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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Basée sur des expériences in vitro , cette étude a révélé le mécanisme de la crocétine dans la réparation des dommages causés par le stress oxydatif des cardiomyocytes en influençant la mitophagie, dans laquelle la voie de signalisation PINK1 / Parkin joue un rôle important.

Résumé

Cette étude visait à explorer l’effet protecteur contre le stress oxydatif de la crocétine sur les cellules myocardiques H9c2 médiéespar H2O2 par le biais d’expériences in vitro, et à explorer davantage si son mécanisme est lié à l’impact de la mitophagie. Cette étude visait également à démontrer l’effet thérapeutique de l’acide carthame sur le stress oxydatif dans les cardiomyocytes et à explorer si son mécanisme est lié à l’effet de la mitophagie. Ici, un modèlede stress oxydatif basé sur H 2 O2 a été construit et a évalué le degré de lésion de stress oxydatif des cardiomyocytes en détectant les niveaux de lactate déshydrogénase (LDH), de créatine kinase (CK), de malondialdéhyde (MDA), de superoxyde dismutase (SOD), de catalase (CAT) et de glutathion peroxydase (GSH Px). Le colorant fluorescent DCFH-DA, JC-1 et TUNEL ont été utilisés pour évaluer les dommages mitochondriaux et l’apoptose. Le flux autophagique a été mesuré par transfectation de l’adénovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Des protéines liées à la mitophagie ont ensuite été détectées par transfert Western et immunofluorescence. Cependant, la crocétine (0,1-10 μM) pourrait améliorer considérablement la viabilité cellulaire et réduire l’apoptose et les dommages causés par le stress oxydatif causés par H2O2. Dans les cellules à activation autophagique excessive, la crocétine pourrait également réduire le flux d’autophagie et l’expression des protéines liées à la mitophagie PINK1 et Parkin, et inverser le transfert de Parkin aux mitochondries. La crocétine pouvait réduire les dommages causés par le stress oxydatif médié par H2O2 et l’apoptose des cellules H9c2, et son mécanisme était étroitement lié à la mitophagie.

Introduction

L’infarctus aigu du myocarde (IAM) est une nécrose myocardique potentiellement mortelle causée par une ischémie et une hypoxie sévères et persistantes des artères coronaires 1,2. L’intervention coronarienne percutanée (ICP) est l’une des stratégies thérapeutiques de première intention pour l’IAM et protège généralement les cardiomyocytes contre les lésions ischémiques 3,4. Le myocarde distal manquera d’apport de sang et d’oxygène s’il n’est pas traité rapidement et efficacement après un IAM, ce qui entraîne une nécrose ischémique et d’autres complications cardiovasculaires 5,6. La promotion de la récupération des cardiomyocytes et la minimisation des lésions myocardiques irréversibles après avoir manqué l’opportunité chirurgicale PCI ont été un point chaud de la recherche. Après IAM, les cardiomyocytes sont dans un état d’ischémie et d’hypoxie, ce qui entraîne l’inhibition de la phosphorylation oxydative mitochondriale, la réduction du NAD+ en NADPH et l’augmentation de la réduction d’un seul électron7. En conséquence, la réaction de réduction incomplète de l’oxygène génère un excès d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et conduit finalement à des dommages de stress oxydatif aux cardiomyocytes8. Une accumulation excessive de ROS déclenche une peroxydation lipidique, perturbant davantage la structure et la fonction des membranes mitochondriales. Le résultat est une ouverture continue des pores de transition de perméabilité mitochondriale et une diminution du potentiel de la membrane mitochondriale, induisant l’apoptose et la nécrose.

Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA), les antagonistes des récepteurs de l’angiotensine (ARA), les inhibiteurs des récepteurs β-adrénergiques, les antagonistes de l’aldostérone et d’autres médicaments standard dans l’IAM peuvent aider à améliorer la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde et prévenir l’apparition d’événements malins, tels que les arythmies et le remodelage ventriculaire gauche9. Cependant, la survie et le pronostic post-infarctus sont grandement affectés par la taille de l’infarctus, et des résultats satisfaisants n’ont pas été obtenus pour réduire l’apoptose des cardiomyocytes10,11. Ainsi, le développement de médicaments pour favoriser la récupération des cardiomyocytes après un infarctus du myocarde est devenu un problème urgent.

