Raccolta di dati comportamentali sui ratti auto-avviati per caratterizzare i deficit post-ictus

Riepilogo

Viene presentato un sistema per l'acquisizione di dati da sessioni di comportamento individuale auto-avviate all'interno di un ambiente di gabbia di colonia sociale. L'efficacia di questo sistema è dimostrata utilizzando una valutazione automatizzata della portata qualificata, che consente la caratterizzazione di disturbi motori post-ictus, potenziali alterazioni comportamentali legate alla motivazione, variazioni circadiane e altre variabili dipendenti innovative.

Abstract

I test comportamentali nei modelli di ratto sono spesso utilizzati per diversi scopi, tra cui la ricerca psicologica, biomedica e comportamentale. Molti approcci tradizionali prevedono sessioni di test individuali e individuali tra un singolo ricercatore e ciascun animale in un esperimento. Questa configurazione può richiedere molto tempo per il ricercatore e la loro presenza può avere un impatto sui dati comportamentali in modi indesiderati. Inoltre, la gabbia tradizionale per la ricerca sui ratti impone una mancanza di arricchimento, esercizio fisico e socializzazione che normalmente sarebbe tipica della specie, e questo contesto può anche distorcere i risultati dei dati comportamentali. Il superamento di queste limitazioni può essere utile per diverse applicazioni di ricerca, incluso lo studio delle lesioni cerebrali acquisite. Qui viene presentato un metodo di esempio per addestrare e testare automaticamente il comportamento dei singoli ratti in una gabbia di colonia senza la presenza di esseri umani. L'identificazione a radiofrequenza può essere utilizzata per adattare le sessioni al singolo ratto. La convalida di questo sistema è avvenuta nel contesto di esempio della misurazione delle prestazioni motorie degli arti anteriori prima e dopo l'ictus. Vengono misurate le caratteristiche tradizionali dei disturbi comportamentali post-ictus e le nuove misure abilitate dal sistema, tra cui il tasso di successo, vari aspetti della forza di trazione, l'analisi dell'attacco, il tasso di inizio e i modelli, la durata della sessione e i modelli circadiani. Queste variabili possono essere raccolte automaticamente con poche limitazioni; Sebbene l'apparato rimuova il controllo sperimentale dell'esposizione, dei tempi e della pratica, la convalida ha prodotto una ragionevole coerenza in queste variabili da animale ad animale.

Introduzione

L'addestramento comportamentale e i test con modelli di ratto sono importanti in innumerevoli aree di ricerca, dall'esplorazione dei processi cognitivi agli stati patologici e altro ancora¹. In genere, questa formazione e test vengono condotti con singoli animali in sessioni individuali, con un ricercatore che rimuove manualmente l'animale dalla gabbia domestica e lo colloca temporaneamente in una sorta di apparato. Sfortunatamente, ci sono diverse difficoltà e limitazioni con questo approccio. In primo luogo, i test comportamentali possono richiedere molto tempo per i ricercatori e, quando è necessaria la formazione, tale richiesta di tempo diventa ancora maggiore. In secondo luogo, questo approccio influisce automaticamente - o addirittura potenzialmente confonde - i dati acquisiti, come è stato stabilito altrove². Questi fattori confondenti sono particolarmente salienti quando si considerano le variabili correlate all'arricchimento. In particolare, i ratti da laboratorio sono tradizionalmente alloggiati in piccole gabbie che sono abbastanza grandi per uno o due ratti³ e, se non vengono fornite ruote da corsa, possono passare una vita senza opportunità significative di esercizio. Inoltre, l'alloggio isolato può essere una delle principali fonti di stress in una specie sociale come il ratto⁴. Alcuni di questi inconvenienti legati al benessere probabilmente hanno un impatto sulla fisiologia dei ratti ^5,6, che può prevenire lo sviluppo di espressioni comportamentali specie-tipiche⁴ e influire sulla qualità dei modelli di roditori applicati ai contesti umani.

Negli ultimi anni i ricercatori hanno perseguito diversi tipi di soluzioni a questi problemi. Il tipo più semplice di soluzione è stato quello di automatizzare i test comportamentali e la formazione 7,8,9,10, eliminando così la necessità per un singolo ricercatore di occuparsi di un singolo animale. Un'ulteriore soluzione è stata quella di automatizzare il trasferimento degli animali nelle camere sperimentali^11,12, eliminando ulteriormente la necessità del coinvolgimento umano. Infine, sono state esplorate diverse configurazioni che consentono agli animali di essere alloggiati in gabbie di colonie con altri animali e con più spazio per l'esplorazione e l'arricchimento¹³. Nonostante questi vantaggi, tali configurazioni di colonie possono limitare o complicare gli sforzi per raccogliere dati comportamentali differenziati individualmente (anche se vedi sforzi per utilizzare la visione artificiale)^14,15. Se sono richiesti dati comportamentali individuali, può essere più difficile o complesso identificare e recuperare gli animali dalla gabbia della colonia anche per le sessioni comportamentali. Al momento, esistono pochi sistemi per la raccolta di dati comportamentali individuali da colonie (arricchite)^{che ospitano} 16,17,18.

