Piattaforma di chip microfluidici clinici per l'isolamento di cellule tumorali circolanti versatili

Riepilogo

Il chip microfluidico clinico è un'importante tecnica di analisi biomedica che semplifica la pre-elaborazione del campione di sangue del paziente clinico e colora immunofluorescentmente le cellule tumorali circolanti (CTC) in situ sul chip, consentendo la rapida rilevazione e identificazione di un singolo CTC.

Abstract

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono significative nella prognosi del cancro, nella diagnosi e nella terapia antitumorale. L'enumerazione delle CTC è fondamentale per determinare la malattia del paziente poiché le CTC sono rare ed eterogenee. I CTC sono staccati dal tumore primario, entrano nel sistema di circolazione sanguigna e potenzialmente crescono in siti distanti, metastatizzando così il tumore. Poiché le CTC trasportano informazioni simili al tumore primario, l'isolamento delle CTC e la successiva caratterizzazione possono essere fondamentali nel monitoraggio e nella diagnosi del cancro. L'enumerazione, la modifica dell'affinità e la colorazione clinica con immunofluorescenza di CTC rari sono metodi potenti per l'isolamento delle CTC perché forniscono gli elementi necessari con alta sensibilità. I chip microfluidici offrono un metodo di biopsia liquida privo di qualsiasi dolore per i pazienti. In questo lavoro, presentiamo un elenco di protocolli per chip microfluidici clinici, una versatile piattaforma di isolamento CTC, che incorpora una serie di funzionalità e servizi necessari per la separazione, l'analisi e la diagnosi precoce dei CTC, facilitando così l'analisi biomolecolare e il trattamento del cancro. Il programma include il conteggio delle cellule tumorali rare, la pre-elaborazione clinica del sangue del paziente, che include la lisi dei globuli rossi, e l'isolamento e il riconoscimento delle CTC in situ su chip microfluidici. Il programma consente l'enumerazione precisa delle cellule tumorali o CTC. Inoltre, il programma include uno strumento che incorpora l'isolamento CTC con chip microfluidici versatili e l'identificazione dell'immunofluorescenza in situ sui chip, seguita dall'analisi biomolecolare.

Introduzione

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono significative nella prognosi del cancro, nella diagnosi e nella terapia antitumorale. L'enumerazione dei CTC è fondamentale poiché i CTC sono rari ed eterogenei. L'enumerazione, la modifica dell'affinità e la colorazione clinica con immunofluorescenza di CTC rare sono tecniche potenti per l'isolamento delle CTC perché offrono gli elementi necessari con alta sensibilità¹. Un numero raro di cellule tumorali mescolate con sangue normale imita da vicino il sangue reale del paziente poiché 2-3 ml di sangue reale del paziente contengono solo 1-10 CTC. Per risolvere un problema sperimentale critico, invece di utilizzare un gran numero di cellule tumorali introdotte nella PBS o mescolate con sangue normale, l'uso di un numero raro di cellule tumorali ci fornisce un basso numero di cellule del sangue, che è più vicino alla realtà quando si esegue un esperimento.

Il cancro è la principale causa di morte nel mondo². Le CTC sono cellule tumorali liberate dal tumore originale che circolano nel sangue e nei sistemi di circolazione linfatica³. Quando i CTC si spostano in un nuovo ambiente di sopravvivenza, crescono come un secondo tumore. Questo è chiamato metastasi ed è responsabile del 90% dei decessi nei pazienti oncologici⁴. I CTC sono vitali per la prognosi, la diagnosi precoce e per la comprensione dei meccanismi del cancro. Tuttavia, le CTC sono estremamente rare ed eterogenee nel sangue del paziente ^5,6.