La médecine traditionnelle est une source d’inspiration pour la recherche pharmaceutique moderne depuis de nombreuses années12,13,14,15. La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a une longue histoire dans le traitement de l’IAM, et une série d’essais contrôlés randomisés au cours des dernières années ont confirmé que la MTC peut effectivement améliorer le pronostic des patients16,17. Selon la théorie de la MTC, l’IAM est causée par la stase sanguine18,19, de sorte que les médicaments pour favoriser la circulation sanguine sont généralement utilisés pour le traitement de l’IAM dans la phase aiguë20. Parmi eux, le safran est censé avoir un effet puissant sur l’activation sanguine et la stase, et est souvent utilisé dans le traitement aigu de l’IAM. La crocétine, un composant majeur du safran, pourrait jouer un rôle clé dans la protection des cardiomyocytes21.

Dans cette étude, les cellules myocardiques H9c2 ont été induitespar H 2 O2 pour simuler l’ischémie / reperfusion myocardique, qui provoque une lésion cardiomyocytaire de l’IAM, et la crocétine a été utilisée comme intervention pour étudier son effet protecteur contre les lésions myocardiques induites par le stress oxydatif. Le mécanisme de la crocétine protégeant les cardiomyocytes a été exploré plus avant par mitophagie. Plus important encore, cet article fournit une référence pour l’approche technique de l’étude de la mitophagie et décrit l’ensemble de la procédure expérimentale en détail.

Protocole

Les expériences ont été réalisées au laboratoire de physiologie de l’Université de médecine chinoise de Pékin, en Chine. Toutes les méthodes d’étude ont été réalisées conformément aux directives et règlements pertinents de l’Université de Beijing.

1. Culture cellulaire

  1. Ajouter 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine au milieu basique Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco (avec 4,5 g/L de D-glucose, 4,g/L de L-glutamine et 110 mg/L de pyruvate de sodium; voir le tableau des matières) pour préparer le milieu complet de DMEM.
  2. Décongeler les cellules myocardiques H9c2 congelées à l’azote liquide (voir le tableau des matières) dans de l’eau tiède à 37 °C en remuant rapidement et uniformément jusqu’à ce que la glace fonde.
  3. Transférer les cellules dans un tube de centrifugation et ajouter quatre fois le volume du milieu complet DMEM. Centrifuger à 358 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
  4. Diluer la suspension cellulaire obtenue avec un milieu de culture, souffler doucement et inoculer les cellules dans une fiole de culture. Culture en incubateur à 37 °C avec 5% de CO2.

2. Détermination de la viabilité cellulaire

  1. Dissoudre la crocétine (voir le tableau des matières) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à des concentrations de 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM et 200 mM.
  2. Dissocier les cellules myocardiques H9c2 par la trypsine, puis neutraliser le mélange avec le milieu complet DMEM.
  3. Transférer les cellules dans un tube de centrifugation et centrifuger à 179 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et mélanger les cellules dans le milieu complet DMEM en soufflant doucement.
  4. Compter les cellules à l’aide d’une plaque de comptage des cellules sanguines22 (voir le tableau des matières) et les diluer à 5 × 104 cellules/ml avec un milieu complet DMEM.
  5. Divisez les cellules en neuf portions égales. Ajouter du DMSO (dilué dans un rapport de 1:1 000 avec un milieu complet de DMEM) au groupe témoin et ajouter différentes concentrations de crocétine aux groupes restants dans un rapport de 1:1 000.
  6. Ensemencer les cellules dans des plaques de 96 puits à 100 μL par puits. Jeter le surnageant après l’incubation pendant 24 h et laver les cellules trois fois avec du PBS.
  7. Après avoir ajouté 100 μL de milieu basal DMEM, incuber les cellules pendant 4 h et ajouter 20 μL de MTS (voir le tableau des matériaux).
  8. Incuber les cellules pendant encore 2 h, mesurer l’absorbance à une longueur d’onde de 490 nm et calculer la viabilité cellulaire.
    NOTE: Viabilité cellulaire = (DO traitée - OD vide) / (contrôle OD - OD blanc) × 100.