Questi inconvenienti possono avere un impatto specifico sulla ricerca sugli effetti comportamentali della lesione cerebrale acquisita. In primo luogo, è chiaro che la presenza e/o il sesso degli esseri umani e le pratiche di manipolazione influenzano il comportamento dei roditori ^2,19 e queste variabili possono avere un impatto differenziale sul comportamento dei ratti prima rispetto a quelli di cui all'uomo. dopo l'ictus. In secondo luogo, gli esiti comportamentali umani dopo l'ictus possono essere peggiorati da una diminuzione volontaria dell'impegno con il dosaggio raccomandato di esercizi di riabilitazione²⁰. Attualmente, gli esperimenti sui roditori tendono a non modellare questo tipo di contesto, perché i ratti non sono liberi di scegliere di impegnarsi o astenersi dalle sessioni comportamentali.

Questo articolo introduce un protocollo progettato per facilitare i test comportamentali individuali nell'ambito della gabbia di colonie arricchite. Questo approccio non solo affronta i vincoli delle pratiche attuali, ma apre anche strade per l'esplorazione di misure innovative. È stato sviluppato un tornello a un ratto (ORT) che può essere apposto su una gabbia di colonia, consentendo agli animali di entrare nelle camere comportamentali in modo indipendente e avviare le proprie sessioni di addestramento e test. Il sistema è conveniente; ogni ORT può essere assemblato a basso costo (dato accesso a una stampante 3D). In passato, la convalida di questo sistema è stata effettuata utilizzando una camera operante di base, dimostrando che gli animali potevano essere costantemente addestrati a eseguire una semplice pressione a leva operante senza la presenza di uno sperimentatore¹⁶. Tuttavia, la questione se questa configurazione sia applicabile ad altri scenari rimane irrisolta. L'obiettivo è convalidare l'efficacia della configurazione della gabbia per colonie ORT, precedentemente stabilita, per l'addestramento e la quantificazione del comportamento di portata qualificato rilevante per la compromissione motoria a seguito di un ictus. La configurazione è stata utilizzata per generare nuove variabili che in genere non vengono esplorate nella ricerca sull'ictus. Queste variabili includono metriche di performance per il compito di portata qualificata e misurazioni dell'auto-iniziazione, che potrebbero essere pertinenti alla motivazione e al processo decisionale. Inoltre, sono stati rilevati efficacemente i cambiamenti indotti dall'ictus nei modelli circadiani di auto-iniziazione giornaliera durante l'intero periodo di 24 ore.

Protocollo

Tutte le procedure e la cura degli animali sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas settentrionale (IACUC) e hanno aderito alla guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I ratti Long-Evans maschi e femmine adulti (400-800 g, 1,5 anni), utilizzati nel presente studio, sono stati alloggiati in gabbia per colonie.

