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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Sulla base di esperimenti in vitro , questo studio ha rivelato il meccanismo della crocetina nel riparare il danno da stress ossidativo dei cardiomiociti influenzando la mitofagia, in cui la via di segnalazione PINK1 / Parkin svolge un ruolo importante.

Abstract

Questo studio mirava a esplorare l'effetto protettivo dello stress ossidativo della crocetina sulle cellule miocardiche H9c2 mediate da H 2 O2attraverso esperimenti in vitro e ad esplorare ulteriormente se il suo meccanismo è correlato all'impatto della mitofagia. Questo studio mirava anche a dimostrare l'effetto terapeutico dell'acido di cartamo sullo stress ossidativo nei cardiomiociti ed esplorare se il suo meccanismo è correlato all'effetto della mitofagia. Qui, è stato costruito un modello di stress ossidativo basato su H 2 O2e valutato il grado di danno da stress ossidativo dei cardiomiociti rilevando i livelli di lattato deidrogenasi (LDH), creatina chinasi (CK), malondialdeide (MDA), superossido dismutasi (SOD), catalasi (CAT) e glutatione perossidasi (GSH Px). Il colorante fluorescente DCFH-DA (delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), il colorante JC-1 e il colorante TUNEL sono stati impiegati per valutare il danno mitocondriale e l'apoptosi. Il flusso autofagico è stato misurato trasfettando l'adenovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Le proteine correlate alla mitofagia sono state quindi rilevate tramite western blotting e immunofluorescenza. Tuttavia, la crocetina (0,1-10 μM) potrebbe migliorare significativamente la vitalità cellulare e ridurre l'apoptosi e il danno da stress ossidativo causato da H 2 O2. Nelle cellule con eccessiva attivazione autofagica, la crocetina potrebbe anche ridurre il flusso autofagico e l'espressione delle proteine correlate alla mitofagia PINK1 e Parkin, e invertire il trasferimento di Parkin ai mitocondri. La crocetina potrebbe ridurre il danno da stress ossidativo mediato da H 2 O2e l'apoptosi delle cellule H9c2, e il suo meccanismo era strettamente correlato alla mitofagia.

Introduzione

L'infarto miocardico acuto (IMA) è una necrosi miocardica pericolosa per la vita causata da ischemia grave e persistente e ipossia alle arterie coronarie 1,2. L'intervento coronarico percutaneo (PCI) è una delle strategie terapeutiche di prima linea per l'IMA e di solito protegge i cardiomiociti dal danno ischemico 3,4. Il miocardio distale mancherà di apporto di sangue e ossigeno se non trattato tempestivamente ed efficacemente dopo AMI, che porta a necrosi ischemica e ulteriori complicanze cardiovascolari 5,6. Promuovere il recupero dei cardiomiociti e ridurre al minimo il danno miocardico irreversibile dopo aver perso l'opportunità chirurgica PCI è stato un hotspot di ricerca. Dopo l'IMA, i cardiomiociti sono in uno stato di ischemia e ipossia, con conseguente inibizione della fosforilazione ossidativa mitocondriale, riduzione di NAD+ a NADPH e aumento della riduzione di singoli elettroni7. Di conseguenza, la reazione di riduzione incompleta dell'ossigeno genera un eccesso di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e alla fine porta a danni da stress ossidativo ai cardiomiociti8. Un eccessivo accumulo di ROS innesca la perossidazione lipidica, interrompendo ulteriormente la struttura e la funzione delle membrane mitocondriali. Il risultato è un'apertura continua dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale e una diminuzione del potenziale della membrana mitocondriale, inducendo apoptosi e necrosi.

Gli inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE), i bloccanti del recettore dell'angiotensina (ARB), gli inibitori dei β-adrenocettori, gli antagonisti dell'aldosterone e altri farmaci standard nell'AMI possono aiutare a migliorare la funzione cardiaca dopo infarto miocardico e prevenire il verificarsi di eventi maligni, come aritmie e rimodellamento ventricolare sinistro9. Tuttavia, la sopravvivenza post-infarto e la prognosi sono fortemente influenzate dalle dimensioni dell'infarto e non sono stati raggiunti risultati soddisfacenti per ridurre l'apoptosi dei cardiomiociti10,11. Pertanto, lo sviluppo di farmaci per promuovere il recupero dei cardiomiociti dopo l'infarto miocardico è diventato un problema urgente.

