Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

Riepilogo

L'interazione di un rimodellatore di cromatina ATP-dipendente con un ligando del DNA è descritta utilizzando la spettroscopia CD. I cambiamenti conformazionali indotti su un promotore genico analizzato dai picchi generati possono essere utilizzati per comprendere il meccanismo della regolazione trascrizionale.

Abstract

La spettroscopia del dicroismo circolare (CD) è un metodo semplice e conveniente per studiare la struttura secondaria e le interazioni delle biomolecole. I recenti progressi nella spettroscopia CD hanno permesso lo studio delle interazioni DNA-proteina e delle dinamiche conformazionali del DNA in diversi microambienti in dettaglio per una migliore comprensione della regolazione trascrizionale in vivo. L'area intorno a una potenziale zona di trascrizione deve essere srotolata affinché si verifichi la trascrizione. Questo è un processo complesso che richiede il coordinamento delle modificazioni istoniche, il legame del fattore di trascrizione al DNA e altre attività di rimodellamento della cromatina. Utilizzando la spettroscopia CD, è possibile studiare i cambiamenti conformazionali nella regione del promotore causati da proteine regolatrici, come i rimodellatori di cromatina ATP-dipendenti, per promuovere la trascrizione. Anche i cambiamenti conformazionali che si verificano nella proteina possono essere monitorati. Inoltre, le domande riguardanti l'affinità della proteina verso il suo DNA bersaglio e la specificità della sequenza possono essere affrontate incorporando mutazioni nel DNA bersaglio. In breve, la comprensione unica di questo metodo sensibile e poco costoso può prevedere i cambiamenti nella dinamica della cromatina, migliorando così la comprensione della regolazione trascrizionale.

Introduzione

Il dicroismo circolare (CD) è una tecnica spettroscopica che si basa sulla chiralità intrinseca delle macromolecole biologiche che porta all'assorbimento differenziale della luce polarizzata circolarmente destrorsa e mancina. Questo assorbimento differenziale è noto come dicroismo circolare. La tecnica, quindi, può essere utilizzata per delineare la conformazione di macromolecole biologiche, come proteine e DNA, che contengono entrambi centri ^chirali1,2.

Le onde elettromagnetiche contengono componenti sia elettrici che magnetici. Sia il campo elettrico che quello magnetico oscillano perpendicolarmente alla direzione di propagazione dell'onda. Nel caso della luce non polarizzata, questi campi oscillano in molte direzioni. Quando la luce è polarizzata circolarmente, si ottengono due campi elettromagnetici a 90° di differenza di fase l'uno dall'altro. Le molecole chirali mostrano una rotazione ottica circolare (birifrangenza) tale da assorbire la luce polarizzata circolarmente destrorsa e la luce polarizzata circolarmente mancina in misura ^diversa3. Il campo elettrico risultante sarà tracciato come un'ellisse, una funzione della lunghezza d'onda. Lo spettro CD è, quindi, registrato come ellitticità (q), e i dati sono presentati come Ellitticità media residuo in funzione della lunghezza d'onda.

Nel caso delle proteine, la Cα degli amminoacidi (eccetto la glicina) è chirale, e questo viene sfruttato dalla spettroscopia CD per determinare la struttura secondaria di questa macromolecola4. Gli spettri CD delle molecole proteiche sono tipicamente registrati nell'intervallo Far UV. α-elicoidali hanno due bande negative a 222 nm e 208 nm e un picco positivo a 193 ^nm4. Le proteine con struttura secondaria anti-parallelo β-foglio mostrano un picco negativo a 218 nm e un picco positivo a 195 ^nm4. Le proteine con strutture disordinate mostrano una bassa ellitticità vicino a 210 nm e un picco negativo a 195 ^nm4. Pertanto, i picchi / bande ben definiti per diverse strutture secondarie rendono il CD uno strumento conveniente per chiarire i cambiamenti conformazionali che si verificano nella struttura secondaria delle proteine durante la denaturazione e il legame del ligando.

Gli acidi nucleici hanno tre fonti di chiralità: la molecola di zucchero, l'elicità della struttura secondaria e l'ordinamento terziario a lungo raggio del DNA ^{nell'ambiente5,6}. Gli spettri CD degli acidi nucleici sono tipicamente registrati nell'intervallo da 190 a 300 ^nm5,6. Ogni conformazione del DNA, proprio come le proteine, fornisce uno spettro caratteristico, anche se i picchi/bande possono variare di alcuni gradi a causa delle condizioni del solvente e delle differenze nelle sequenze di ^DNA7. Il B-DNA, la forma più comune, è caratterizzato da un picco positivo intorno a 260-280 nm e un picco negativo intorno a 245 ^nm6. I picchi/bande del DNA di forma B sono generalmente piccoli perché le coppie di basi sono perpendicolari alla doppia elica, conferendo debole chiralità alla molecola. A-DNA dà un picco positivo dominante a 260 nm e un picco negativo intorno a 210 ^nm6. Z-DNA, l'elica mancina, dà una banda negativa a 290 nm e un picco positivo intorno a 260 ^nm6. Questo DNA dà anche un picco estremamente negativo a 205 ^nm6.