1. Preparazione dell'attrezzatura

1. Ottenere o assemblare il tornello a un ratto (ORT) secondo il progetto files e le istruzioni per la costruzione (vedi File supplementare 1 e Codifica supplementare File 1). Fare riferimento a Butcher et ^al.16 per ulteriori dettagli.
   NOTA: Gli ORD sono specifici per le dimensioni dei ratti, quindi una gabbia per colonie dovrebbe includere animali che hanno approssimativamente le stesse dimensioni. Se non si desidera auto-assemblare gli ORT, possono essere acquistati pre-assemblati (vedi Tabella dei materiali).
2. Procurarsi e collegare un lettore di identificazione a radiofrequenza (RFID, vedere Tabella dei materiali) e ottenere e iniettare gli animali con tag RFID.
   NOTA: Quando si iniettano tag RFID full duplex (FDX), l'orientamento deve essere perpendicolare all'antenna RFID mentre il ratto cammina attraverso l'ORT. In questa convalida, i tag sono stati impiantati per via sottocutanea tra la scapola su un piano parallelo alla colonna vertebrale.
3. Fissare l'antenna RFID al tubo dell'ORT.
4. Costruire e/o ottenere l'apparato comportamentale e la gabbia di colonia appropriati per la domanda sperimentale. In questo esempio, la gabbia per colonie costruita su misura^21,22 è stata utilizzata in combinazione con camere operative disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali), sebbene in teoria potesse essere utilizzata qualsiasi attrezzatura.
   NOTA: Dovrebbe essere presa in considerazione la competizione di animali alloggiati in colonia per l'accesso all'apparato comportamentale tramite l'ORT. Anticipa la necessità di un apparato comportamentale ORT + ogni 4-6 animali.
5. Attacca l'ORT (o gli ORT) tra l'apparato comportamentale e la gabbia della colonia.
6. Praticare un foro portale nell'apparato comportamentale e nella gabbia delle colonie utilizzando un utensile rotante Dremel (vedi Tabella dei materiali) o uno strumento simile. Il diametro interno deve essere uguale al diametro esterno del tunnel ORT costruito.
   NOTA: L'ORT deve essere sollevato di alcuni centimetri per funzionare, quindi sarà necessaria una piccola piattaforma o supporto per allineare la gabbia della colonia e le altezze dell'apparato.
7. Installare un sistema RFID per leggere gli animali mentre passano attraverso l'ORT e, se lo si desidera, integrarlo con l'apparato comportamentale.

2. Formazione comportamentale prechirurgica

1. Ottieni una coorte di ratti della stessa dimensione e introducili nella gabbia della colonia.
   NOTA: Gli animali che sono stati allevati o alloggiati estensivamente in isolamento o con pochi conspecifici possono avere più difficoltà ad esplorare la camera, specialmente quando si tratta di attraversare le aree sociali della gabbia della colonia. Gli animali dovrebbero essere esposti a gabbie di gruppo all'inizio della vita per evitare questa trappola.
2. Rimuovi l'accesso a qualsiasi manipolatore all'interno dell'apparato comportamentale e imposta la camera in modo che fornisca automaticamente ricompense ogni 60 s, in media, quando è occupata.
   NOTA: Questo studio ha utilizzato l'acqua di saccarosio (dal 30% al 40%) come ricompensa, ma anche il latte condensato zuccherato è efficace.
3. Addestrare tutti i ratti a entrare regolarmente nell'apparato comportamentale tramite l'ORT.
4. Almeno una volta al giorno, controlla i dati per assicurarti che tutti gli animali entrino nell'ORT. Se gli animali non entrano, inserire un oggetto delle dimensioni di una penna nel meccanismo di bloccaggio per impedirne il blocco temporaneo e consentire agli animali di esplorare più liberamente. Se gli animali continuano a non entrare, rimuovere il tornello e fissare una parete laterale temporanea per consentire il libero accesso al tunnel della camera.
5. Una volta che tutti gli animali entrano regolarmente nella camera, restituisci la serratura (e il tornello) e rivaluta.
   NOTA: Gli animali possono anche occupare l'ORT e la camera come tregua temporanea da altri ratti. Un modo per prevenire questo tipo di monopolizzazione della camera è quello di collegare un ORT aggiuntivo che si collega a una semplice camera di isolamento.
6. Introdurre il manipulandum, in questo caso di esempio, la maniglia di trazione e impostarla sulla sensibilità più alta. Inserisci la maniglia appena all'interno della scatola (fino a 2 cm) o appena fuori dalla scatola.
   NOTA: Il nastro adesivo può evocare tentativi di portata se fissato sul retro dell'impugnatura, appena fuori portata.
7. Ridurre la frequenza con cui la ricompensa (ad esempio, il 30% di acqua di saccarosio) viene erogata automaticamente (ad esempio, ogni 90-120 s). Ricorda che può essere utilizzata qualsiasi ricompensa che si adatti alle esigenze dello sperimentatore e alle preferenze degli animali.
8. Controllare i dati quotidianamente per assicurarsi che tutti gli animali abbiano imparato ad attivare la leva. Innescare la leva e/o cambiare il livello di inserimento finché tutti gli animali non tirano.
9. Interrompi la consegna automatica dei premi in modo che siano disponibili solo tramite l'attivazione della maniglia.
10. Se precedentemente inserita, ritrarre la leva ogni giorno (a condizione che tutti i ratti continuino a tirare a quel livello di retrazione) da 0.25 mm a 0.5 mm finché la leva non è nella sua posizione finale, da 1 cm a 1.25 cm fuori dalla camera.
    NOTA: La posizione esatta della leva dipende dalle dimensioni dei ratti. Assicurarsi di scegliere una posizione che si traduca nella topografia desiderata.
11. Avviare un percentile o un altro programma di allenamento per aumentare progressivamente le forze di trazione richieste per attivare la maniglia.
    NOTA: Questo studio ha utilizzato un programma percentile che stabilisce il criterio per il rinforzo nel quartile superiore delle precedenti 15 risposte. In alternativa, è possibile utilizzare aumenti graduali del criterio pull⁷.
12. Una volta che gli animali raggiungono in modo affidabile l'intervallo di criteri finale di 120 g di tiri, rimuovere il programma di addestramento percentile e fissare il criterio per l'attivazione della maniglia a una costante di 120 g.
13. Raccogliere i dati di base a questo requisito di forza fino a quando le percentuali di successo non sono state costanti (non tendenziali) per circa una settimana.

