JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол обеспечивает быстрый метод определения совместимости и несовместимости пыльцы у сортов цитрусовых.

Аннотация

Цитрусовые используют самонесовместимость на основе S-РНКазы для отказа от самопыльцы и, следовательно, нуждаются в близлежащих деревьях-опылителях для успешного опыления и оплодотворения. Однако определение подходящих сортов для использования в качестве опылителей является трудоемким процессом. Чтобы решить эту проблему, мы разработали быстрый метод идентификации совместимых с опылением сортов цитрусовых, который использует электрофорез в агарозном геле и окрашивание анилиновым синим. Совместимость пыльцы определяется на основе идентификации S-генотипов путем выделения общей ДНК и проведения анализов генотипирования на основе ПЦР с конкретными праймерами. Дополнительно стайлы собирают через 3-4 дня после ручного опыления, и проводят окрашивание анилиновым синим. Наконец, состояние роста пыльцевых трубок наблюдается с помощью флуоресцентного микроскопа. Совместимость и несовместимость пыльцы можно установить, наблюдая за тем, является ли рост пыльцевой трубки нормальным или подавленным соответственно. Благодаря своей простоте и экономичности этот метод является эффективным инструментом для определения пыльцевой совместимости и несовместимости различных сортов цитрусовых для установления групп несовместимости и взаимосвязей несовместимости между различными сортами. Этот метод предоставляет информацию, необходимую для успешного выбора подходящих деревьев-опылителей, и, таким образом, облегчает создание новых садов и выбор подходящих родителей для селекционных программ.

Введение

Самонесовместимость (СИ) является генетически контролируемым механизмом, присутствующим примерно у 40% покрытосеменных видов. В этом процессе пестик отторгает пыльцу растения с тем же генотипом SI и, таким образом, препятствует самооплодотворению 1,2. Ma jia pummelo — местный сорт в провинции Цзинагсу, Китай, с превосходными качествами крупных розовых плодов, богатым содержанием сока, кисло-сладким вкусом и толстой кожурой3. Несмотря на то, что СИ способствует ауткроссингу, он отрицательно влияет на урожайность и качество плодов4 и требует подходящих деревьев-опылителей с различными генотипами СИ для надежных темпов завязывания плодов и высоких урожаев. В настоящее время существует два основных типа СИ: спорофитная самонесовместимость (SSI), представленная Brassicaceae, и гаметофитная самонесовместимость (GSI), представленная Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae и Solanaceae 5,6,7,8.

Цитрусовые являются одной из самых важных фруктовых культур в мире. Система GSI на основе S-РНКазы содержится во многих образцах цитрусовых и отрицательно влияет на скорость завязывания плодов9. В этой системе SI контролируется локусом S, одним полиморфным локусом с двумя комплексными аллелями, которые несут S-детерминанты пестика и S-детерминанты пыльцы 7. Женский детерминант — S-рибонуклеаза (S-РНКаза), а мужской — F-бокс S-локуса (SLF)7. Клетки пестика секретируют белки S-РНКазы. Несобственные S-РНКазы распознаются белками SLF, что приводит к убиквитинированию и деградации несобственных S-РНКаз путем протеасомы 26S. Напротив, собственные S-РНКазы способны накапливать и ингибировать рост пыльцевой трубки (PT), поскольку они уклоняются от белков SLF и, следовательно, предотвращают убиквитинизацию10,11,12,13.

Здесь мы сообщаем о методе in vivo, который полезен для идентификации S-генотипов и степеней совместимости и несовместимости пыльцы. Протокол включает в себя извлечение общей ДНК из листьев и прогнозирование S-генотипа с использованием S-специфических праймеров. Кроме того, окрашивание анилиновым синим цветом и флуоресцентная микроскопия с последующим ручным опылением свидетельствуют о степени совместимости и несовместимости. Процедура опыления semi in vivo, которая включает ручное опыление цветов в лаборатории14,15, также была адаптирована для оценки степеней самосовместимости и несовместимости. Тем не менее, мы также использовали полевое опыление с последующим упаковыванием цветов в мешки, чтобы избежать загрязнения нежелательной пыльцой, чтобы пыльцевые трубки развивались в естественных условиях. Этот протокол прост и понятен и предоставляет информацию, необходимую для успешного выбора подходящих деревьев-опылителей.