Oltre a queste conformazioni, il DNA può anche formare triplex, quadruplex e forcine, che possono essere distinte dalla spettroscopia CD. Il parallelo G-quadruplex dà una banda positiva dominante a 260 nm, mentre l'anti-parallelo G-quadruplex dà una banda negativa a 260 nm e un picco positivo a 290 nm, rendendo facile distinguere tra le due forme di strutture ^quadruplex6. I triplex non danno uno spettro ^{caratteristico8}. Ad esempio, gli spettri di un DNA lungo 36 nucleotidi con il potenziale di formare una tripla elica intramolecolare contenente coppie di basi G.G.C e T.A.T in presenza di Na⁺ mostrano una forte banda negativa a 240 nm e un ampio picco positivo. L'ampio picco positivo mostra contributi a 266, 273 e 286 nm. Lo stesso oligonucleotide in presenza di Na⁺ e Zn⁺ mostra quattro bande negative (213, 238, 266 e 282 nm) e un picco positivo a 258 nm. Pertanto, gli spettri del DNA triplex possono variare a seconda delle condizioni del ^sale8.

Oltre a queste conformazioni, gli spettri CD hanno permesso l'identificazione di un'altra forma di DNA chiamata X-DNA. X-DNA si forma quando la sequenza di DNA contiene residui alternativi di adenina e timina. Gli spettri CD di X-DNA contengono due picchi negativi a 250 e 280 nm. Sono disponibili pochissime informazioni su X-DNA, anche se è stato ipotizzato che funzioni come un pozzo per il supercoiling ^positivo6,9. I cambiamenti negli spettri CD possono anche rivelare dettagli sulle interazioni ligando-proteina e, quindi, sono stati aggiunti all'arsenale di metodi molecolari per rilevare le interazioni farmaco-proteina10,11,12,13,14. Gli spettri CD sono stati utilizzati anche per monitorare i cambiamenti nella struttura secondaria delle proteine durante il processo di ripiegamento15. Allo stesso modo, gli spettri CD possono essere utilizzati anche per sondare le interazioni ligando-DNA16,17.

La spettroscopia CD, quindi, è un metodo facile ed economico per distinguere tra le diverse forme di conformazione del DNA, a condizione che vi sia accesso ad apparecchiature e software non così economici. Il metodo è estremamente sensibile e veloce. Richiede solo una piccola quantità di DNA, dandogli un vantaggio rispetto alla tecnica alternativa della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Anche le titolazioni con ligandi e substrati sono facili da eseguire. Il vincolo principale è che il DNA dovrebbe essere altamente puro. Si consiglia di utilizzare DNA purificato con elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE).

Le informazioni ottenute dagli spettri CD sono state utilizzate principalmente per dedurre le caratteristiche strutturali delle proteine e per identificare distinti conformisti del DNA. In questo studio, gli spettri CD sono stati utilizzati per integrare i risultati ottenuti da un esperimento in vivo di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per delineare se la proteina di interesse / fattore di trascrizione previsto può determinare un cambiamento conformazionale nella regione promotore dei suoi geni effettori. Questa collaborazione aiuta nel progresso delle tradizionali tecniche spettroscopiche CD prevedendo il meccanismo di regolazione della trascrizione da parte del fattore di trascrizione previsto su e intorno al sito di inizio della trascrizione (TSS) di un promotore.

Il rimodellamento della cromatina è un meccanismo ben definito noto per regolare i processi metabolici del DNA rendendo la cromatina strettamente imballata accessibile a vari fattori regolatori come fattori di trascrizione, componenti della replicazione del DNA o proteine di riparazione del danno. I rimodellatori di cromatina ATP-dipendenti, noti anche come famiglia di proteine SWI/SNF, sono proteine rimodellanti chiave presenti nelle cellule eucariotiche18,19. Il clustering filogenetico ha classificato la famiglia di proteine SWI/SNF in 6 ^{sottogruppi20}: Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like e distant. SMARCAL1, la proteina di interesse in questo studio, appartiene al sottogruppo ^distante20. Questa proteina è stata utilizzata per studiare la sua modalità di regolazione trascrizionale utilizzando la spettroscopia CD.

