Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

Resumo

O chip microfluídico clínico é uma importante técnica de análise biomédica que simplifica o pré-processamento de amostras de sangue de pacientes clínicos e cora por imunofluorescência as células tumorais circulantes (CTCs) in situ no chip, permitindo a rápida detecção e identificação de uma única CTC.

Resumo

As células tumorais circulantes (CTCs) são significativas no prognóstico, diagnóstico e terapia anticâncer do câncer. A enumeração da CTC é vital na determinação da doença do paciente, uma vez que as CTCs são raras e heterogêneas. As CTCs são descoladas do tumor primário, entram no sistema de circulação sanguínea e potencialmente crescem em locais distantes, metastatizando o tumor. Como as CTCs carregam informações semelhantes às do tumor primário, o isolamento da CTC e sua posterior caracterização podem ser fundamentais no monitoramento e diagnóstico do câncer. A enumeração, modificação de afinidade e coloração clínica por imunofluorescência de CTCs raras são métodos poderosos para o isolamento de CTC, pois fornecem os elementos necessários com alta sensibilidade. Os chips microfluídicos oferecem um método de biópsia líquida que é livre de qualquer dor para os pacientes. Neste trabalho, apresentamos uma lista de protocolos para chips microfluídicos clínicos, uma versátil plataforma de isolamento CTC, que incorpora um conjunto de funcionalidades e serviços necessários para a separação, análise e diagnóstico precoce da CTC, facilitando assim a análise biomolecular e o tratamento do câncer. O programa inclui contagem de células tumorais raras, pré-processamento clínico de sangue de pacientes, que inclui lise de hemácias, e o isolamento e reconhecimento de CTCs in situ em chips microfluídicos. O programa permite a enumeração precisa de células tumorais ou CTCs. Além disso, o programa inclui uma ferramenta que incorpora isolamento CTC com chips microfluídicos versáteis e identificação de imunofluorescência in situ nos chips, seguida de análise biomolecular.

Introdução

As células tumorais circulantes (CTCs) são significativas no prognóstico, diagnóstico e terapia anticâncer do câncer. A enumeração da CTC é vital, uma vez que as CTCs são raras e heterogêneas. A enumeração, a modificação da afinidade e a coloração clínica por imunofluorescência de CTCs raras são técnicas poderosas para o isolamento de CTC, pois oferecem os elementos necessários com alta^{sensibilidade1}. O número raro de células tumorais misturadas com sangue normal imita de perto o sangue real do paciente, uma vez que 2-3 mL de sangue real do paciente contém apenas 1-10 CTCs. Para resolver um problema experimental crítico, em vez de usar um grande número de células tumorais introduzidas em PBS ou misturadas com sangue normal, o uso de um número raro de células tumorais nos fornece um número baixo de células sanguíneas, o que é mais próximo da realidade ao realizar um experimento.

O câncer é a principal causa de morte no mundo². As CTCs são células tumorais eliminadas do tumor original que circulam nos sistemas de circulação sanguínea e linfática³. Quando os CTCs se movem para um novo ambiente de sobrevivência, eles crescem como um segundo tumor. Isso é chamado de metástase e é responsável por 90% das mortes em pacientes com^câncer4. As CTCs são vitais para o prognóstico, diagnóstico precoce e para a compreensão dos mecanismos do câncer. Entretanto, as CTCs são extremamente raras e heterogêneas no sangue dos pacientes ^5,6.

Os chips microfluídicos oferecem uma biópsia líquida que não invade o tumor. Eles têm a vantagem de serem portáteis, de baixo custo e terem uma escala compatível com células. O isolamento de CTCs com chips microfluídicos é classificado principalmente em dois tipos: baseado em afinidade, que se baseia na ligação antígeno-anticorpo7,8,9 e é o método original e mais amplamente utilizado de isolamento de CTC; e chips de base física, que utilizam diferenças de tamanho e deformabilidade entre células tumorais e células sanguíneas 10,11,12,13,14,15^, são livres de marcação e de fácil operação. A vantagem dos chips microfluídicos sobre as técnicas alternativas é que a abordagem física dos microfiltros de grande elipse captura firmemente os CTCs com alta eficiência de captura. A razão para isso é que os micropostes de elipse são organizados em túneis finos de lacunas de linha de linha. Os gaps de linha são diferentes dos tradicionais gaps ponto-ponto formados por micropostes, como micropostes losangos. A captura de CTCs baseada em chip de onda combina isolamento baseado em propriedades físicas e em afinidade. A captura baseada em chip de onda envolve 30 matrizes em forma de onda com o anticorpo de anti-EpCAM revestido em micropostes circulares. Os CTCs são capturados pelas pequenas folgas, e as grandes lacunas são usadas para acelerar a vazão. Os CTCs perdidos precisam passar pelas pequenas lacunas no próximo array e são capturados pelo isolamento baseado em afinidade integrado dentro do chip¹⁶.