протокол

1. Подготовка к окрашиванию анилиновым синим

  1. Подготовьте для эксперимента следующие реагенты и инструменты: кисть для опылителей, пинцет, карандаш, сульфатную бумагу, мешок для опыления, пакеты с застежкой-молнией, канцелярские скрепки, формальдегид, ледяную уксусную кислоту, абсолютный этанол, центрифужные трубки, щипцы, капельницы для клея, предметные стекла, покровные стекла, скальпели и полиэтиленгликоль.
  2. Приготовьте среду для проращивания in vitro, содержащую 0,02% MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% Ca(NO 3)2, 0,01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 и 15% сахарозы. Отрегулируйте pH до 6,0-6,2 с помощью KOH. Используйте магнитную мешалку, так как PEG-4,000 трудно растворить.
  3. Приготовьте фиксирующий раствор Карнуа, представляющий собой абсолютный этанол и ледяную уксусную кислоту, смешанные в соотношении 3:1. Приготовьте фиксирующий раствор FAA, который состоит из 40% формальдегида, 80% этанола и ледяной уксусной кислоты (1:8:1). Приготовьте 4 М гидроксида натрия (NaOH) и раствор анилинового синего, который представляет собой 0,1% анилинового синего в 0,1 М K3PO4. Используйте янтарную бутылку для хранения раствора анилинового синего, потому что он чувствителен к свету.

2. Сбор пыльцы

  1. Заранее знайте период цветения экспериментальных деревьев (Ma jia pummelo в этом исследовании). Соберите зрелые нераскрывшиеся цветки от начала периода цветения до пиковой стадии цветения, и положите их в пакет с застежкой-молнией. Цветы можно хранить при температуре 4 °C в холодильнике в течение 24 часов.
  2. Отнесите цветы в лабораторию. Используйте пинцет, чтобы собрать пыльники, и поместите их в чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу. Собирают пыльники от 20 до 30 цветков.
  3. Чашку Петри, содержащую пыльники, поместить в духовку с температурой 28 °C на 24 часа, пока пыльцевые зерна не высохнут. Подробную информацию об организации цветов см. в Hu et al.9.
  4. Поместите высушенную пыльцу в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Храните пыльцу в герметичном пакете с застежкой-молнией, содержащем меняющий цвет силикагель (влагопоглотитель). Закройте пакет, и пометьте пакет названием сорта пыльцы и датой хранения. Высушенную пыльцу можно хранить в холодильнике при температуре -20 °C в течение 96 недель16.

3. Тест на прорастание пыльцы in vitro

  1. Налейте 300 мкл жидкой среды в чашку для культивирования клеток или крышку центрифужной пробирки объемом 2 мл и равномерно посыпьте пыльцу с помощью щетки для опыления. Инкубируют пыльцу при 28 °C в увлажненной темной среде в течение 12 часов.
  2. Снимите верхний 1 мм наконечника наконечника пипетки объемом 1 000 мкл. С помощью пипетки поглотите пыльцу с небольшим количеством культурального раствора и переместите ее в центр предметного стекла микроскопа. Накройте его покровным стеклом. Наблюдайте за образцом с помощью перевернутого микроскопа, используя 10-кратный объектив.
  3. Выполните три независимые репликации, используя примерно одинаковую плотность пыльцы для каждой реплики17. Визуально управляйте количеством пыльцы, убедившись, что вся чашка Петри покрыта пыльцой и что каждая чашка Петри имеет почти равное количество пыльцы.
  4. Пророщенная пыльца образует пыльцевую трубку длиной примерно в два раза больше ее диаметра. Рассчитайте коэффициент прорастания по 20 полям зрения, что дает процент проросшей пыльцы во всех пыльцевых полях.