La medicina tradizionale è stata fonte di ispirazione per la moderna ricerca farmaceutica per molti anni12,13,14,15. La medicina tradizionale cinese (MTC) ha una lunga storia nel trattamento dell'IMA e una serie di studi randomizzati di controllo negli ultimi anni hanno confermato che la MTC può effettivamente migliorare la prognosi dei pazienti16,17. Secondo la teoria TCM, l'AMI è causata dalla stasi del sangue18,19, quindi i farmaci per promuovere la circolazione sanguigna sono solitamente utilizzati per il trattamento dell'AMI nella fase acuta20. Tra questi, si ritiene che lo zafferano abbia un potente effetto sull'attivazione e sulla stasi del sangue ed è spesso usato nel trattamento acuto dell'AMI. La crocetina, un componente importante dello zafferano, può svolgere un ruolo chiave nella protezione dei cardiomiociti21.

In questo studio, le cellule miocardiche H9c2 sono state indotteda H 2 O2 per simulare l'ischemia/riperfusione miocardica, che causa una lesione cardiomiocitaria di AMI, e la crocetina è stata utilizzata come intervento per studiare il suo effetto protettivo contro il danno miocardico indotto da stress ossidativo. Il meccanismo della crocetina che protegge i cardiomiociti è stato ulteriormente esplorato attraverso la mitofagia. Ancora più importante, questo articolo fornisce un riferimento per l'approccio tecnico allo studio della mitofagia e descrive l'intera procedura sperimentale in dettaglio.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati eseguiti nel Laboratorio di Fisiologia presso l'Università di Medicina Cinese di Pechino, in Cina. Tutti i metodi di studio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti dell'Università di Pechino.

1. Coltura cellulare

  1. Aggiungere il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina al terreno di base modificato Eagle medium (DMEM) di Dulbecco (con 4,5 g/L di D-glucosio, 4,g.g/L di L-glutammina e 110 mg/L di piruvato di sodio; vedere la Tabella dei materiali) per preparare il terreno completo DMEM.
  2. Scongelare le cellule miocardiche H9c2 congelate con azoto liquido (vedi Tabella dei materiali) in acqua calda a 37 °C con una rapida e uniforme agitazione fino a quando il ghiaccio si scioglie.
  3. Trasferire le celle in una provetta da centrifuga e aggiungere quattro volte il volume del mezzo completo DMEM. Centrifugare a 358 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante con una pipetta.
  4. Diluire la sospensione cellulare ottenuta con terreno di coltura, soffiare delicatamente e inoculare le cellule in un matraccio di coltura. Coltura in incubatrice a 37 °C con 5% di CO2.

2. Determinazione della vitalità cellulare

  1. Sciogliere la crocetina (vedere la tabella dei materiali) in dimetilsolfossido (DMSO) a concentrazioni di 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM e 200 mM.
  2. Dissociare le cellule miocardiche H9c2 mediante tripsina, quindi neutralizzare la miscela con DMEM mezzo completo.
  3. Trasferire le celle in una provetta da centrifuga e centrifugare a 179 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e mescolare le cellule nel mezzo completo DMEM soffiando delicatamente.
  4. Contare le cellule usando una piastra di conteggio delle cellule del sangue22 (vedere Tabella dei materiali) e diluirle a 5 × 104 cellule / ml con DMEM mezzo completo.
  5. Dividere le celle in nove parti uguali. Aggiungere DMSO (diluito in un rapporto 1:1.000 con DMEM mezzo completo) al gruppo di controllo e aggiungere diverse concentrazioni di crocetina ai gruppi rimanenti con un rapporto di 1:1.000.
  6. Seminare le cellule in piastre da 96 pozzetti a 100 μL per pozzetto. Scartare il surnatante dopo l'incubazione per 24 ore e lavare le cellule tre volte con PBS.
  7. Dopo aver aggiunto 100 μL di terreno basale DMEM, incubare le cellule per 4 ore e aggiungere 20 μL di MTS (vedere Tabella dei materiali).
  8. Incubare le cellule per altre 2 ore, misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 490 nm e calcolare la vitalità cellulare.
    NOTA: Vitalità cellulare = (OD trattato - OD vuoto) / (Controllo OD - OD vuoto) × 100.