O objetivo do protocolo é demonstrar a contagem de números raros de células tumorais e a análise clínica de CTCs com chips microfluídicos. O protocolo descreve as etapas de isolamento da CTC, como obter um baixo número de células tumorais, a separação física clínica de filtros de elipse pequena, filtros de elipse grande e filtros de trapézio, modificação de afinidade e enriquecimento¹⁷.

Protocolo

As amostras de sangue dos pacientes foram fornecidas pelo Longhua Hospital Afiliado à Universidade Médica de Xangai.O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim. Consentimento informado foi obtido dos pacientes para utilização das amostras para fins de pesquisa.

1. Pré-experimento para verificar a eficiência de captura com células tumorais cultivadas

1. Cultura das células tumorais MCF-7, MDA-MB-231 e HeLa para determinação da eficiência de captura. Diluir a suspensão de células tumorais, contar o número de células tumorais e repetir até obter o número desejado de células em 1 mL de PBS.
   1. Cultivar as células em frasco de cultura celular com número inicial de ~ 1 x 10,5 células em 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar numa atmosfera humidificada a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO₂.
   2. Quando as linhagens celulares crescerem como monocamadas aderentes a 95% de confluência, retire-as das placas de cultura com solução de tripsina a 0,25% por 2 min, conforme descrito em Chen et ^al.16.
   3. Corar as células tumorais com calceína AM. Coloque 3 μL de calceína AM na placa de cultura e mantenha a placa na incubadora por 30 min. Em seguida, digerir todas as células com tripsina.
   4. Contar as células tumorais cultivadas em PBS com uma câmara de contagem de células e diluir até obter 100 células tumorais por 1 mL de PBS.
      NOTA: Para enumerar precisamente o número de células, tome 50 μL da suspensão celular obtida para ver se o número de células tumorais nela é cinco ou não com um microscópio. Decidir o volume de suspensão celular que precisa ser tomado para obter 100 células tumorais de acordo com o número real de células tumorais em 50 μL de suspensão celular.
2. Introduzir a suspensão celular contendo 100 células tumorais por 1 mL de PBS no chip microfluídico usando uma seringa com bomba de seringa a vazões variadas de 0,5 mL/h, 1 mL/h, 2 mL/h, 3 mL/h, 4 mL/h e 5 mL/h. Obtenha a eficiência de captura para as várias taxas de fluxo e determine a taxa de fluxo ideal.
   1. Conte o número de células tumorais capturadas no chip e que fluem para fora da saída. Calcule a eficiência de captura conforme abaixo:
      Eficiência de captura = Número de células capturadas/(Número de células capturadas + número de células fluindo) × 100%
   2. Repetir para obter a eficiência de captura para diferentes números de células tumorais de 10 a 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
3. Testar e validar o chip microfluídico para um número raro de células tumorais. Injetar essas 10 suspensões de amostra nos chips microfluídicos usando uma agulha oca feita com um extrator de micropipeta para aspirar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 células tumorais diluídas em 1 mL de PBS. Detectar e enumerar o número de células tumorais para cada amostra após sua captura no chip.
   NOTA: A agulha oca tem cerca de 3 cm de comprimento e 1 mm de diâmetro externo.
4. Realizar testes clínicos pré-experimento para células tumorais cravadas em amostras de sangue normais.
   1. Colorir as células tumorais com calceína AM e, em seguida, enumerar 100 células tumorais em 5 μL de PBS. Spike essas células em 1 mL de amostras de sangue normal total. Introduza essas células no chip e enumere o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência verde. Execute a enumeração in vivo no chip conforme descrito acima e calcule a eficiência de captura após a captura.
   2. Repetir o passo 1.4.1 para nove concentrações adicionais de números de células tumorais de 10 a 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
   3. Enumerar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 células tumorais conforme descrito na etapa 1.3 sem colorir, espícula em 1 mL de sangue normal total, introduzir essas amostras no chip microfluídico e capturar as células tumorais no chip.
   4. Manchar no chip com Hoechst, CK-FITC e CD45-PE. Coloque 3-5 μL de corante fluorescente em 20-30 μL de PBS e, em seguida, introduza esta solução no chip microfluídico com uma seringa. Enumere o número de células tumorais capturadas no chip com imunofluorescência azul e verde para determinar a eficiência de captura.
5. Realizar modificação do chip microfluídico para a captura baseada em afinidade de anti-EpCAM.
   NOTA: Como o chip de onda combina isolamento baseado em afinidade e em propriedades físicas, modifique o chip com agentes.
   1. Modificar a superfície do cavaco com 100 μL de 4% (v/v) de 3-mercaptopropil trimetoxisilano em etanol à temperatura ambiente durante 45 min. Introduza esta solução no cavaco com cuidado e lentamente, caso destrua a estrutura interna do cavaco, especialmente a colagem da superfície superior e do substrato de vidro.
      NOTA: A superfície do chip é modificada usando mercaptosilano. As interações que ocorrem no chip são determinadas por ligações químicas. Ligações químicas são estabelecidas para realizar a ligação do anticorpo modificado com o antígeno. Vários reagentes são modificados dentro do chip para estabelecer ligações químicas que se conectam entre si. O último reagente a ser modificado é uma molécula de adesão antiepitelial (anti-EpCAM). O antígeno de superfície celular tumoral da EpCAM combina com o anti-EpCAM dentro do chip para realizar a captura dos CTCs.
   2. Lave com etanol 3x. Adicionar 100 μL do agente de acoplamento N-y-maleimidobutiriloxi éster succinimida (GMBS, 1 μM) ao chip e deixá-lo interagir por 30 min.
   3. Lave com PBS 3x. Use uma seringa para introduzir 1 mL de PBS no chip para lavar.
   4. Trate o chip com 30-40 μL de 10 μg/mL neutravidin à temperatura ambiente por 30 min, levando à imobilização das células no GMBS, e então lave com PBS para remover o excesso de avidina.
   5. Modificar o chip com 3 μL de anticorpo anti-biotinilado EpCAM a uma concentração de 10 μg/mL em 100 μL de PBS com 1% (p/v) de BSA. Mantenha isso durante a noite.

