro volumi prima di raccogliere le plastiche e gli altri materiali necessari. Etichettare i tubi sterili/strisce/piastre da utilizzare per la PCR con i numeri di campione. Ricordarsi di includere un controllo negativo utilizzando H₂O al posto del DNA e un controllo positivo (ad esempio, utilizzando il DNA fornito dall'istruttore) per convalidare la PCR.

1. Preparare la miscela master PCR 1x contenente 10 μL di tampone di reazione PCR 5x (contenente 15 mM MgCl₂), 1 μL di trifosfato di deossiribonucleotidi (dNTP) (10 mM), 5 μL (10 pmol) di ciascun primer pMCT118-f e pMCT118-r (avanti - 5'-GAAACTGGCCTCCAAACGCCCGCCG-3', inverso - 5'-GTCTTGTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3') secondo Kasai et al.², 23,8 μL di H₂O ultrapuro e 0,2 μL di Taq DNA polimerasi (5 U/μL).
   NOTA: I primer pMCT118-f/pMCT118-r sono stati progettati sulle regioni di fianco della regione VNTR D1S80 amplificando l'intero locus.
2. Etichettare i tubi/strisce/lastre PCR con i numeri di campione da utilizzare.
3. Aliquota 45 μL della miscela master a ciascun tubo campione PCR etichettato o bene.
4. Aggiungere 5 μL del modello di DNA alla miscela master in ogni tubo/piastra PCR per acquisire un volume totale di 50 μL. Cambiare la punta della pipetta per ogni campione di DNA per evitare la contaminazione incrociata.
5. Includere un controllo senza modello (NTC) utilizzando h₂O ultrapuro anziché DNA.
6. Chiudere tubi/strisce PCR o sigillare la piastra e mescolare.
7. Centrifugare i tubi/strisce/piastre PCR per 20 s utilizzando una centrifuga da tavolo.
   NOTA: Le condizioni PCR fornite in questo protocollo sono state ottimizzate utilizzando la DNA polimerasi e il ciclore termico PCR utilizzato. In generale, le condizioni della PCR devono essere adattate alla DNA polimerasi. Il tempo di estensione standard per una DNA polimerasi Taq è di 1 min/kb.
8. Posizionare i tubi/strisce/piastre del campione nel termociclo e incubare le reazioni utilizzando le seguenti condizioni (tempo di estensione della DNA polimerasi): 1 ciclo di 95 °C per 2 min; 25 cicli di 94 °C per 15 s, 60 °C per 15 s, 72 °C per 30 s; 1 ciclo di 72 °C per 10 min.
9. Al termine del programma, rimuovere i prodotti dal termociclo e conservare a 4 °C durante la notte o -20 °C fino all'elettroforesi.

4. Elettroforesi a gel di agarosio dei prodotti PCR

1. Preparare un gel di agarosio all'1,5%.
   1. Utilizzare 1,5 g di polvere di agarosio e mescolarla con 100 ml di soluzione tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) in un pallone.
   2. Scaldare la miscela per circa 1,5-2 minuti in un forno a microonde (600 W). Ruotare di nuovo il contenuto e riscaldare di nuovo, se necessario, per sciogliere completamente l'agarosio. Raffreddare leggermente e aggiungere 2 μL di PeqGreen all'agarosio.
   3. Versare il gel in una forma usando un pettine con abbastanza pozzi per tutti i campioni e aggiungere almeno un marcatore di peso molecolare.
      ATTENZIONE: Può verificarsi un ritardo dell'ebollizione. Agitare attentamente il pallone quando si rimospensione dell'agarosio che non è ancora stato sciolto.
      NOTA: PeqGreen è un colorante non tossico per l'individuazione di acidi nucleici. È applicabile per la colorazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) e del DNA a singolo filamento (ssDNA) e dell'RNA. La sensibilità è paragonabile al bromuro di etidio.
2. Rimuovere i prodotti PCR da 4 °C e centrifugare per circa 10 s.
3. Caricare i pozzi del gel con un campione di 10 μL. Non sovraccaricare il gel.
   NOTA: Il tampone di DNA polimerasi include anche composti che aumentano la densità del campione in modo che i campioni possano essere caricati direttamente sui gel senza la necessità di un colorante di carico. Ciò consente al campione di affondare nel pozzo e i coloranti aiutano a tracciare fino a che punto il campione di DNA è migrato.
   1. Aggiungere uno standard di peso molecolare ai pozzi di fianco (preferibilmente uno standard di peso molecolare di 50 bp).
      NOTA: Conservare i campioni residui di PCR a -20 °C nel caso in cui l'elettroforesi del gel di agarosio zione deve essere ripetuta.
4. Eseguire il gel in 1x TAE running buffer a 150 V (costante) per circa 40 min o fino a quando il fronte di tintura giallo inferiore che viaggia a circa 50 bp raggiunge l'estremità inferiore del gel.
5. Immagini il gel mentre viene applicata la luce blu o ultravioletta (UV) e registra un'immagine per l'analisi della lunghezza dei frammenti.
   ATTENZIONE: La luce UV può danneggiare gli occhi e la pelle. Indossare sempre indumenti protettivi e occhiali di sicurezza UV quando si utilizza una scatola luminosa UV.
6. Smaltire il gel in conformità con la politica istituzionale sui materiali pericolosi.