La maggior parte dei membri delle proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti hanno dimostrato di riposizionare o sfrattare i nucleosomi o mediare lo scambio di varianti istoniche in modo ATP-dipendente21,22. Tuttavia, alcuni membri di questa famiglia non hanno dimostrato di rimodellare i nucleosomi, ad esempio SMARCAL1. Anche se gli studi hanno dimostrato che SMARCAL1 si associa ai cromosomi politenici, mancano prove sperimentali riguardanti la sua capacità di rimodellare i ^nucleosomi23. Pertanto, è stato postulato che SMARCAL1 può regolare la trascrizione alterando la conformazione del ^DNA24. La spettroscopia CD ha fornito un metodo facile e accessibile per convalidare questa ipotesi.

SMARCAL1 è una proteina rimodellante della cromatina ATP-dipendente che funziona principalmente come elicasi ricottura25,26,27. È stato postulato per modulare la trascrizione rimodellando la conformazione del ^DNA24. Per verificare questa ipotesi, è stato studiato il ruolo di SMARCAL1 nella regolazione della trascrizione genica durante il danno al DNA indotto dalla doxorubicina. In questi studi, SMARCAL1 è stato utilizzato per l'analisi in vivo e ADAAD per i saggi in ^vitro28,29. Studi precedenti hanno dimostrato che l'ADAAD è in grado di riconoscere il DNA in modo struttura-dipendente ma indipendente dalla ^{sequenza30,31}. La proteina si lega in modo ottimale alle molecole di DNA che possiedono regioni di transizione a doppio filamento a singolo filamento, simili al DNA ad anello dello stelo, e idrolizza ATP ^30,31.

Esperimenti in vivo hanno dimostrato che SMARCAL1 regola l'espressione di MYC, DROSHA, DGCR8 e DICER legandosi alle regioni del ^{promotore28,29}. La regione di interazione è stata identificata dagli esperimenti ^ChIP28,29. La tecnica ChIP viene utilizzata per analizzare l'interazione di una proteina con il suo DNA affine all'interno della cellula. Il suo obiettivo è determinare se proteine specifiche, come i fattori di trascrizione sui promotori o altri siti di legame del DNA, sono legate a specifiche aree genomiche. La proteina legata al DNA viene prima reticolata usando la formaldeide. Questo è seguito dall'isolamento della cromatina. La cromatina isolata viene tranciata a frammenti di 500 bp mediante sonicazione o digestione della nucleasi e la proteina legata al DNA viene immunoprecipita utilizzando anticorpi specifici per la proteina. Il cross-linking viene invertito e il DNA viene analizzato utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) o la PCR quantitativa in tempo reale.

I risultati di ChIP hanno portato all'ipotesi che SMARCAL1 possa mediare la regolazione trascrizionale inducendo un cambiamento conformazionale nelle regioni promotrici di questi geni. Il mappatore QGRS e il software Mfold sono stati utilizzati per identificare il potenziale di queste regioni promotrici per formare strutture ^{secondarie28,29}. Il mappatore QGRS viene utilizzato per prevedere G-quadruplexes32, mentre ^Mfold33 analizza la capacità di una sequenza di formare strutture secondarie come gli stem-loop.

Dopo l'analisi della struttura secondaria, sono stati eseguiti ulteriori esperimenti in vitro con il recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain (ADAAD), l'omologo bovino di SMARCAL1, purificato da Escherichia ^coli34. I saggi ATPasi sono stati eseguiti utilizzando ADAAD per stabilire che le sequenze di DNA identificate potrebbero agire come ^{effettori28,29}. Infine, è stata eseguita la spettroscopia CD per monitorare i cambiamenti conformazionali indotti nella molecola di DNA da ADAAD28,29.

Per dimostrare che l'attività ATPasi della proteina era essenziale per indurre un cambiamento conformazionale nella molecola del DNA, è stato aggiunto acido tetraacetico etilendiammina (EDTA) al chelato Mg⁺² o ATPasi attiva DNA-dipendente A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), un inibitore specifico della proteina SWI/SNF35,36 . Questa tecnica spettroscopica CD può essere utilizzata con qualsiasi proteina purificata che è stata dimostrata da ChIP o qualsiasi altro test pertinente per legarsi a una regione genomica prevista di un promotore.