2. Experimento clínico no chip para enumerar as células tumorais circulantes (CTCs)

1. Pré-processar amostras de sangue de pacientes com câncer clínico usando solução de lise de hemácias (RBCL) ou introduzir 2-3 mL da amostra de sangue diretamente no chip microfluídico usando uma seringa.
   1. Realizar o pré-processamento, que leva em torno de 30 min. Coletar amostras de sangue total em tubos de anticoagulação. Adicionar 6-9 mL de solução de lise RBS em 2-3 mL de sangue. Centrifugar a 111 x g por 5-8 min à temperatura ambiente e descartar a camada superior de líquido claro vermelho.
2. Capture, manche, reconheça e enumere as células no chip conforme descrito abaixo.
   1. Capture as células no chip conforme descrito na etapa 1.Manchar o chip para os CTCs capturados usando Hoechst, CK-FITC e CD45-PE. CK-FITC é uma coloração específica para células tumorais, e CD45-PE é para glóbulos brancos.
   2. Adicionar 3 μL de CK-FITC a 20 μL de PBS. Introduza-o na seringa e bombeie o CK-FITC diluído para o chip. Deixe manchar por 30 min. Introduza 300 μL de PBS no chip para lavar o chip.
   3. Adicionar 3 μL de CD45-PE a 20 μL de PBS. Introduza-o na seringa e bombeie o CD45-PE diluído para o chip. Deixe repousar por 30 min. Introduza 300 μL de PBS no chip para lavar o chip.
   4. Identificar as CTCs com microscópio de fluorescência invertido, com aumento de 20x ou 40x. Os CTCs emitem fluorescência azul e verde, e os glóbulos brancos (WBCs) emitem fluorescência azul e vermelha. Identifique os CTCs com fluorescência azul e verde e os leucócitos com fluorescência azul e vermelha.
   5. A partir das imagens de imunofluorescência, enumere o número de CTCs capturados no chip. Enumere os CTCs como Hoechst+/CK-FITC+/CD45− e os WBCs como Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
3. Enriqueça os CTCs capturados lavando com PBS através da seringa no sentido inverso no chip microfluídico para coletar os CTCs capturados no chip da entrada. Use uma seringa com 1 mL de PBS, introduza-a da saída para enriquecer os CTCs capturados no chip dentro de 2-3 min e colete-os da entrada. Use 1 mL de PBS para cada etapa de lavagem e repita 3x.
4. Manchar as células tumorais ou CTCs capturadas no chip microfluídico conforme descrito abaixo.
   1. Coloração com calceína AM. Adicionar 5 μL de calceína AM a 20 μL de PBS, corar as células por 30 min, em seguida, centrifugar a 111 x g por 2 min à temperatura ambiente para obter células tumorais e suspender em 1 mL de PBS.
   2. Para identificar os núcleos celulares, adicionar 20 μL de solução de DAPI (10 μL de reagente DAPI em 20 μL de PBS) ao chip na vazão ideal de 1 mL/h para microfiltros de elipse grande e 1,5 mL/h para microfiltros trapezoides. Passar por 20 μL de solução estoque anticitoqueratina (3 μL de anticorpo anticitoqueratina em 20 μL de PBS) para reagir com o chip por 30 min.
   3. Manchar os WBCs capturados no chip. Depois que os CTCs tiverem sido capturados no chip, adicione 25 μL de solução de anticorpo anti-CD45 (5 μL de solução anti-CD45 em 20 μL de PBS) ao chip e deixe manchar por 30 min. Lave com PBS e identifique as células epiteliais com fluorescência azul e verde.