5. Analisi dei risultati della lunghezza dei frammenti

NOTA: utilizzate l'analisi di regressione lineare per stimare le lunghezze dei frammenti.

1. Per dimensionare i frammenti PCR D1S80, posizionare un righello sulla fotografia in gel sulla corsia standard del peso molecolare di 50 bp in modo che la parte superiore del righello si allieta verso l'alto con la parte inferiore del pozzo in cui è stato caricato il campione (Figura 1).
   NOTA: Per calcolare l'equazione di regressione lineare per lo standard di peso molecolare (standard di peso molecolare di 50 bp) è stato utilizzato un programma di fogli di calcolo.
2. Registrare la distanza dal pozzo (ad esempio, in cm) per ogni banda dello standard di peso molecolare di 50 bp in una tabella utilizzando un programma di fogli di calcolo (Figura 2).
3. Determinare il log (ad esempio, base 10) di ogni dimensione del frammento dello standard di peso molecolare di 50 bp e immettere i valori di log nella tabella (Figura 2).
4. Tracciare ogni punto dati in un grafico con il registro delle dimensioni della banda sull'asse verticale (asse y) e la distanza di corsa misurata dalla parte superiore del gel a ciascuna banda dello standard di peso molecolare sull'asse orizzontale (asse x) utilizzando uno scatterplot (Figura 3).
5. Adattare una linea di tendenza (linea di regressione lineare) e mostrare l'equazione di regressione (y = ax + b) e il valore R² sul grafico (Figura 4).
6. Misurare la distanza migrata (ad esempio, in cm) per ogni amplicon D1S80 (Figura 5).
7. Stimare la dimensione di ogni amplicon D1S80 usando l'equazione di regressione: y = ax + b
   dove y = il registro della dimensione del frammento
   a = la pendenza della linea (calcolata al punto 5)
   x = la distanza dal pozzo (in cm)
   b = il punto in cui la linea di regressione intercetta l'asse y (calcolato al punto 5)
   NOTA: Poiché il valore y rappresenta il log della dimensione del frammento, è necessario calcolare l'antilogo^{(10 y}) per ottenere la dimensione del frammento in bp degli ampliconi D1S80.

6. Stima del numero di unità ripetute negli alleli degli individui testati

NOTA: L'unità di ripetizione D1S80 è lunga 16 bp. Il più piccolo allele conosciuto per D1S80 ha 14 ripetizioni. Lo schema di amplicon qui descritto produce ampliconi con regioni di fianco che sommano altri 145 bp alla dimensione finale.

1. Utilizzare la tabella 1 per stimare il numero di unità ripetute contenute in ogni frammento PCR. La dimensione estrapolata utilizzando la regressione lineare deve essere entro 8 bp da un particolare allele.
2. Registrare il genotipo di ogni individuo testato come combinazione di numeri di dimensione di ripetizione allele.

Risultati

Utilizzando il protocollo descritto, l'analisi marcatore VNTR D1S80 è stata eseguita sul DNA genomico umano estratto dalle cellule epiteliali della mucosa buccale raccolte mediante campionamento di tampone (Figura 6). Dopo l'amplificazione mediante PCR, nella figura 1è illustrata una rappresentazione tipica di un gel di agarosio contenente gli ampliconi D1S80 . La corsia 1 mostra lo standard di peso molecolare di 50 bp. Accanto allo standard del peso molecolare, vengono visualizzati i prodotti PCR di otto campioni di studenti. La corsia 10 mostra l'NTC in cui è stata utilizzata l'acqua al posto del DNA modello. La maggior parte dei campioni analizzati mostra chiaramente due bande, che rappresentano individui eterozigoti per il locus D1S80. Lane 2 e Lane 9 mostrano una singola band che rappresenta individui omozigoti per il locus D1S80. La Corsia 5 mostra una band ambigua che è molto più ampia rispetto alle altre band. Questo potrebbe essere il risultato di due alleli D1S80 che differiscono in una sola unità di ripetizione. Per ulteriori analisi, il campione nella corsia 5 sarà considerato come una singola banda, che rappresenta un individuo omozigoto.

L'analisi dei frammenti di elettroforesi a valle del gel eseguita su prodotti PCR verificati è stata utilizzata per la chiamata di dimensioni del locus VNTR D1S80 di diversi campioni di studenti. L'interpretazione delle dimensioni dell'amplicon ottenuto dall'analisi PCR si basa sullo standard di peso molecolare utilizzato. La distanza dal pozzo per ciascuna banda dello standard di peso molecolare è stata misurata(figura 1)e registrata(figura 2). In base alle dimensioni e alla distanza di migrazione, la dimensione delle singole bande può essere calcolata utilizzando un'analisi di regressione lineare. Il registro (base 10) è stato determinato per ogni banda nei campioni degli studenti (Figura 5) e il rispettivo antilogo rappresenta il numero di bp per ogni amplicon. Il numero di unità ripetute può essere calcolato in base alla dimensione dell'amplicon ottenuto(tabella 2).

Per ogni campione di studente le dimensioni dell'amplicon sono state calcolate mediante regressione lineare e ogni banda potrebbe essere facilmente assegnata a un particolare allele, come mostrato nella tabella 2. Le informazioni sulle dimensioni dell'allele D1S80 possono quindi essere utilizzate per determinare le frequenze alleliche tra il piccolo sottoinsieme di popolazione degli studenti universitari. L'allele a ripetizione 28 è il più frequente tra gli studenti a causa di due individui omozigoti per questo allele ripetuto (individui 1 e 4). Il secondo allele più frequente è l'allele a 18 ripetizioni, che viene trasportato dall'individuo omozigoto 8 e dall'individuo eterozigote 6. Gli alleli a bassa frequenza sono gli alleli a ripetizione 21, 26 e 30 che si trovano solo una volta negli individui 6, 5 e 3, rispettivamente. I modelli di frequenza allele del locus VNTR D1S80 della piccola popolazione studentesca possono essere ulteriormente confrontati con la frequenza allele di popolazioni umane più grandi, ad esempio popolazioni provenienti da diversi continenti^4,7,8,9,10.

Tra gli studenti, gli individui 2 e 3 condividono l'allele a ripetizione 24, gli individui 2 e 7 condividono l'allele a ripetizione 20 e gli individui 5 e 7 condividono l'allele a 23 ripetizioni. È interessante notare che i due individui omozigoti D1S80 (individuali 1 e 4) condividono l'allele a ripetizione 28. La corrispondenza degli alleli tra due individui può indicare una potenziale relazione. Tuttavia, gli alleli condivisi possono anche verificarsi per caso. Pertanto, è fondamentale determinare la probabilità di una corrispondenza allele tra due individui. La probabilità dipende dalla frequenza allele dei singoli alleli nella popolazione generale e dovrebbero essere utilizzati approcci statistici per attribuire un peso statistico all'analisi marcatore VNTR come l'approccio bayesiano. In sintesi, il metodo di rilevamento delle impronte digitali presentato può essere utilizzato in pratici per insegnare l'uso dei VNTR nel fingerprinting del DNA e la sua applicazione nelle scienze biologiche.

Figura 1: Rappresentazione di un gel di agarosio dopo elettroforesi dei prodotti di amplificazione D1S80 con un righello posto accanto alla corsia standard del peso molecolare di 50 bp. La corsia 1 contiene lo standard di peso molecolare da 50 bp, mentre le corsie 2-9 contengono prodotti di reazione PCR. La corsia 10 contiene il controllo NTC (No Template Control). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Determinazione della distanza di migrazione dei frammenti di DNA e del registro di ogni dimensione del frammento dello standard di peso molecolare di 50 bp. Viene registrata la distanza dal pozzo (in cm) per ogni banda dello standard di peso molecolare di 50 bp e viene determinato il log (base 10) per ogni frammento. I valori vengono immessi in una tabella utilizzando un programma foglio di calcolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Grafico a dispersione generato tracciando la distanza di migrazione dei frammenti di DNA dello standard di peso molecolare sull'asse x rispetto al tronco (base 10) della dimensione di ogni frammento sull'asse y. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sfruttamento della linea di regressione lineare e dell'equazione di regressione, nonché del valore R² per i dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figura 5: Determinazione delle dimensioni degli ampliconi D1S80. La distanza dal pozzo per ogni frammento viene inserita nell'equazione di regressione. L'antilogo del valore y rappresenta la dimensione del frammento in bp. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Sequenza temporale e flusso di lavoro suggeriti per l'analisi VNTR D1S80. L'intera procedura di analisi VNTR D1S80 qui presentata, dalla raccolta delle cellule epiteliali buccali alla valutazione della lunghezza dei frammenti, può essere completata entro un solo giorno lavorativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dimensioni allele (in bp)	Numero di ripetizioni
369	14
385	15
401	16
417	17
433	18
449	19
465	20
481	21
497	22
513	23
529	24
545	25
561	26
577	27
593	28
609	29
625	30
641	31
657	32
673	33
689	34
705	35
721	36
737	37
753	38
769	39
785	40
801	41