3. Determinazione della lattato deidrogenasi (LDH), creatina chinasi (CK), malondialdeide (MDA), superossido dismutasi (SOD), glutatione perossidasi (GSH Px) e catalasi (CAT)

  1. Seminare le cellule H9c2 in una piastra a 6 pozzetti ad una densità di 1 × 105 celle. Raccogliere il surnatante dopo l'intervento e rilevare i livelli di LDH e SOD, secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
  2. Raccogliere il surnatante e lavarlo con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) una volta. Aggiungere il lisato cellulare al piatto di coltura e lasciarlo riposare sul ghiaccio per 20 minuti. Raccogliere il liquido dal piatto di coltura in una provetta da centrifuga.
  3. Rilevare i livelli di CK, MDA, GSH-Px e CAT secondo le istruzioni del produttore23 (vedere la tabella dei materiali e il file supplementare 1).
  4. Rilevare la concentrazione proteica totale della lisi con il metodo dell'acido bicinconinico (BCA) per correggere la concentrazione di CK, MDA, GSH-Px e CAT24 (vedere Tabella dei materiali).

4. Determinazione del ROS

  1. Seminare le cellule H9c2 in una piastra da 48 pozzetti ad una densità di 5 × 103 celle. Diluire DCFH-DA (vedere la tabella dei materiali) in rapporto 1:1.000 con il mezzo privo di siero. Scartare il surnatante cellulare e lavare la cellula due volte con un mezzo privo di siero.
  2. Aggiungere 150 μL di DCFH-DA diluito in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 20 minuti. Lavare le cellule tre volte con un mezzo privo di siero e acquisire immagini al microscopio a fluorescenza (vedere Tabella dei materiali).

5. Rilevazione del potenziale di membrana mitocondriale

  1. Rilevare il potenziale di membrana mitocondriale utilizzando un kit di analisi del potenziale di membrana mitocondriale JC-125 (vedere Tabella dei materiali). Scartare il terreno di coltura e lavarli una volta con terreno privo di siero.
  2. Aggiungere la soluzione di lavoro JC-1 a ciascun tubo e mescolarli bene. Incubare a 37 °C per 20 minuti e lavare le cellule due volte con tampone colorante JC-1. Aggiungi un mezzo completo a ciascun pozzetto e cattura fotografie al microscopio a fluorescenza.

6. Saggio di colorazione TUNEL

  1. Utilizzare un kit di analisi dell'apoptosi TUNEL (vedi Tabella dei materiali) per determinare i tassi di apoptosi26. Scartare il surnatante e lavare il pellet una volta con un mezzo privo di siero.
  2. Aggiungere la soluzione di fissazione cellulare e lavarli con PBS una volta dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti.
  3. Aggiungere lo 0,3% di tritone-100 a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Lavare le celle con PBS due volte. Aggiungere la soluzione di lavoro di rilevamento TUNEL e incubare a 37 °C al buio per 60 minuti.
  4. Aggiungere una compressa sigillante di tempra antifluorescenza contenente 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; vedere Tabella dei materiali) e scattare fotografie al microscopio a fluorescenza.

7. Monitoraggio del flusso autofagico mediante trasfezione dell'adenovirus mCherry GFP-LC3B

  1. Sostituire metà del mezzo in ciascun pozzetto con terreno fresco. Aggiungere l'adenovirus Ad-mCherry GFP-LC3B (molteplicità di infezione [MOI] di 2) al terreno di coltura e aggiungere 5 μg/ml di polibrene (vedere Tabella dei materiali) per migliorare l'efficienza dell'infezione.
  2. Sostituire il mezzo fresco dopo 24 ore e osservare l'espressione della proteina fluorescente al microscopio confocale.
  3. Coltivare le cellule con le stesse condizioni della sezione 1 dopo aver confermato il successo dell'infezione virale e acquisire immagini al microscopio confocale27.
    NOTA: Più del 20% delle cellule ha mostrato fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP), indicando un'infezione riuscita.

8. Analisi Western blot

  1. Raccogliere le cellule per l'estrazione di proteine intere e lizzarle (RIPA, inibitore della proteasi e inibitore della fosfatasi = 100: 1: 1; vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio per 30 minuti.
  2. Aggiungere 5x tampone di carico proteico al campione proteico dopo la quantificazione delle proteine e far bollire i campioni per 10 minuti.
  3. Elettroforese i campioni che contengono quantità uguali di proteine con gel di elettroforesi su gel di sodio dodecil-solfato poliacrilammide (SDS-PAGE)28. Quindi, trasferire i campioni su membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF).
  4. Bloccare le membrane PVDF per 1 ora con latte scremato in polvere al 5% e incubare con l'anticorpo primario (PINK1, Parkin; vedi tabella dei materiali) a 4 °C durante la notte e l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Rileva le bande target utilizzando la soluzione di chemiluminescenza avanzata (ECL) e il sistema di rilevamento della chemiluminescenza. Utilizzare il software Image J per quantificare le bande tramite densitometria28.