3. Détermination de la lactate déshydrogénase (LDH), de la créatine kinase (CK), du malondialdéhyde (MDA), de la superoxyde dismutase (SOD), de la glutathion peroxydase (GSH Px) et de la catalase (CAT)

  1. Ensemencer les cellules H9c2 dans une plaque à 6 puits à une densité de 1 × 105 cellules. Prélever le surnageant après l’intervention et détecter les taux de LDH et de SOD, conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  2. Recueillir le surnageant et le laver avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) une fois. Ajouter le lysat cellulaire à la capsule de culture et laisser reposer sur la glace pendant 20 min. Recueillir le liquide de la capsule de culture dans un tube à centrifuger.
  3. Détecter les niveaux de CK, MDA, GSH-Px et CAT conformément aux instructions du fabricant23 (voir le tableau des matériaux et le dossier supplémentaire 1).
  4. Détecter la concentration totale de protéines de la lyse par la méthode de l’acide bicinchoninique (BCA) pour corriger la concentration de CK, MDA, GSH-Px et CAT24 (voir le tableau des matériaux).

4. Détermination de la MDE

  1. Ensemencer les cellules H9c2 dans une plaque de 48 puits à une densité de 5 × 103 cellules. Diluer le DCFH-DA (voir le tableau des matières) dans un rapport de 1:1 000 avec le milieu sans sérum. Jetez le surnageant cellulaire et lavez-la deux fois avec un milieu sans sérum.
  2. Ajouter 150 μL de DCFH-DA dilué dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 20 min. Lavez les cellules trois fois avec un milieu sans sérum et capturez des images au microscope à fluorescence (voir Tableau des matériaux).

5. Détection du potentiel de la membrane mitochondriale

  1. Détecter le potentiel de la membrane mitochondriale à l’aide d’un kit d’essai de potentiel de membrane mitochondrialeJC-1 25 (voir le tableau des matériaux). Jetez le milieu de culture et lavez-le une fois avec un milieu sans sérum.
  2. Ajoutez la solution de travail JC-1 à chaque tube et mélangez-les bien. Incuber à 37 °C pendant 20 min et laver les cellules deux fois avec un tampon de coloration JC-1. Ajoutez un support complet à chaque puits et capturez des photographies au microscope à fluorescence.

6. Dosage de coloration TUNEL

  1. Utiliser une trousse de dosage de l’apoptose TUNEL (voir le tableau des matières) pour déterminer les taux d’apoptose26. Jeter le surnageant et laver la pastille une fois avec un milieu sans sérum.
  2. Ajouter la solution de fixation des cellules et les laver avec du PBS une fois après l’incubation à température ambiante pendant 30 min.
  3. Ajouter 0,3% de triton-100 à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 5 min. Lavez les cellules avec du PBS deux fois. Ajouter la solution de détection TUNEL et incuber à 37 °C dans l’obscurité pendant 60 min.
  4. Ajouter un comprimé d’étanchéité anti-fluorescence contenant du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; voir le tableau des matériaux) et prendre des photos au microscope à fluorescence.

7. Surveillance du flux autophagique par transfection de l’adénovirus mCherry GFP-LC3B

  1. Remplacer la moitié du milieu dans chaque puits par un milieu frais. Ajouter Ad-mCherry GFP-LC3B adénovirus (multiplicité de l’infection [MOI] de 2) au milieu de culture et ajouter 5 μg/mL de polybrène (voir le tableau des matières) pour améliorer l’efficacité de l’infection.
  2. Remplacez le milieu frais après 24 h et observez l’expression de la protéine fluorescente au microscope confocal.
  3. Culture des cellules dans les mêmes conditions que la section 1 après confirmation de la réussite de l’infection virale et capture d’images au microscope confocal27.
    REMARQUE: Plus de 20% des cellules présentaient une fluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP), indiquant une infection réussie.

8. Analyse Western blot

  1. Prélever des cellules pour l’extraction de protéines entières et les lyser (RIPA, inhibiteur de protéase et inhibiteur de phosphatase = 100:1:1; voir le tableau des matériaux) sur de la glace pendant 30 min.
  2. Ajouter 5x tampon de charge protéique à l’échantillon de protéines après quantification des protéines et faire bouillir les échantillons pendant 10 min.
  3. Électrophorèse les échantillons qui contiennent des quantités égales de protéines avec les gels d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE)28. Ensuite, transférer les échantillons sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF).
  4. Bloquer les membranes PVDF pendant 1 h avec du lait écrémé en poudre à 5 % et incuber avec l’anticorps primaire (PINK1, Parkin; voir le tableau des matériaux) à 4 °C pendant une nuit et l’anticorps secondaire à température ambiante pendant 1 h.
  5. Détectez les bandes cibles à l’aide d’une solution de chimiluminescence améliorée (ECL) et du système de détection par chimiluminescence. Utilisez le logiciel Image J pour quantifier les bandes par densitométrie28.