Tabella 1: Dimensione amplicon per ogni locus VNTR D1S80.

individuo	allele	Distanza (in cm)	Dimensioni (in bp)	Numero di unità ripetute
1	omozigote	5	600	28
2	eterozigote	5.2 ; 5.5	535, 458	24, 20
3	eterozigote	4.9 ; 5.2	626, 535	30, 24
4	omozigote	5	600	28
5	eterozigote	5.1 ; 5.3	564, 508	26, 23
6	eterozigote	5.4 ; 5.6	483, 435	21, 18
7	eterozigote	5.3 ; 5.5	508, 458	23, 20
8	omozigote	5.6	435	18

Tabella 2: Composizione allele dei diversi individui testati. Il numero di unità ripetute può essere approssimato in base alla dimensione dell'amplicon ottenuta dall'analisi di regressione lineare.

Discussione

Qui abbiamo descritto un metodo semplice ed economico per implementare il rilevamento delle impronte digitali molecolari nelle classi pratiche universitarie.

Per migliorare la variazione genetica nel locus D1S80, è necessaria la raccolta di campioni biologici umani insieme all'estrazione e all'analisi del DNA. È essenziale che l'uso etico degli esemplari biologici umani sia garantito durante l'intero processo. La gestione dei campioni è controllata all'interno di un quadro normativo completo che garantisce il corretto utilizzo dei campioni e dei^{dati associati 18} (ad esempio, il consenso per l'uso di materiale biologico umano). I partecipanti devono essere adeguatamente informati sull'uso dei loro campioni, sul rischio di scoperta di anomalie nelle relazioni genetiche (ad esempio, per individui correlati), sulla protezione della privacy e sulle intenzioni per la futura conservazione dei campioni e dei dati biologici. Tutti i donatori (studenti o colleghi) devono dare liberamente il consenso e comprendere il diritto di recedere senza fornire alcuna motivazione. In generale, è indispensabile familiarizzare con le rispettive linee guida e normative per la gestione dei campioni umani prima di condurre questa lezione di laboratorio.

Per la raccolta di cellule epiteliali della mucosa buccale in corsi di laboratorio universitari, occorre fare attenzione ad evitare la contaminazione dei campioni di DNA con DNA dell'operatore o con la DNA. Si raccomanda di utilizzare sempre cappotti da laboratorio, guanti e occhiali protettivi, nonché tamponi sterili e tubi a microcentrifugo. La raccolta cellulare a base di tampone buccal è considerata un metodo conveniente ed economico per la raccolta di materiale genetico adatto per l'analisi VNTR basata su PCR, in quanto è relativamente economico e non invasivo. Oltre ai tamponi buccali, la saliva è il metodo di campionamento orale più comune per la ricerca medica. È stato dimostrato che i tamponi buccali contengono una percentuale più elevata di cellule epiteliali rispetto alla saliva, rendendole più affidabili nel fornire quantità e qualità sufficienti di DNA per l'analisi VNTR D1S80 basata su PCR^19,20. Inoltre, i tamponi buccali possono essere spedito dopo l'auto-raccolta superando gli impedimenti geografici quando vengono utilizzati, ad esempio, negli studi sulla diversità della popolazione²¹.

L'estrazione del DNA è diventata relativamente facile grazie allo sviluppo di kit di estrazione da diverse aziende. Tuttavia, l'uso di tali kit potrebbe non essere adatto nelle classi di laboratorio a causa delle limitate risorse finanziarie. Qui, abbiamo presentato un metodo facile, veloce ed economico per l'estrazione del DNA da campioni umani senza la necessità di un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio. Il metodo di estrazione del DNA descritto non utilizza solventi organici, ma le proteine cellulari vengono rimosse aumentando la concentrazione di sale utilizzando una soluzione di acetato di potassio da 8 M. Questo metodo consente anche la manipolazione di più campioni contemporaneamente e produce DNA sufficiente per diverse analisi genotipiche per ciascun campione.

