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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un metodo rapido per determinare la compatibilità e l'incompatibilità del polline nelle cultivar di agrumi.

Abstract

Gli agrumi utilizzano l'auto-incompatibilità basata sulla S-RNasi per respingere l'auto-polline e, pertanto, richiedono alberi impollinatori vicini per un'impollinazione e una fecondazione di successo. Tuttavia, identificare le varietà adatte a fungere da impollinatori è un processo che richiede tempo. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo rapido per identificare le cultivar di agrumi compatibili con l'impollinazione che utilizza l'elettroforesi su gel di agarosio e la colorazione blu all'anilina. La compatibilità del polline viene determinata sulla base dell'identificazione dei genotipi S estraendo il DNA totale ed eseguendo saggi di genotipizzazione basati sulla PCR con primer specifici. Inoltre, gli stili vengono raccolti 3-4 giorni dopo l'impollinazione manuale e viene eseguita la colorazione blu all'anilina. Infine, lo stato di crescita dei tubi pollinici viene osservato con un microscopio a fluorescenza. La compatibilità e l'incompatibilità del polline possono essere stabilite osservando se la crescita del tubo pollinico è normale o soppressa, rispettivamente. Grazie alla sua semplicità ed economicità, questo metodo è uno strumento efficace per determinare la compatibilità e l'incompatibilità del polline di diverse varietà di agrumi per stabilire gruppi di incompatibilità e relazioni di incompatibilità tra diverse cultivar. Questo metodo fornisce informazioni essenziali per la selezione di successo di alberi impollinatori adatti e, quindi, facilita la creazione di nuovi frutteti e la selezione di genitori appropriati per i programmi di allevamento.

Introduzione

L'autoincompatibilità (SI) è un meccanismo geneticamente controllato presente in circa il 40% delle specie di angiosperme. In questo processo, il pistillo respinge il polline da una pianta con lo stesso genotipo SI e, quindi, impedisce l'autofecondazione 1,2. Ma jia pummelo è una varietà locale nella provincia di Jinagsu, in Cina, con le eccellenti qualità di frutta grande e rosa, un ricco contenuto di succo, un sapore agrodolce e una buccia spessa3. Sebbene il SI promuova l'outcrossing, influisce negativamente sulla resa e sulla qualità dei frutti4 e richiede alberi impollinatori adatti con genotipi SI distinti per tassi di allegagione affidabili e rese elevate. Allo stato attuale, ci sono due tipi principali di SI, l'autoincompatibilità sporofica (SSI), rappresentata dalle Brassicaceae, e l'autoincompatibilità gametofitica (GSI), rappresentata dalle Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.

Gli agrumi sono una delle colture frutticole più importanti al mondo. Il sistema GSI basato sulla S-RNasi si trova in molte accessioni di agrumi e influenza negativamente il tasso di allegagione9. In questo sistema, SI è controllato dal locus S, un singolo locus polimorfico con due alleli complessi che trasportano determinanti del pistillo S e determinanti del polline S 7. Il determinante femminile è la ribonucleasi S (S-RNasi) e il determinante maschile è il locus S F-box (SLF)7. Le cellule del pistillo secernono proteine S-RNasi. Le S-RNasi non-self sono riconosciute dalle proteine SLF, il che porta all'ubiquitinazione e alla degradazione delle non-self S-RNasi da parte della via del proteasoma 26S. Al contrario, le S-RNasi self sono in grado di accumulare e inibire la crescita del tubo pollinico (PT) perché eludono le proteine SLF e, quindi, sono impedite dall'ubiquitinizzazione10,11,12,13.

Qui riportiamo una tecnica in vivo utile per identificare i genotipi S e i gradi di compatibilità e incompatibilità del polline. Il protocollo prevede l'estrazione del DNA totale dalle foglie e la previsione del genotipo S utilizzando primer specifici per S. Inoltre, la colorazione blu all'anilina e la microscopia a fluorescenza seguita dall'impollinazione manuale forniscono prove del grado di compatibilità e incompatibilità. Anche la procedura di impollinazione semi in vivo, che prevede l'impollinazione manuale dei fiori in laboratorio14,15, è stata adattata per valutare i gradi di autocompatibilità e incompatibilità. Tuttavia, abbiamo anche utilizzato l'impollinazione sul campo seguita dall'insaccamento dei fiori per evitare la contaminazione da polline indesiderato per consentire ai tubi pollinici di svilupparsi in condizioni naturali. Questo protocollo è semplice e diretto e fornisce le informazioni necessarie per la selezione di successo degli alberi impollinatori adatti.

Protocollo

1. Preparazione per la colorazione blu all'anilina

  1. Preparare i seguenti reagenti e strumenti per l'esperimento: un pennello impollinatore, una pinzetta, una matita, carta solfato, un sacchetto di impollinazione, sacchetti con chiusura a cerniera, graffette, formaldeide, acido acetico glaciale, etanolo assoluto, provette per centrifuga, pinze, contagocce di colla, vetrini, copertine, bisturi e glicole polietilenico.
  2. Preparare un mezzo di germinazione in vitro contenente 0,02% MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% Ca(NO 3)2, 0,01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 e 15% saccarosio. Regolare il pH a 6,0-6,2 con KOH. Utilizzare un agitatore magnetico poiché PEG-4.000 è difficile da sciogliere.
  3. Preparare la soluzione fissativa di Carnoy, che è etanolo assoluto e acido acetico glaciale miscelati con un rapporto di 3: 1. Preparare la soluzione di fissazione FAA, che è 40% formaldeide, 80% etanolo e acido acetico glaciale (1: 8: 1). Preparare 4 M idrossido di sodio (NaOH) e soluzione di blu di anilina, che è blu di anilina allo 0,1% in 0,1 M K3PO4. Utilizzare una bottiglia ambrata per conservare la soluzione blu anilina perché è sensibile alla luce.

2. Raccolta del polline

  1. Conoscere in anticipo il periodo di fioritura degli alberi sperimentali (Ma jia pummelo in questo studio). Raccogli i fiori maturi non aperti dall'inizio del periodo di fioritura alla fase di massima fioritura e mettili in un sacchetto con chiusura a zip. I fiori possono essere conservati a 4 °C in frigorifero per 24 ore.
  2. Porta i fiori al laboratorio. Usa una pinzetta per raccogliere le antere e mettile in una piastra di Petri contenente carta da filtro. Raccogli antere da 20 a 30 fiori.
  3. Mettere la piastra di Petri contenente le antere in un forno a 28 °C per 24 ore fino a quando i grani di polline non si asciugano. Per l'organizzazione dettagliata dei fiori, vedi Hu et al.9.
  4. Mettere il polline essiccato in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Conservare il polline in un sacchetto con chiusura a zip ermetico contenente gel di silice che cambia colore (essiccante). Chiudere il sacchetto ed etichettarlo con il nome della varietà di polline e la data di conservazione. Il polline essiccato può essere conservato in frigorifero a -20 °C per 96 settimane16.

3. Test di germinazione del polline in vitro

  1. Versare 300 μL di mezzo liquido in una capsula di coltura cellulare o nel tappo di una provetta da centrifuga da 2 ml e cospargere uniformemente il polline con l'aiuto di un pennello per l'impollinazione. Incubare il polline a 28 °C in un ambiente buio umidificato per 12 ore.
  2. Rimuovere la parte superiore di 1 mm della punta di una punta di pipetta da 1.000 μL. Utilizzare la pipetta per assorbire il polline con una piccola quantità di soluzione di coltura e spostarla al centro del vetrino del microscopio. Coprilo con un foglietto. Osservare il campione con un microscopio invertito usando un obiettivo 10x.
  3. Eseguire tre repliche indipendenti utilizzando approssimativamente la stessa densità di polline per ciascuna replica17. Gestisci visivamente la quantità di polline, assicurandoti che tutta la piastra di Petri sia coperta di polline e che ogni capsula di Petri abbia una quantità quasi uguale di polline.
  4. Il polline germinato produce un tubo pollinico con una lunghezza circa doppia del suo diametro. Calcola il tasso di germinazione da 20 campi visivi, che fornisce la percentuale di polline germinato in tutti i campi pollinici.

4. Impollinazione

  1. Scegli una giornata di sole senza vento per l'impollinazione. Seleziona 10 gemme completamente sviluppate che stanno per aprirsi, stacca i petali con cura e fai attenzione a non ammaccarli.
  2. Utilizzare un pennello per l'impollinazione per diffondere una quantità sufficiente di polline vitale sulla superficie dello stigma e fare attenzione a non danneggiare il pistillo. Per l'autoimpollinazione, utilizzare il polline della stessa pianta / cultivar. Per l'impollinazione incrociata, utilizzare il polline di una pianta con un genotipo diverso.
  3. Coprire i fiori impollinati con un sacchetto di carta solfato. Utilizzare una graffetta per sigillare il sacchetto e prevenire l'impollinazione da polline genotipicamente distinti.
  4. Scrivi il nome della specie e il numero e il tempo di impollinazione sull'etichetta. Appendere l'etichetta sui rami vicino ai fiori impollinati.

5. Campionamento, fissazione e conservazione

  1. Rimuovere i sacchetti di impollinazione circa 3-4 giorni dopo l'impollinazione e raccogliere i fiori impollinati in sacchetti con chiusura a zip.
  2. Rimuovere immediatamente i petali, i recipienti e le ovaie dai fiori e immergere gli stimmi fusi agli stili in un tubo di centrifuga contenente una soluzione fissativa appena preparata. Incubare gli stimmi e gli stili nella soluzione fissativa per una notte a 4 °C.
  3. Il giorno dopo, scartare la soluzione fissativa e lavare gli stimmi e gli stili due o tre volte in etanolo al 95%.
  4. Trasferire gli stili in una soluzione di etanolo al 70%. Assicurarsi che il campione sia completamente immerso nella soluzione. I modelli in questa fase possono essere conservati a 4 °C per 1-2 mesi.

6. Colorazione blu all'anilina

  1. Lavare i campioni di stile conservati in etanolo al 70% con acqua distillata tre o quattro volte. Immergere in una soluzione di 4 M NaOH, sigillare e incubare in bagnomaria a 65 °C per 60 minuti. Durante questa fase, il colore dello stile cambia da giallo-bianco a rosso-arancio.
  2. Immergere gli stili in acqua distillata per 30 min. Scartare l'acqua distillata e lavare gli stili con acqua distillata tre o quattro volte o fino a quando il colore dello stile diventa giallo.
  3. Mettere il campione in una provetta da 10 ml, aggiungere il blu di anilina fino a quando il campione è stato immerso e colorare per 12 ore al buio.
  4. Osservare la crescita del tubo pollinico con un microscopio a fluorescenza.

7. Microscopia a fluorescenza

  1. Prima di osservare i campioni, posizionare il vetrino su un tavolo piano e aggiungere due o tre gocce di glicole polietilenico sulla superficie del vetrino.
  2. Lavare lo stile da osservare con acqua distillata. Usa un bisturi per dividerlo in due metà lungo l'asse longitudinale. Posiziona metà dello stile sul vetrino e copri con una copertina.
  3. Posiziona il vetrino sul palco del microscopio sopra l'apertura e visualizzalo utilizzando un obiettivo 10x. Utilizzare il filtro DAPI (eccitazione: 325-375 nm; emissione: 435-485 nm). Osserva cinque stili per ogni tipo di impollinazione. Osserva la crescita del tubo pollinico.

8. Identificazione del genotipo S basato sulla PCR

  1. Estrarre il DNA genomico dal campione di stigma utilizzando il metodo CTAB18.
    1. Mettere le foglie raccolte in una provetta da centrifuga da 2 ml e congelare a scatto in azoto liquido. Preparare un tampone HCl:EDTA:NaCl:H2O in rapporto 1:1:3:5 e una miscela di alcol isoamilico cloroformio in rapporto 24:1
    2. Aggiungere 10 ml del tampone preparato, 0,2 g di CTAB e 200 μL di mercaptoetanolo in una provetta da centrifuga da 50 mL e metterli a bagnomaria a 65 °C per 5 minuti fino a quando la soluzione diventa limpida e trasparente.
    3. Mettere le lame in un mortaio, aggiungere i campioni congelati, aggiungere azoto liquido e macinare. Mettere il campione macinato in una provetta da centrifuga da 2 ml, aggiungere 600 μL di miscela CTAB, metterlo a bagnomaria a 65 °C per 60 minuti e mescolarlo capovolto ogni 30 minuti.
    4. Aggiungere 700 μL della miscela di alcol isoamilico cloroformio (24:1) e mescolare capovolto per 10 minuti. Centrifugare a 24 °C a 12.000 x g per 10 minuti, pipettare il surnatante e trasferire in una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
    5. Aggiungere 60 μL di soluzione 5 M di NaCl e 1 ml di etanolo assoluto e mescolare capovolto. Congelare a -20 °C per 30 minuti e centrifugare a 24 °C e 9.000 x g per 5 min.
    6. Scartare il surnatante, aggiungere 1 ml di soluzione di etanolo al 70% e lasciare a temperatura ambiente per 1-2 ore. Centrifugare a 24 °C, 9.000 x g per 5 minuti, scartare il surnatante, aspirare la soluzione di etanolo in eccesso e asciugare all'aria per 5 minuti.
    7. Aggiungere 100 μL di acqua sterile per sciogliere, misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro e congelare in un congelatore a -4 °C per la conservazione a lungo termine.
    8. Configurare il sistema di reazione RT-PCR. Preparare la seguente miscela di reazione per 10 μL contenente 5 μL di 2x PCRMix, 0,25 μL ciascuno di primer diretto e inverso, 1 μL di DNA (100 ng/ μL) e 3,5 μL di H2O.
  2. Impostare il programma PCR come da Tabella 1. Il programma PCR per tutte le isoforme era di 95 °C per 5 min 32x (95 °C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 1 min) e 72 °C per 5 min. Separare i prodotti su gel di agarosio TAE-1,5% e fotografare9. Verificare il genotipo S specificato utilizzando il DNA genomico.

Risultati

Per gli esperimenti fatti qui, sono stati selezionati fiori maturi, le antere sono state raccolte, essiccate in un forno e il polline è stato germinato a 28 ° C per 12 ore. La vitalità del polline e i tassi di germinazione sono stati quantificati come mostrato nella Figura 1.

Gli agrumi sono stati impollinati manualmente e la compatibilità e l'incompatibilità del polline sono state valutate utilizzando la colorazione blu all'anilina e la microscopia a fluores...

Discussione

Nelle colture da frutto, sia la partenocarpia che l'SI sono tratti importanti perché aprono la strada a frutti senza semi - una caratteristica molto apprezzata dai consumatori. L'autoincompatibilità promuove il rifiuto dell'autopolline e, quindi, impedisce la consanguineità20. Tra gli agrumi, il pummelo è una varietà auto-incompatibile7. Quasi il 40% di tutte le specie di angiosperme presenta SI21. Questa caratteristica impedisce l'allegagione, ...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo progetto è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
absolute ethanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218
Aniline blueSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd
Boric acid, H3BO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10004818
Brown bottleLabgic Technology Co., Ltd
Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd80029062
Centrifugal tubeLabgic Technology Co., Ltd
centrifuge tubesLabgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0(CAS)
DroppingJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTASinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009617
ForcepsLUXIANZI Biotechnology Co., Ltd
formaldehydeSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10010018
Fully automatic sample fast grinderShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-96
glacial acetic acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218
Grinding TubeShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10003218
Isopropyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80109218
labelM&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
Leica DMi8Shanghai Leica Co.,Ltd21903797
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
MICROSCOPE Cover glassZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
NaClSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10019318
paper clipsM&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
pencilM&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
pollinator brushShanghai Yimei Plastics Co., Ltd
Polyethylene glycol, PEG 6000Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., LtdDH229-1
Polyethylene glycol, PEG-4000Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd1521GR500
Potassium hydroxide, KOHSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017008
Potassium nitrate, KNO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017218
ScalpelJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
SlideZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
Sodium hydroxide, NAOHSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10019718
SucroseSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10021418
sulfate paperTaizhou Jinnong Mesh Factory
Thermostat water bathShanghai Jinghong Experimental Equipment Co., LtdL-909193
TrichloromethaneSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10006818
Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
zip lock bagsM&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
β-MercaptoethanolGEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)

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