Protocollo

1. Concentrazione di lavoro dei componenti di reazione

1. Preparare nuovamente le concentrazioni di lavoro dei tamponi per CD e altri componenti di reazione (vedere Tabella 1) e mantenerle a 4 °C prima di impostare le reazioni.
   NOTA: Per le reazioni CD descritte in questo articolo, le concentrazioni di lavoro dei componenti sono le seguenti: tampone fosfato di sodio (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, proteina 1 μM, _MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. Attività atpasi

1. Prima della spettroscopia CD, stabilire l'attività ATPasi della proteina in presenza delle molecole di DNA per garantire che la proteina utilizzata nella spettroscopia CD sia attiva e per identificare le molecole di DNA che sono ottimamente efficaci nel provocare l'idrolisi dell'ATP.
2. Misurare l'attività ATPasi della proteina in presenza di diverse molecole di DNA mediante un saggio di ossidazione accoppiato a NADH costituito dalle seguenti due reazioni.
   1. Mescolare 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA e 1x buffer REG in una piastra a 96 pozzetti fino a un volume finale di 250 μL.
      NOTA: L'enzima piruvato chinasi utilizza l'ADP e il Pi per convertire il fosfoenolpiruvato in piruvato, rigenerando così l'ATP. Ciò garantisce che l'ATP sia sempre in concentrazione di saturazione nella reazione. Nella seconda reazione, il piruvato formato dall'azione della piruvato chinasi viene convertito dalla lattato deidrogenasi in lattato. In questa reazione, una molecola di NADH viene ossidata a NAD⁺. Il consumo di NADH viene misurato misurando l'assorbanza della molecola a 340 nm.
   2. Incubare per 30 minuti a 37 °C in un'incubatrice.
   3. Misurare la quantità di NAD⁺ a 340 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
   4. Per misurare la quantità di NAD⁺, utilizzare il software fornito insieme al lettore di micropiastre.
      1. Fare clic sul test NADH per misurare l'assorbanza a 340 nm.
      2. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul portatarga dello strumento. Fare clic sul pulsante Leggi piastra per registrare l'assorbanza.
         NOTA: La concentrazione di NAD⁺ viene calcolata utilizzando il coefficiente di estinzione molare di NADH come 6,3 mM⁻¹ utilizzando eq (1).
         A = εcl (1)
         
         Qui, A = Assorbanza
         ε = Coefficiente di estinzione molare
         c = Concentrazione molare
         l = Lunghezza percorso ottico in cm

3. Scelta e preparazione delle cuvette CD

1. Raccogli spettri CD in cuvette di quarzo ad alta trasparenza. Utilizzare cuvette rettangolari o cilindriche.
   NOTA: Una cuvetta di quarzo CD (volume nominale di 0,4 mL, lunghezza del percorso di 1 mm) è stata utilizzata per tutte le reazioni descritte in questo articolo.
2. Utilizzare una soluzione detergente per cuvette per pulire la cuvetta. Aggiungere la soluzione detergente per cuvette all'1% in acqua per ottenere 400 μL della soluzione, versarla nella cuvetta e incubarla a 37 °C per 1 ora.
3. Lavare la cuvetta con acqua più volte per pulire la cuvetta. Fai una scansione dell'acqua o del tampone nella cuvetta per verificare se è pulita.
   NOTA: l'acqua o il tampone devono fornire una lettura nell'intervallo da 0 a 1 mdeg.

4. Preparazione di proteine e DNA oligonucleotido

1. Mantenere il volume della proteina al di sotto di 50 μL nella reazione per ridurre al minimo le quantità dei componenti tampone che a volte causano la formazione di picchi ambigui. Mantieni la proteina sul ghiaccio durante l'esperimento per evitare qualsiasi degradazione.
2. Utilizzare oligonucleotidi di DNA purificati da PAGE nelle reazioni.
   NOTA: Nelle reazioni qui descritte, il DNA è stato utilizzato sia in forme native che raffreddate a caldo (raffreddato rapidamente (FC) e raffreddato lentamente (SC)). Il raffreddamento rapido promuove il legame intramolecolare nel DNA, producendo più strutture secondarie. Al contrario, il raffreddamento lento promuove il legame intermolecolare nel DNA, con conseguente minor numero di strutture secondarie.
3. Per un raffreddamento rapido, riscaldare il DNA a 94 °C per 3 minuti sul blocco riscaldante e raffreddarlo immediatamente sul ghiaccio. Per il raffreddamento lento, riscaldare il DNA a 94 °C per 3 minuti e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente ad una velocità di 1 °C al minuto.

5. Impostazione di esperimenti di controllo per registrare gli spettri di base

1. Mantenere il volume di reazione a 300 μL in tutte le reazioni. Impostare un totale di 5 reazioni basali in tubi centrifuga da 1,5 ml, uno per uno, come segue: i) Tampone + Acqua; ii) Tampone + _MgCl2 + ATP + Acqua; iii) Tampone + _MgCl2 + ATP + Proteine + Acqua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampone + Proteine + Acqua.

6. Impostazione degli esperimenti per registrare spettri di CD

1. Impostare un totale di 5 reazioni, una per una, in tubi centrifuga da 1,5 ml come segue: i) Tampone + DNA + Acqua; ii) Tampone + DNA + _MgCl2 + ATP + Acqua; iii) Tampone + DNA + _MgCl2 + ATP + Proteine + Acqua; iv) iii + EDTA o ADAADiN; v) Tampone + DNA + Proteine + Acqua.

7. Scansione della registrazione

1. Accendere il gas e accendere lo spettrometro CD.
2. Accendere la lampada dopo 10-15 min. Accendere il bagno d'acqua e impostare la temperatura del supporto a 37 °C.
3. Aprire il software dello spettro CD .
   1. Impostare la temperatura a 37 °C.
   2. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda su 180 - 300 nm.
   3. Impostare il tempo per punto su 0,5 s.
   4. Impostare il numero di scansione su 5.
   5. Fai clic su Pro-Data Viewer, crea un nuovo file e rinominalo con i dettagli sull'esperimento e sulla data.
4. Mantenere tutti i componenti di reazione sul ghiaccio per evitare qualsiasi degrado. Effettuare le linee di base e le reazioni, una per una, in tubi di centrifuga e mescolarle mediante pipettaggio. Trasferire accuratamente la miscela di reazione sulla cuvetta, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.
5. Se si esegue un esperimento a tempo, incubare le reazioni a 37 °C per il tempo richiesto e fare la scansione. Aggiungere EDTA al tampone contenente DNA, ATP, Mg ^{+ 2} e proteine per fermare l'idrolisi dell'ATP.
6. Aumentare la concentrazione di EDTA e il suo tempo di incubazione per inibire completamente l'attività dell'ATPasi.
7. Sottrarre le linee di base dalle reazioni corrispondenti nel software (ad esempio, sottrarre la reazione 1 dalla linea di base 1). Smussare i dati nel software dello spettro CD o nel software di stampa dei dati. Traccia i dati nel software di stampa dei dati.
   NOTA: Sottraendo le linee di base dalle reazioni corrispondenti si otterranno gli spettri NETTI CD del solo DNA.

8. Analisi e interpretazione dei dati

1. Utilizzare la formula data da eq (2) per convertire i valori ottenuti in millidegrees in ellitticità dei residui medi.
   (2)
   Qui, S è il segnale CD nei millidegrei, c è la concentrazione di DNA in mg / mL, mRw è la massa media dei residui e l è la lunghezza del percorso in cm.
2. Traccia un grafico contro la lunghezza d'onda e l'ellitticità media dei residui utilizzando il software di tracciamento dei dati e analizza i picchi.
3. Per tracciare il grafico, selezionare l'ellitticità media dei residui sull'asse Y e la lunghezza d'onda sull'asse X e tracciare un grafico a linee rette.
   NOTA: Questo grafico fornirà i picchi caratteristici delle diverse forme di DNA. Le forme di DNA corrispondenti ai picchi possono essere identificate utilizzando la letteratura ^esistente6.

Risultati

ADAAD stabilizza una struttura simile a un anello di stelo sul promotore MYC
Precedenti prove sperimentali hanno dimostrato che SMARCAL1 è un regolatore negativo di MYC29. L'analisi della regione del promotore lungo 159 bp del gene MYC da parte del mappatore QGRS ha mostrato che il filamento in avanti aveva il potenziale per formare un G-quadruplex (Tabella 2). Mfold ha mostrato che entrambi i filam...

Discussione

Lo scopo di questo articolo è quello di introdurre la tecnica di spettroscopia CD come approccio per studiare i cambiamenti conformazionali che si verificano nel DNA in presenza di proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti e per collegare questi cambiamenti conformazionali all'espressione genica. La spettroscopia CD fornisce un metodo veloce e facilmente accessibile per studiare i cambiamenti conformazionali nel DNA.

Un punto cruciale da considerare per questa tecnica è la...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Fisher scientific	O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigmaaldrich	A2383
CD Quartz Cuvette	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer	Applied Photophysics	Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate	SRL	43272
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution	Hellma	9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase	Sigmaaldrich	L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher scientific	BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher scientific	M33-500
NADH disodium salt	Sigmaaldrich	10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt	SRL	40083
Potassium Acetate	Fisher scientific	P178-3
Pyruvate Kinase	Sigmaaldrich	P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher scientific	S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT microplate reader	BioTek	Not available
Tris Base	Fisher scientific	BP152-500