La PCR è una tecnica comune in molti laboratori molecolari. Sebbene generalmente senza problemi, ci sono insidie che possono complicare la reazione producendo risultati spuri, che sono stati discussi altrove²². Le condizioni PCR presentate qui sono apparse molto robuste di fronte alla scarsa qualità del DNA del modello, ma la mancanza di amplificazione PCR è stata comunque osservata occasionalmente quando si utilizzano modelli con concentrazioni di DNA estremamente basse a causa della scarsa raccolta di cellule epiteliali buccali. I primer del DNA utilizzati in questo studio possono essere ordinati da diverse aziende, come quelle citate nella tabella dei materiali alla fine di questo articolo. Particolare attenzione deve essere presa quando si lavora con primer di DNA al fine di evitare la contaminazione con DNA o DNA da parte dell'operatore. Anche i prodotti PCR devono essere mantenuti freddi quando non sono in uso.

Un altro passo critico è l'elettroforesi del gel di agarosio. Frammenti diversi da una sola unità di ripetizione di 16 bp non possono essere separati nell'elettroforesi del gel e quindi apparire come una singola banda. In questo caso, non è possibile garantire una corretta determinazione del numero di unità ripetute degli alleli D1S80 testati. Pertanto, il tempo di esecuzione del gel deve essere aumentato mentre la tensione deve essere ridotta e la concentrazione di gel può essere aumentata per fornire una migliore risoluzione e separazione delle singole bande.

Vale la pena ricordare che non tutti gli alleli per un locus VNTR contengono unità di ripetizione complete. Gli alleli non consensuali (microvarianti) che contengono unità ripetute incomplete sono comuni al massimo loci VNTR e le loro dimensioni si trovano tra le dimensioni degli alleli con unità di ripetizione complete. Questi microvarianti sono a malapena rilevabili dall'elettroforesi del gel di agarosio. Al contrario, tecniche come i gel di poliacrilammide o l'elettroforesi capillare possono risolvere alleli che differiscono da una a poche unità ripetute o microvarianti^{12,23,24,25,26}. Tuttavia, queste ultime tecniche sono meno adatte per le classi di laboratorio universitarie in quanto hanno molti svantaggi tra cui l'uso di composti pericolosi, la preparazione complessa e la mancanza di attrezzature. Per la determinazione delle dimensioni dei frammenti, è necessario prestare particolare attenzione quando si misura la distanza dei frammenti di DNA migrati. Se le bande sono troppo diffuse per essere misurate con precisione, il calcolo della dimensione del frammento di allele D1S80 per regressione lineare potrebbe non essere corretto, con conseguente stima errata dei numeri unitari ripetuti. In tal caso è consigliabile una ri-esecuzione dell'elettroforesi del gel di agarosio dopo aver ottimizzato le condizioni del gel, come precedentemente descritto da Lorenz e dai colleghi²².

L'intera procedura di analisi VNTR D1S80 qui presentata, dalla raccolta delle cellule epiteliali buccali alla valutazione della lunghezza dei frammenti, può essere completata in un unico giorno lavorativo. Questo protocollo è un metodo robusto, economico e facile da usare adatto per lezioni di laboratorio pratiche universitarie.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt	72,706	autoclaved
2 mL microcentrifuge tube	Sarstedt	7,26,95,500	autoclaved
2-propanol	Fisher chemical	PI7508/17
5x PCR buffer	Promega	M7845
Acetic acid	Sigma/Merck	A6283-500ML
Agarose	BioBudget	10-35-1020
Buccal swabs	BioBudget	57-BS-05-600
Centrifuge	Eppendorf		5430
Combs	BioRad
dNTPs (10 mM)	Invitrogen	R0192
EDTA	Carl Roth	8043.1
Ethanol	Honeywell	32221-2.5L
Gel caster	BioRad
Gel chamber	BioRad		SubCell GT
Gel Doc XR+	BioRad
Geltray	BioRad		SubCell GT
GeneRuler 50 bp DNA Ladder	Thermo Fisher	SM0371
Go-Taq Polymerase	Promega	M7845
Heating block	Eppendorf	Thermomixer	1.5 mL and 2 mL
Microwave	Sharp		R-941STW
peqGreen	VWR	732-3196
Pipettes	Gilson		1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL
Potassium acetate	Arcos Organics	217100010
PowerPac power supply	BioRad		100-120/220-240V
Primers	Sigma/Merck
Scale	Kern		PCB 2.5 kg
SDS	Arcos Organics	218591000
Shaker	IKA labortechnik		IKA RH basic
Tabletop centrifuge	myFuge
Thermal Cycler	BioRad		C100 Touch
Tris	VWR	103156x
Vortex mixer	LMS		VTX-3000L