4. Опыление

  1. Выбирайте для опыления солнечный день без ветра. Выберите 10 полностью развитых бутонов, которые вот-вот раскроются, осторожно снимите лепестки и позаботьтесь о том, чтобы не повредить их.
  2. Используйте щетку для опыления, чтобы распространить достаточное количество жизнеспособной пыльцы на поверхность рыльца, и следите за тем, чтобы не повредить пестик. Для самоопыления используйте пыльцу того же растения/сорта. Для перекрестного опыления используют пыльцу растения с другим генотипом.
  3. Накройте опыляемые цветы сульфатным бумажным пакетом. Используйте канцелярскую скрепку, чтобы запечатать пакет и предотвратить опыление генотипически различными пыльцами.
  4. Напишите на этикетке название вида, а также количество и время опыления. Повесьте этикетку на ветки возле опыляемых цветков.

5. Отбор проб, фиксация и консервация

  1. Снимите пакеты для опыления примерно через 3-4 дня после опыления, а опыляемые цветы соберите в пакеты с застежкой-молнией.
  2. Немедленно удалите лепестки, цветоложи и завязи с цветков и погрузите сросшиеся в стигмы рыльца в центрифужную пробирку, содержащую свежеприготовленный фиксирующий раствор. Инкубируйте рыльца и стигмы в фиксирующем растворе в течение ночи при температуре 4 °C.
  3. На следующий день откажитесь от фиксирующего раствора и промойте рыльца и укладки два-три раза в 95% этаноле.
  4. Перенесите стили в 70% раствор этанола. Убедитесь, что образец полностью погружен в раствор. Стили на этом этапе можно хранить при температуре 4 °C в течение 1-2 месяцев.

6. Окрашивание анилиновым синим цветом

  1. Промойте образцы стиля, хранящиеся в 70% этаноле, дистиллированной водой три-четыре раза. Погрузить в раствор NaOH 4 М, запечатать и инкубировать на водяной бане с температурой 65 °C в течение 60 минут. На этом этапе цвет стиля меняется с желто-белого на оранжево-красный.
  2. Замочите стили в дистиллированной воде на 30 минут. Откажитесь от дистиллированной воды и промойте стили дистиллированной водой три-четыре раза или до тех пор, пока цвет стиля не станет желтым.
  3. Поместите образец в пробирку объемом 10 мл, добавьте анилиновый синий до тех пор, пока образец не будет погружен, и красьте в течение 12 часов в темноте.
  4. Наблюдайте за ростом пыльцевой трубки с помощью флуоресцентного микроскопа.

7. Флуоресцентная микроскопия

  1. Перед наблюдением за образцами поместите предметное стекло на плоский стол и добавьте две-три капли полиэтиленгликоля на поверхность предметного стекла.
  2. Смойте стиль с дистилляцией. С помощью скальпеля разделите его на две половинки вдоль продольной оси. Положите одну половину стиля на предметное стекло и накройте покровным стеклом.
  3. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа над апертурой и визуализируйте с помощью 10-кратного объектива. Используйте фильтр DAPI (возбуждение: 325-375 нм; излучение: 435-485 нм). Соблюдайте пять стилей для каждого типа опыления. Наблюдайте за ростом пыльцевой трубки.