I chip microfluidici offrono una biopsia liquida che non invade il tumore. Hanno il vantaggio di essere portatili, a basso costo e di avere una bilancia abbinata alle celle. L'isolamento delle CTC con chip microfluidici è classificato principalmente in due tipi: basato sull'affinità, che si basa sul legame antigene-anticorpo ^7,8,9 ed è il metodo originale e più utilizzato di isolamento dei CTC; e i chip fisici, che utilizzano differenze di dimensioni e deformabilità tra cellule tumorali e cellule del sangue 10,11,12,13,14,15^, sono privi di etichetta e sono facili da usare. Il vantaggio dei chip microfluidici rispetto alle tecniche alternative è che l'approccio basato sulla fisica dei microfiltri a grande ellisse cattura saldamente i CTC con un'elevata efficienza di cattura. La ragione di ciò è che i micropali di ellisse sono organizzati in sottili tunnel di spazi tra linee. Gli spazi tra linee sono diversi dai tradizionali spazi tra punti e punti formati da micropali come i micropali di rombo. L'acquisizione basata su chip wave dei CTC combina sia l'isolamento basato sulle proprietà fisiche che quello basato sull'affinità. L'acquisizione basata su chip d'onda coinvolge 30 array a forma di onda con l'anticorpo anti-EpCAM rivestito su micropali circolari. I CTC vengono catturati dai piccoli spazi vuoti e i grandi spazi vengono utilizzati per accelerare la portata. I CTC mancati devono superare i piccoli spazi vuoti nell'array successivo e vengono catturati dall'isolamento basato sull'affinità integrato all'interno del chip¹⁶.

L'obiettivo del protocollo è dimostrare il conteggio di un numero raro di cellule tumorali e l'analisi clinica di CTC con chip microfluidici. Il protocollo descrive le fasi di isolamento CTC, come ottenere un basso numero di cellule tumorali, la separazione fisica clinica dei filtri a piccola ellisse, dei filtri a grande ellisse e dei filtri trapezoidali, la modifica dell'affinità e l'arricchimento¹⁷.

Protocollo

I campioni di sangue dei pazienti sono stati forniti dall'ospedale Longhua affiliato alla Shanghai Medical University.Il protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana del terzo ospedale dell'Università di Pechino. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti per l'utilizzo dei campioni a fini di ricerca.