9. Rilevazione della traslocazione mitocondriale di Parkin mediante immunofluorescenza

  1. Osservare la colocalizzazione del Parkin con i mitocondri mediante doppia colorazione a immunofluorescenza. Scartare il surnatante cellulare da ciascun gruppo e lavarli tre volte con PBS.
  2. Fissare le celle per 10 minuti a temperatura ambiente con paraformaldeide al 4% e aggiungere lo 0,1% di tritone-100 in PBS.
  3. Bloccare con una soluzione a blocchi senza animali (vedi Tabella dei materiali) per 1 ora per evitare il legame non specifico tra proteine e anticorpi e ridurre il fondo di fluorescenza.
  4. Incubare con un anticorpo primario (Parkin e Tom20; vedere Tabella dei materiali) a 4 °C durante la notte.
  5. Aggiungere un anticorpo secondario fluorescente (vedere Tabella dei materiali) e incubare al buio per 1 ora.
  6. Aggiungere le compresse di tempra antifluorescenza contenenti DAPI e acquisire immagini al microscopio confocale.

10. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software di grafica e analisi (vedi Tabella dei materiali).
  2. Confronta le variabili continue tra i gruppi utilizzando ANOVA unidirezionale. p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Effetti della crocetina sulla vitalità cellulare
La crocetina a 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM e 100 μM ha avuto un significativo effetto proliferativo sulle cellule, mentre la crocetina a concentrazioni superiori a 200 μM ha inibito significativamente la proliferazione delle cellule H9c2 (Figura 1A). Dopo 4 ore di trattamento con 400 μM H 2 O2, la vitalità cellulare è stata ridotta considerevolmente e la crocetina ha potuto inv...

Discussione

L'esplorazione di ingredienti efficaci da composti complessi di droghe naturali attraverso tecnologie avanzate è stata un punto focale della ricerca TCM29 e può fornire prove di laboratorio per il futuro sviluppo di farmaci dopo la verifica. Il cartamo è un farmaco rappresentativo nel trattamento di "promuovere la circolazione sanguigna e ridurre al minimo la stasi del sangue" ed è ampiamente usato nel trattamento dell'infarto miocardico30,31

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dalla Beijing Natural Science Foundation (n. 7202119) e dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82274380).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsinGibco2323363
1% Penicillin-streptomycinSigmaV900929
5x protein loading bufferBeijing Pulilai Gene TechnologyB1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirusBeyotimeC3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0513
Animal-free blocking solutionCST15019s
Anti-Parkin antibodySanta Cruzsc-32282
Anti-PINK1 antibodyABclonalA11435
Anti-TOM20 antibodyABclonalA19403
Anti-β-actin  antibodyABclonalAC026
BCA protein assay kitKeyGEN BiotechKGP902
Blood cell counting plateServicebioWG607
CAT assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Chemiluminescence detection systemShanghai Qinxiang Scientific Instrument FactoryChemiScope 6100
CK assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10)MacklinC6129
CrocetinChengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tabletsZhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9557
DCFH-DABeyotimeS0033S
DMSOSolarbioD8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Gibco8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solutionNCM BiotechP10100
Fetal bovine serum (FBS)Corning-Cellgro35-081-CV
GraphPad Prism 7.0 https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA005-1-2
H9c2 myocardial cellsBeijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kitLABLEADJ22202
LDH assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA020-2-2
MDA assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-2-2
MethanolAladdinA2114057
MTS assayPromegaG3581
PerhydrolG-cloneCS7730
Phosphatase inhibitorCWBIOCW2383
PolybreneBeyotimeC0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranesMilliporeISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis bufferSolarbioR0010
SDS-PAGE gelsShanghai Epizyme Biomedical TechnologyPG112
SDS-PAGE running buffer powderServicebioG2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powderServicebioG2017-1L
SOD assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-2-2
Tris-buffered saline powderServicebioG0001-2L
Triton X-100SigmaSLCC9172
TUNEL apoptosis assay kitBeyotimeC1086
Tween-20SolarbioT8220

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