8. Идентификация S-генотипа на основе ПЦР

  1. Извлеките геномную ДНК из образца стигмы, используя методCTAB 18.
    1. Собранные листья поместите в центрифужную пробирку объемом 2 мл и заморозьте в жидком азоте. Приготовьте буфер HCl:EDTA:NaCl:H2O в соотношении 1:1:3:5 и смесь хлороформного изоамилового спирта в соотношении 24:1
    2. Добавьте 10 мл приготовленного буфера, 0,2 г CTAB и 200 мкл меркаптоэтанола в центрифужную пробирку объемом 50 мл и поставьте их на водяную баню при 65 °C на 5 мин до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и прозрачным.
    3. Положите лезвия в ступку, добавьте замороженные образцы, добавьте жидкий азот и измельчите. Поместите измельченный образец в центрифужную пробирку объемом 2 мл, добавьте 600 мкл смеси CTAB, поставьте на водяную баню при 65 °C на 60 минут и перемешивайте вверх дном каждые 30 минут.
    4. Добавьте 700 мкл смеси хлороформного изоамилового спирта (24:1) и перемешивайте вверх дном в течение 10 мин. Центрифугу при 24 °C при 12 000 x g в течение 10 мин, пипетку надосадочную жидкость и переложить в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    5. Добавьте 60 мкл 5 М раствора NaCl и 1 мл абсолютного этанола и перемешайте вверх дном. Замораживание при -20 °C в течение 30 мин и центрифуга при 24 °C и 9 000 x g в течение 5 мин.
    6. Надосадочную жидкость выбросить, добавить 1 мл 70% раствора этанола и оставить при комнатной температуре на 1-2 часа. Центрифугу при 24 °C, 9 000 x g в течение 5 мин, удалить надосадочную жидкость, отспирировать излишки раствора этанола и высушить на воздухе в течение 5 мин.
    7. Добавьте 100 мкл стерильной воды для растворения, измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра и заморозьте в морозильной камере с температурой -4 °C для длительного хранения.
    8. Настройте реакционную систему ОТ-ПЦР. Приготовьте следующую реакционную смесь для 10 мкл, содержащую 5 мкл 2x PCRMix, по 0,25 мкл прямого и обратного праймера, 1 мкл ДНК (100 нг/мкл) и 3,5 мкл H2O.
  2. Настройте программу ПЦР в соответствии с таблицей 1. Программа ПЦР для всех изоформ составляла 95 °C в течение 5 мин 32x (95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 1 мин) и 72 °C в течение 5 мин. Разделите продукты на 1,5% TAE-агарозные гели и сфотографируйте9. Проверьте указанный S-генотип с помощью геномной ДНК.

Результаты

Для проведенных здесь экспериментов отбирали зрелые цветки, собирали пыльники, сушили в печи и проращивали пыльцу при 28°С в течение 12 часов. Жизнеспособность пыльцы и скорость прорастания были количественно определены, как показано на рисунке 1.

Цитрусов...

Обсуждение

В плодовых культурах как партенокарпия, так и SI являются важными признаками, потому что они прокладывают путь к бессемянным плодам - черта, которая высоко ценится потребителями. Самонесовместимость способствует отторжению самопыльцы и, таким образом, предотвращает инбридинг...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что им нечего раскрывать.

Благодарности

Этот проект был финансово поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (32122075, 32072523).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
absolute ethanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218
Aniline blueSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd
Boric acid, H3BO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10004818
Brown bottleLabgic Technology Co., Ltd
Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd80029062
Centrifugal tubeLabgic Technology Co., Ltd
centrifuge tubesLabgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0(CAS)
DroppingJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTASinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009617
ForcepsLUXIANZI Biotechnology Co., Ltd
formaldehydeSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10010018
Fully automatic sample fast grinderShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-96
glacial acetic acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218
Grinding TubeShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10003218
Isopropyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80109218
labelM&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
Leica DMi8Shanghai Leica Co.,Ltd21903797
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
MICROSCOPE Cover glassZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
NaClSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10019318
paper clipsM&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
pencilM&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
pollinator brushShanghai Yimei Plastics Co., Ltd
Polyethylene glycol, PEG 6000Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., LtdDH229-1
Polyethylene glycol, PEG-4000Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd1521GR500
Potassium hydroxide, KOHSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017008
Potassium nitrate, KNO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10017218
ScalpelJiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
SlideZhejiang Shitai Industrial Co., Ltd
Sodium hydroxide, NAOHSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10019718
SucroseSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10021418
sulfate paperTaizhou Jinnong Mesh Factory
Thermostat water bathShanghai Jinghong Experimental Equipment Co., LtdL-909193
TrichloromethaneSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10006818
Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
zip lock bagsM&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
β-MercaptoethanolGEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)

Ссылки

  1. Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
  2. Goldberg, E. E., et al. Species selection maintains self-incompatibility. Science. 330 (6003), 493-495 (2010).
  3. Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
  4. Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
  5. Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
  6. Meng, X., Sun, P., Kao, T. S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata. Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).
  7. Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
  8. Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
  9. Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
  10. Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
  11. Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
  12. Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
  13. Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
  14. Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
  15. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. . Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
  16. Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
  17. Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , (2019).
  18. Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
  19. Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
  20. de Nettancourt, D. Incompatibility in angiosperms. Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).
  21. Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
  22. Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
  23. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

196SS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены