PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy를 통한 Crocetin에 의한 산화 스트레스로부터 H9c2 심근 세포 보호

요약

시험관 내 실험을 기반으로 한 이 연구는 PINK1/Parkin 신호 전달 경로가 중요한 역할을 하는 미토파지에 영향을 미쳐 심근 세포의 산화 스트레스 손상을 복구하는 크로세틴의 메커니즘을 밝혔습니다.

초록

본 연구는 체외 실험을 통해_H2O2매개 H9c2 심근세포에 대한 크로세틴의 산화적 스트레스 보호 효과를 탐색하고, 그 기전이 미토파지의 영향과 관련이 있는지 여부를 추가로 탐색하는 것을 목표로 하였다. 이 연구는 또한 심근 세포의 산화 스트레스에 대한 홍화산의 치료 효과를 입증하고 그 메커니즘이 미토파지의 효과와 관련이 있는지 여부를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 여기서는_H2O2기반 산화 스트레스 모델을 구축하고, 젖산 탈수소효소(LDH), 크레아틴 키나아제(CK), 말론디알데히드(MDA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라아제(CAT), 글루타티온 퍼옥시다아제(GSH Px)의 수준을 검출하여 심근 세포의 산화 스트레스 손상 정도를 평가하였다. 활성 산소 종(ROS) 검출 형광 염료 DCFH-DA, JC-1 염료 및 TUNEL 염료를 사용하여 미토콘드리아 손상 및 세포자멸사를 평가했습니다. 자가포식 플럭스는 Ad-mCherry-GFP-LC3B 아데노바이러스를 형질감염시켜 측정하였다. 그런 다음 Mitophagy 관련 단백질을 웨스턴 블로팅 및 면역형광을 통해 검출했습니다. 그러나 크로세틴(0.1-10μM)은 세포 생존율을 크게 향상시키고_H2O2로 인한 세포자멸사 및 산화 스트레스 손상을 감소시킬 수 있습니다. 자가포식 활성화가 과도한 세포에서 크로세틴은 자가포식 흐름과 미토파지 관련 단백질 PINK1 및 Parkin의 발현을 감소시키고 Parkin이 미토콘드리아로 전달되는 것을 역전시킬 수 있습니다. 크로세틴은_H2O2매개 산화 스트레스 손상과 H9c2 세포의 세포자멸사를 감소시킬 수 있으며 그 메커니즘은 미토파지와 밀접한 관련이 있습니다.

서문

급성 심근경색증(Acute myocardial infarction, AMI)은 관상동맥에 대한 심각하고 지속적인 허혈 및 저산소증에 의해 유발되는 생명을 위협하는 심근 괴사이다 ^1,2. 경피적 관상동맥 중재술(PCI)은 AMI의 1차 치료 전략 중 하나이며, 일반적으로 허혈성 손상으로부터 심근세포를 보호한다 ^3,4. 원위 심근은 AMI 후 신속하고 효과적으로 치료하지 않으면 혈액과 산소 공급이 부족하여 허혈성 괴사와 심혈관 합병증을 유발합니다 ^5,6. PCI 수술 기회를 놓친 후 심근 세포 회복을 촉진하고 돌이킬 수 없는 심근 손상을 최소화하는 것은 연구 핫스팟이었습니다. AMI 후, 심근 세포는 허혈 및 저산소증 상태에 있으며, 그 결과 미토콘드리아 산화적 인산화가 억제되고, NAD+가 NADPH로 환원되며, 단일 전자 환원이 증가한다⁷. 그 결과, 산소의 불완전한 환원 반응은 과량의 활성산소종(ROS)을 생성하고, 궁극적으로 심근세포에 산화적 스트레스 손상을 일으킨다⁸. ROS의 과도한 축적은 지질 과산화를 유발하여 미토콘드리아 막의 구조와 기능을 더욱 방해합니다. 그 결과 미토콘드리아 투과성 전이 기공이 지속적으로 열리고 미토콘드리아 막 전위가 감소하여 세포 사멸과 괴사가 유도됩니다.

안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 안지오텐신 수용체 차단제(ARB), β-아드레날린 수용체 억제제, 알도스테론 길항제 및 기타 표준 약물인 AMI는 심근경색 후 심장 기능을 향상시키고 부정맥 및 좌심실 리모델링과 같은 악성 사건의 발생을 예방하는 데 도움이 될 수 있다⁹. 그러나, 경색 후 생존율 및 예후는 경색 크기에 의해 크게 영향을 받으며, 심근세포 아폽토시스를 감소시키는 것에 대한 만족스러운 결과는 달성되지 않았다^10,11. 따라서, 심근경색 후 심근세포 회복을 촉진하는 약물의 개발이 시급한 이슈가 되고 있다.