5. Realizar a identificação por imunofluorescência com microscopia de fluorescência conforme descrito abaixo.
   1. Use um microscópio de fluorescência e excite a amostra com o laser azul. Encontre as células emissoras de fluorescência azul, que são células nucleadas. Use uma das seguintes ampliações: 10x, 20x ou 40x. Encontre um campo claro para a célula tumoral. Para a fonte de laser azul, use um comprimento de onda da placa de excitação de 420-485 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 515 nm.
   2. Sem mover as amostras, use outra fonte de laser. Gire o microscópio de fluorescência e excite a amostra com o laser verde. Encontre as células que emitem fluorescência verde, o que é indicativo de células tumorais. Tire fotos do mesmo campo com a mesma ampliação com esta fonte de laser verde. As células que emitem fluorescência azul e verde são reconhecidas como células tumorais. Para a fonte de laser verde, use um comprimento de onda da placa de excitação de 460-550 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 590 nm
   3. Sem mover as amostras, use outra fonte de laser. Gire o microscópio de fluorescência e excite a amostra com o laser vermelho. Encontre as células que emitem fluorescência vermelha. Tire imagens do mesmo campo com a mesma ampliação com esta fonte de laser vermelha. As células que emitem fluorescência azul e vermelha são reconhecidas como glóbulos brancos.
   4. Salve a imagem para obter usando cada uma das fontes de laser acima. Tire várias imagens do mesmo campo com luzes coloridas diferentes.
   5. Use luz ultravioleta com um comprimento de onda da placa de excitação de 330-400 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 425 nm. Use luz roxa com um comprimento de onda da placa de excitação de 395-415 nm e um comprimento de onda da placa de emissão de 455 nm.
6. Calcule a eficiência de captura como na etapa 1.2.1.

Resultados

Toda a configuração inclui uma bomba de seringa, uma seringa e um chip microfluídico. A suspensão celular na seringa é conectada à bomba da seringa, e a suspensão da célula é introduzida no chip microfluídico para capturar as células. A eficiência de captura para todos os cavacos microfluídicos utilizados foi de cerca de 90% ou mais. Para o chip de onda, projetamos microestruturas com lacunas variadas. Os pequenos gaps são usados para capturar os CTCs, e os big gaps são usados para acelerar a taxa de fluxo...

Discussão

O prognóstico e o diagnóstico precoce do câncer têm efeito significativo no tratamento do câncer¹. O isolamento do CTC com chips microfluídicos oferece uma biópsia líquida sem invasão. No entanto, as CTCs são extremamente raras e heterogêneas no sangue¹, o que torna difícil isolar as CTCs. As CTCs têm propriedades semelhantes às fontes tumorais originais das quais se originam. Assim, as CTCs desempenham um papel vital na metástase do^câncer1...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
calibrated microcapillary pipettes	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratin monoclonal antibody
DMEM	HyClone	SH30081.05
fetal bovine serum (FBS)	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., China	C0031
penicillin-streptomycin	Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL)	Solarbio, Beijing	R1010