9. Détection de la translocation mitochondriale de Parkin par immunofluorescence

  1. Observer la colocalisation de Parkin avec les mitochondries par double coloration par immunofluorescence. Jetez le surnageant cellulaire de chaque groupe et lavez-les trois fois avec du PBS.
  2. Fixez les cellules pendant 10 minutes à température ambiante avec 4% de paraformaldéhyde et ajoutez 0,1% de triton-100 dans du PBS.
  3. Bloquer avec une solution de bloc sans animal (voir le tableau des matériaux) pendant 1 h pour empêcher la liaison non spécifique entre les protéines et les anticorps et réduire le fond de fluorescence.
  4. Incuber avec un anticorps primaire (Parkin et Tom20; voir le tableau des matériaux) à 4 °C pendant une nuit.
  5. Ajouter un anticorps secondaire fluorescent (voir le tableau des matériaux) et incuber dans l’obscurité pendant 1 h.
  6. Ajoutez les comprimés de trempe anti-fluorescence contenant du DAPI et capturez des images au microscope confocal.

10. Analyse statistique

  1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et d’analyse (voir le tableau des matières).
  2. Comparez les variables continues entre les groupes à l’aide de l’ANOVA unidirectionnelle. p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Effets de la crocétine sur la viabilité cellulaire
La crocétine à 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM et 100 μM avait un effet prolifératif significatif sur les cellules, tandis que la crocétine à des concentrations supérieures à 200 μM inhibait significativement la prolifération des cellules H9c2 (Figure 1A). Après 4 h de traitement avec 400 μMH2O2, la viabilité cellulaire a été considérablement réduite, et la crocétin...

Discussion

L’exploration d’ingrédients efficaces à partir de composés complexes de médicaments naturels grâce à une technologie de pointe a été un point chaud de la recherche en MTC29 et peut fournir des preuves de laboratoire pour le développement futur de médicaments après vérification. Le carthame est un médicament représentatif dans le traitement de « favoriser la circulation sanguine et de minimiser la stase sanguine » et est largement utilisé dans le traitement de l’infarctus d...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la Fondation des sciences naturelles de Beijing (n ° 7202119) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 82274380).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsinGibco2323363
1% Penicillin-streptomycinSigmaV900929
5x protein loading bufferBeijing Pulilai Gene TechnologyB1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirusBeyotimeC3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0513
Animal-free blocking solutionCST15019s
Anti-Parkin antibodySanta Cruzsc-32282
Anti-PINK1 antibodyABclonalA11435
Anti-TOM20 antibodyABclonalA19403
Anti-β-actin  antibodyABclonalAC026
BCA protein assay kitKeyGEN BiotechKGP902
Blood cell counting plateServicebioWG607
CAT assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Chemiluminescence detection systemShanghai Qinxiang Scientific Instrument FactoryChemiScope 6100
CK assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10)MacklinC6129
CrocetinChengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tabletsZhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9557
DCFH-DABeyotimeS0033S
DMSOSolarbioD8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Gibco8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solutionNCM BiotechP10100
Fetal bovine serum (FBS)Corning-Cellgro35-081-CV
GraphPad Prism 7.0 https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA005-1-2
H9c2 myocardial cellsBeijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kitLABLEADJ22202
LDH assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA020-2-2
MDA assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-2-2
MethanolAladdinA2114057
MTS assayPromegaG3581
PerhydrolG-cloneCS7730
Phosphatase inhibitorCWBIOCW2383
PolybreneBeyotimeC0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranesMilliporeISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis bufferSolarbioR0010
SDS-PAGE gelsShanghai Epizyme Biomedical TechnologyPG112
SDS-PAGE running buffer powderServicebioG2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powderServicebioG2017-1L
SOD assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-2-2
Tris-buffered saline powderServicebioG0001-2L
Triton X-100SigmaSLCC9172
TUNEL apoptosis assay kitBeyotimeC1086
Tween-20SolarbioT8220

Références

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