1. Pre-esperimento per verificare l'efficienza di cattura con cellule tumorali in coltura

1. Coltura delle cellule tumorali MCF-7, MDA-MB-231 e HeLa per determinare l'efficienza di cattura. Diluire la sospensione delle cellule tumorali, contare il numero di cellule tumorali e ripetere fino ad ottenere il numero desiderato di cellule in 1 mL di PBS.
   1. Coltura delle cellule in un pallone di coltura cellulare con un numero di cellule di partenza di ~ 1 x 10⁵ cellule in 1 mL di terreno di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10% e streptomicina penicillina-1%. Incubare in atmosfera umidificata a 37 °C con atmosfera al 5% di CO₂ .
   2. Quando le linee cellulari crescono come monostrati aderenti alla confluenza del 95%, staccarle dai piatti di coltura con una soluzione di tripsina allo 0,25% per 2 minuti come descritto in Chen et ^al.16.
   3. Macchiare le cellule tumorali con calceina AM. Mettere 3 μL di calceina AM nel piatto di coltura e tenere il piatto nell'incubatore per 30 minuti. Quindi, digerire tutte le cellule con tripsina.
   4. Contare le cellule tumorali coltivate in PBS con una camera di conteggio delle cellule e diluire fino ad ottenere 100 cellule tumorali per 1 mL di PBS.
      NOTA: Per enumerare con precisione il numero di cellule, prendere 50 μL della sospensione cellulare ottenuta per vedere se il numero di cellule tumorali in esso contenute è cinque o meno con un microscopio. Decidere il volume di sospensione cellulare che deve essere preso per ottenere 100 cellule tumorali in base al numero effettivo di cellule tumorali in 50 μL di sospensione cellulare.
2. Introdurre la sospensione cellulare contenente 100 cellule tumorali per 1 mL di PBS nel chip microfluidico utilizzando una siringa con una pompa a siringa a portate variabili di 0,5 mL/h, 1 mL/h, 2 mL/h, 3 mL/h, 4 mL/h e 5 mL/h. Ottenere l'efficienza di cattura per le varie portate e determinare la portata ottimale.
   1. Contare il numero di cellule tumorali catturate sul chip e che fuoriescono dalla presa. Calcola l'efficienza di acquisizione come di seguito:
      Efficienza di cattura = Numero di cellule catturate/(Numero di cellule catturate + numero di cellule che escono) × 100%
   2. Ripetere per ottenere l'efficienza di cattura per diversi numeri di cellule tumorali da 10 a 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
3. Testare e convalidare il chip microfluidico per un numero raro di cellule tumorali. Iniettare queste 10 sospensioni di campioni nei chip microfluidici utilizzando un ago cavo realizzato con un estrattore di micropipette per aspirare 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 cellule tumorali diluite in 1 mL di PBS. Rilevare ed enumerare il numero di cellule tumorali per ciascun campione dopo la loro cattura sul chip.
   NOTA: L'ago cavo è lungo circa 3 cm con un diametro esterno di 1 mm.
4. Eseguire test clinici pre-esperimento per le cellule tumorali impennate in campioni di sangue normali.
   1. Colorare le cellule tumorali con calceina AM e quindi enumerare 100 cellule tumorali in 5 μL di PBS. Spike queste cellule in 1 ml di campioni di sangue intero normale. Introdurre queste cellule nel chip ed enumerare il numero di cellule tumorali catturate sul chip con immunofluorescenza verde. Eseguire l'enumerazione in vivo sul chip come descritto sopra e calcolare l'efficienza di acquisizione dopo l'acquisizione.
   2. Ripetere il passaggio 1.4.1 per nove ulteriori concentrazioni di numero di cellule tumorali da 10 a 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
   3. Enumerare 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 cellule tumorali come descritto al punto 1.3 senza colorazione, aumentare il picco in 1 ml di sangue intero normale, introdurre questi campioni nel chip microfluidico e catturare le cellule tumorali sul chip.
   4. Colora sul chip con Hoechst, CK-FITC e CD45-PE. Inserire 3-5 μL di colorante fluorescente in 20-30 μL di PBS, quindi introdurre questa soluzione sul chip microfluidico con una siringa. Enumerare il numero di cellule tumorali catturate sul chip con immunofluorescenza blu e verde per determinare l'efficienza di cattura.
5. Eseguire la modifica del chip microfluidico per l'acquisizione basata sull'affinità di anti-EpCAM.
   NOTA: poiché il chip wave combina sia l'isolamento basato sull'affinità che quello basato sulle proprietà fisiche, modificare il chip con gli agenti.
   1. Modificare la superficie del chip con 100 μL di 3-mercaptopropil trimetossisilano al 4% (v/v) in etanolo a temperatura ambiente per 45 minuti. Introdurre questa soluzione nel chip con attenzione e lentamente nel caso in cui distrugga la struttura interna del chip, in particolare l'incollaggio della superficie superiore e del vetro del substrato.
      NOTA: la superficie del truciolo viene modificata utilizzando mercaptosilano. Le interazioni che si verificano sul chip sono determinate da legami chimici. I legami chimici sono stabiliti per realizzare il legame dell'anticorpo modificato con l'antigene. Vari reagenti vengono modificati all'interno del chip per stabilire legami chimici che si collegano tra loro. L'ultimo reagente ad essere modificato è una molecola di adesione antiepiteliale (anti-EpCAM). L'antigene di superficie delle cellule tumorali di EpCAM si combina con l'anti-EpCAM all'interno del chip per realizzare la cattura dei CTC.
   2. Lavare con etanolo 3x. Aggiungere 100 μL dell'agente di accoppiamento N-y-maleimidobutirrilossi succinimide estere (GMBS, 1 μM) sul chip e lasciarlo interagire per 30 minuti.
   3. Lavare con PBS 3x. Utilizzare una siringa per introdurre 1 mL di PBS sul chip da lavare.
   4. Trattare il chip con 30-40 μL di 10 μg/mL di neutravidina a temperatura ambiente per 30 minuti, portando all'immobilizzazione delle cellule sul GMBS, quindi lavare con PBS per rimuovere l'avidina in eccesso.
   5. Modificare il chip con 3 μL di anticorpo EpCAM anti-biotinilato ad una concentrazione di 10 μg/mL in 100 μL di PBS con 1% (p/v) di BSA. Tienilo durante la notte.

2. Esperimento clinico sul chip per enumerare le cellule tumorali circolanti (CTC)

1. Pre-elaborare campioni di sangue di pazienti oncologici clinici utilizzando la soluzione di lisi dei globuli rossi (RBCL) o introdurre 2-3 ml del campione di sangue direttamente sul chip microfluidico utilizzando una siringa.
   1. Eseguire la pre-elaborazione, che richiede circa 30 minuti. Raccogliere campioni di sangue intero in provette anticoagulanti. Aggiungere 6-9 ml di soluzione di lisi RBS in 2-3 ml di sangue. Centrifugare a 111 x g per 5-8 minuti a temperatura ambiente ed eliminare lo strato superiore di liquido rosso trasparente.
2. Acquisire, colorare, riconoscere ed enumerare le celle sul chip come descritto di seguito.
   1. Acquisire le celle sul chip come descritto nel passaggio 1.Colorare il chip per i CTC acquisiti utilizzando Hoechst, CK-FITC e CD45-PE. CK-FITC è una colorazione specifica per le cellule tumorali e CD45-PE è per i globuli bianchi.
   2. Aggiungere 3 μL di CK-FITC a 20 μL di PBS. Introdurre questo nella siringa e pompare il CK-FITC diluito sul chip. Lasciare colorare per 30 min. Introdurre 300 μL di PBS sul chip per lavare il chip.
   3. Aggiungere 3 μL di CD45-PE a 20 μL di PBS. Introdurre questo nella siringa e pompare il CD45-PE diluito sul chip. Lasciare riposare per 30 minuti. Introdurre 300 μL di PBS sul chip per lavare il chip.
   4. Identificare i CTC con un microscopio a fluorescenza invertita con ingrandimento 20x o 40x. I CTC emettono sia fluorescenza blu che verde e i globuli bianchi (WBC) emettono fluorescenza sia blu che rossa. Identificare i CTC con fluorescenza blu e verde e i globuli bianchi con fluorescenza blu e rossa.
   5. Dalle immagini di immunofluorescenza, enumerare il numero di CTC catturati sul chip. Enumerare i CTC come Hoechst+/CK-FITC+/CD45− e i WBC come Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
3. Arricchire i CTC catturati lavando con PBS attraverso la siringa nella direzione opposta sul chip microfluidico per raccogliere i CTC catturati sul chip dall'ingresso. Utilizzare una siringa con 1 mL di PBS, introdurla dall'uscita per arricchire i CTC catturati sul chip entro 2-3 minuti e raccoglierli dall'ingresso. Utilizzare 1 mL di PBS per ogni fase di lavaggio e ripetere 3 volte.
4. Colorare le cellule tumorali o CTC catturate sul chip microfluidico come descritto di seguito.
   1. Colora usando calceina AM. Aggiungere 5 μL di calceina AM a 20 μL di PBS, colorare le cellule per 30 minuti, quindi centrifugare a 111 x g per 2 minuti a temperatura ambiente per ottenere cellule tumorali e sospendere in 1 mL di PBS.
   2. Per identificare i nuclei cellulari, aggiungere 20 μL di soluzione DAPI (10 μL di reagente DAPI in 20 μL di PBS) al chip alla portata ottimale di 1 mL/h per i microfiltri a grande ellisse e 1,5 mL/h per quelli trapezoidali. Passare attraverso 20 μL di soluzione madre anti-citocheratina (3 μL di anticorpo anti-citocheratina in 20 μL di PBS) per reagire con il chip per 30 minuti.
   3. Macchia i globuli bianchi catturati sul chip. Dopo che i CTC sono stati catturati sul chip, aggiungere 25 μL di soluzione anticorpale anti-CD45 (5 μL di soluzione anti-CD45 in 20 μL di PBS) al chip e lasciare colorare per 30 minuti. Lavare con PBS e identificare le cellule epiteliali con fluorescenza blu e verde.
5. Eseguire l'identificazione con immunofluorescenza con microscopia a fluorescenza come descritto di seguito.