3. Indurre l'ictus

1. Indurre chirurgicamente l'ictus in tutti gli animali in gabbia della colonia contemporaneamente.
   NOTA: Per indurre l'ictus è stato utilizzato un modello endoteliano-1 di ictus, che è stato descritto altrove²³.
2. Lasciare che gli animali si riprendano in gabbia tradizionale, isolati singolarmente, per 3-7 giorni.

4. Test comportamentali post-chirurgici

1. Dopo il recupero, riportare gli animali nella gabbia della colonia con l'apparato di portata qualificato collegato all'ORT.
2. Eseguire il test comportamentale, mantenendo i requisiti di trazione al finale di 120 g (seguire il passaggio 2) fino a quando non vengono raccolti dati sufficienti per valutare i deficit post-ictus (da uno a più giorni).
3. Implementare eventuali variabili indipendenti post-ictus o relative al recupero durante i giorni successivi mentre gli animali accedono alla camera.

Risultati

Gli animali sono stati addestrati e testati con quattro ratti femmine in una gabbia di colonia e quattro ratti maschi in una gabbia di colonia separata. Tutti i ratti hanno imparato a passare attraverso gli ORT in quattro giorni o meno. Le quattro femmine di ratto hanno raggiunto l'>85% di successo con il requisito di forza di 120 g in circa 6 settimane di addestramento e i ratti maschi hanno raggiunto lo stesso criterio in 10 settimane (rispetto a circa 3 settimane con l'addestramento standard con ratti privati)

Discussione

Questo protocollo ha molteplici usi. In primo luogo, e più in generale, l'ORT è stato sviluppato allo scopo di consentire la formazione comportamentale automatizzata di un singolo soggetto e la raccolta di dati nel contesto dell'edilizia sociale arricchita. Mentre questo studio ha testato l'idea di raccogliere misure comportamentali tipiche ed elaborarle nel contesto dell'ictus, lo stesso può essere fatto per altre applicazioni e compiti comportamentali. Anche le misure raccolte in questa convalida possono anche esser...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer			Consult with local makerspace
bolt	Boltdepot	1346	6-32 or 8-32 by  0.5"
bolt	Boltdepot	1348	6-32 or 8-32 by  0.75"
door hinge	XJS (Amazon)	43398-16234	1" cabinet stainless steel door hinge set; Optional (if "perfect hinge" is not printed)
drill			Any electric drill works
extension spring	Nieko (Amazon)	50456A	Choose and adjust spring based on ORT sized and desired tension
granulated sugar
lock nuts	Boltdepot	2551	6-32 or 8-32
measuring tape
microcontroller	Arduino	A000066	Arduino Uno
microswitch	Sparkfun	KW4-Z5F	mini microswitch (SPDT-roller lever)
One Rat Turnstile (ORT)	Vulintus		Contact company to request quote if not self-assembling
Operant Chambers as desired for behavioral assessment: For this experiment we used automated isometric pull chambers from Vulintus	Vulintus	No cat #: contact Vulintus	Contact Vulintus for quote
PLA filament	OVERTURE (Amazon)	UK-MATTEPLA17511
plexiglass	Lesnlok (Amazon)	B09P74K7BR	clear, 1/8" thickness, Cut to size
plexiglass cutter
python program	Python Software Foundation		software available on request
RFID reader	Priority 1 Design	RFIDRW-E-USB	With antenna
RFID tag	Unified Information Devices	UC-1485-10
rod	Boltdepot	23632	cut to > 3.5"
Rotary tool			Used to bore hole in apparatus and colony caging for ORT; any hardware usable
sand paper	HSYMQ (Amazon)	TOMPOL-1118-1915-11
socket wrench set			Any socket wrench set works
soldering iron
super glue		234790
wire	Plusivo (Amazon)	EAN0721248989789