   1. Utilizzare un microscopio a fluorescenza ed eccitare il campione con il laser blu. Trova le cellule che emettono fluorescenza blu, che sono cellule nucleate. Utilizzare uno dei seguenti ingrandimenti: 10x, 20x o 40x. Trova un campo libero per la cellula tumorale. Per la sorgente laser blu, utilizzare una lunghezza d'onda della piastra di eccitazione di 420-485 nm e una lunghezza d'onda della piastra di emissione di 515 nm.
   2. Senza spostare i campioni, utilizzare un'altra sorgente laser. Ruotare il microscopio a fluorescenza ed eccitare il campione con il laser verde. Trova le cellule che emettono fluorescenza verde, che è indicativa delle cellule tumorali. Scatta immagini dello stesso campo con lo stesso ingrandimento con questa sorgente laser verde. Le cellule che emettono fluorescenza sia blu che verde sono riconosciute come cellule tumorali. Per la sorgente laser verde, utilizzare una lunghezza d'onda della piastra di eccitazione di 460-550 nm e una lunghezza d'onda della piastra di emissione di 590 nm
   3. Senza spostare i campioni, utilizzare un'altra sorgente laser. Ruotare il microscopio a fluorescenza ed eccitare il campione con il laser rosso. Trova le cellule che emettono fluorescenza rossa. Scatta immagini dello stesso campo con lo stesso ingrandimento con questa sorgente laser rossa. Le cellule che emettono fluorescenza sia blu che rossa sono riconosciute come globuli bianchi.
   4. Salvare l'immagine per ottenerla utilizzando ciascuna delle sorgenti laser sopra riportate. Scatta diverse immagini dello stesso campo con luci colorate diverse.
   5. Utilizzare la luce ultravioletta con una lunghezza d'onda della piastra di eccitazione di 330-400 nm e una lunghezza d'onda della piastra di emissione di 425 nm. Utilizzare la luce viola con una lunghezza d'onda della piastra di eccitazione di 395-415 nm e una lunghezza d'onda della piastra di emissione di 455 nm.
6. Calcolare l'efficienza di acquisizione come al punto 1.2.1.

Risultati

L'intera configurazione include una pompa a siringa, una siringa e un chip microfluidico. La sospensione cellulare nella siringa è collegata alla pompa della siringa e la sospensione cellulare viene introdotta nel chip microfluidico per catturare le cellule. L'efficienza di cattura per tutti i chip microfluidici utilizzati era di circa il 90% o superiore. Per il chip d'onda, abbiamo progettato microstrutture con varie lacune. I piccoli spazi vengono utilizzati per catturare i CTC e i grandi spazi vengono utilizzati per ...

Discussione

La prognosi e la diagnosi precoce del cancro hanno un effetto significativo sul trattamento del cancro¹. L'isolamento CTC con chip microfluidici offre una biopsia liquida senza invasione. Tuttavia, i CTC sono estremamente rari ed eterogenei nel sangue¹, il che rende difficile isolare i CTC. I CTC hanno proprietà simili alle fonti tumorali originali da cui provengono. Pertanto, i CTC svolgono un ruolo vitale nelle metastasi del cancro¹.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
calibrated microcapillary pipettes	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratin monoclonal antibody
DMEM	HyClone	SH30081.05
fetal bovine serum (FBS)	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., China	C0031
penicillin-streptomycin	Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL)	Solarbio, Beijing	R1010