전통 의학은 수년 동안 현대 제약 연구에 영감의 원천이었습니다^12,13,14,15. 중국 전통 의학(TCM)은 AMI 치료에 오랜 역사를 가지고 있으며, 최근 몇 년 동안 일련의 무작위 대조 시험을 통해 TCM이 실제로 환자의 예후를 개선할 수 있음을 확인했습니다^16,17. TCM 이론에 따르면, AMI는 혈액 정체^18,19에 의해 발생하므로 혈액 순환을 촉진하는 약물은 일반적으로 급성기²⁰의 AMI 치료에 사용됩니다. 그 중 사프란은 혈액 활성화와 정체에 강력한 효과가 있는 것으로 여겨지며 AMI의 급성 치료에 자주 사용됩니다. 사프란의 주요 성분인 크로세틴은 심근 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 할 수 있다²¹.

이 연구에서는 H9c2 심근 세포를 H_2O2 에 의해 유도하여 AMI의 심근 세포 손상을 유발하는 심근 허혈/재관류를 시뮬레이션하고, 산화 스트레스 유발 심근 손상에 대한 보호 효과를 조사하기 위한 중재로 크로세틴을 사용했습니다. 심근 세포를 보호하는 크로세틴의 메커니즘은 미토파지를 통해 추가로 탐구되었습니다. 더 중요한 것은 이 기사가 미토파지 연구에 대한 기술적 접근에 대한 참조를 제공하고 전체 실험 절차를 자세히 설명한다는 것입니다.

프로토콜

실험은 중국 베이징 중의과 대학의 생리학 실험실에서 수행되었습니다. 모든 연구 방법은 베이징 대학의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 세포 배양

1. 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 기본 배지(4.5g/L D-포도당, 4.g.g/L L-글루타민 및 110mg/L 피루브산나트륨 포함, 재료 표 참조)에 추가하여 DMEM 완전 배지를 준비합니다.
2. 액체 질소 동결 H9c2 심근 세포( 재료 표 참조)를 37°C의 따뜻한 물에서 얼음이 녹을 때까지 빠르고 균일하게 저어줍니다.
3. 세포를 원심분리기 튜브로 옮기고 DMEM 완전 배지 부피의 4배를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 358 x g 로 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 버린다.
4. 수득한 세포 현탁액을 배양액으로 희석하고, 부드럽게 불어, 배양 플라스크에 세포를 접종한다. 5%_CO2와 함께 37°C의 인큐베이터에서 배양한다.

2. 세포 생존율 측정

1. 크로세틴( 재료 표 참조)을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 0.05mM, 0.1mM, 0.5mM, 1mM, 5mM, 50mM, 100mM 및 200mM의 농도로 용해합니다.
2. H9c2 심근 세포를 트립신으로 해리시킨 다음, DMEM 완전 배지로 혼합물을 중화시킨다.
3. 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 179 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 DMEM 완전 배지에서 세포를 부드럽게 불어넣어 혼합한다.
4. 혈구 계수 플레이트²² ( 재료 표 참조)를 사용하여 세포를 계수하고 DMEM 완전 배지를 사용하여 5 ×^{10 4} cells/mL로 희석합니다.
5. 세포를 9 등분으로 나눕니다. 대조군에 DMSO(DMEM 완전 배지로 1:1,000 비율로 희석)를 추가하고 나머지 그룹에 1:1,000의 비율로 다른 농도의 크로세틴을 추가합니다.
6. 웰당 100μL의 96웰 플레이트에 세포를 시딩합니다. 24시간 동안 배양한 후 상층액을 버리고 PBS로 세포를 3회 세척하였다.
7. 100 μL의 DMEM 기본 배지를 첨가한 후, 세포를 4시간 동안 배양하고 20 μL의 MTS를 첨가한다( 재료 표 참조).
8. 세포를 2시간 더 배양하고 파장 490nm에서 흡광도를 측정하고 세포 생존율을 계산합니다.
   참고: 세포 생존율 = (OD 처리 - OD blank)/(OD control - OD blank) × 100.

3. 젖산 탈수소효소(LDH), 크레아틴 키나아제(CK), 말론디알데히드(MDA), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 글루타티온 과산화효소(GSH Px) 및 카탈라아제(CAT)의 측정

1. H9c2 세포를 1 ×^{10 5} 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한다. 개입 후 상청액을 수집하고 제조업체의 지침에 따라 LDH 및 SOD 수준을 감지하십시오 ( 재료 표 참조).
2. 상층액을 수집하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척합니다. 세포 용해물을 배양 접시에 넣고 20분 동안 얼음 위에 둡니다. 배양 접시에서 원심분리기 튜브로 액체를 수집합니다.
3. 제조업체의 지침²³ 에 따라 CK, MDA, GSH-Px 및 CAT 수준을 감지합니다( 재료 표 및 보충 참조 File 1).
4. CK, MDA, GSH-Px 및 CAT²⁴의 농도를 보정하기 위해 BCA(bicinchoninic acid) 방법으로 용해물의 총 단백질 농도를 감지합니다( 재료 표 참조).

4. ROS의 결정

1. H9c2 세포를 5 ׳ 세포의 밀도로 48웰 플레이트에 시딩합니다. DCFH-DA( 재료 표 참조)를 무혈청 배지와 1:1,000 비율로 희석합니다. 세포 상청액을 버리고 무혈청 배지로 세포를 두 번 세척하십시오.
2. 희석된 DCFH-DA 150μL를 각 웰에 넣고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 무혈청 배지로 세포를 세 번 세척하고 형광 현미경으로 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조).

5. 미토콘드리아 막 전위 검출

1. JC-1 미토콘드리아 막 전위 분석 키트(²⁵ )를 사용하여 미토콘드리아 막 전위를 검출한다( 재료 표 참조). 배양 배지를 버리고 무혈청 배지로 한 번 세척하십시오.
2. JC-1 작업 용액을 각 튜브에 넣고 잘 섞는다. 37°C에서 20분 동안 인큐베이션하고 JC-1 염색 완충액으로 세포를 2회 세척하였다. 각 웰에 완전한 배지를 추가하고 형광 현미경으로 사진을 캡처합니다.

6. TUNEL 염색 분석

1. TUNEL 아폽토시스 분석 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 아폽토시스 속도를 결정한다²⁶. 상층액을 버리고 무혈청 배지로 펠릿을 한 번 세척하십시오.
2. 세포 고정 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한 후 PBS로 1회 세척한다.
3. 각 웰에 0.3% 트리톤-100을 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 PBS로 2회 세척한다. TUNEL 검출 작업 용액을 추가하고 37°C의 어두운 곳에서 60분 동안 배양합니다.
4. 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 재료 표 참조)을 포함하는 항형광 담금질 밀봉 정제를 추가하고 형광 현미경으로 사진을 캡처합니다.

7. mCherry GFP-LC3B 아데노바이러스의 형질감염에 의한 자가포식 흐름 모니터링

1. 각 웰에 있는 배지의 절반을 새 배지로 교체합니다. Ad-mCherry GFP-LC3B 아데노바이러스(감염 다중도[MOI] 2)를 배양 배지에 추가하고 5μg/mL 폴리브렌( 재료 표 참조)을 추가하여 감염 효율을 개선합니다.
2. 24시간 후에 새로운 배지를 교체하고 공초점 현미경으로 형광 단백질의 발현을 관찰합니다.
3. 바이러스 감염 성공 확인 후 섹션 1과 동일한 조건으로 세포를 배양하고 컨포칼 현미경²⁷로 이미지를 캡처합니다.
   참고: 세포의 20% 이상이 녹색 형광 단백질(GFP) 형광을 보였으며 이는 성공적인 감염을 나타냅니다.

8. 웨스턴 블롯 분석

1. 전체 단백질 추출을 위해 세포를 수집하고 얼음에서 30분 동안 용해(RIPA, 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제 = 100:1:1, 재료 표 참조).
2. 단백질 정량 후 단백질 샘플에 5x 단백질 로딩 버퍼를 추가하고 샘플을 10분 동안 끓입니다.
3. 동일한 양의 단백질을 함유하는 시료를 소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔²⁸로 전기영동한다. 그런 다음 샘플을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮깁니다.
4. 5% 탈지 분유로 PVDF 멤브레인을 1시간 동안 차단하고 1차 항체(PINK1, Parkin, 재료 표 참조)를 4°C에서 하룻밤 동안 배양하고 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
5. ECL(Enhanced Chemiluminescence) 용액과 화학발광 검출 시스템을 사용하여 표적 밴드를 검출합니다. Image J 소프트웨어를 사용하여 밀도 측정²⁸을 통해 밴드를 정량화합니다.

9. 면역형광법에 의한 파킨의 미토콘드리아 전좌 검출

1. 이중 면역형광 염색을 통해 Parkin과 미토콘드리아의 colocalization을 관찰합니다. 각 그룹의 세포 상층액을 버리고 PBS로 3회 세척한다.
2. 세포를 4% 파라포름알데히드로 실온에서 10분 동안 고정하고 PBS에 0.1% 트리톤-100을 첨가한다.
3. 단백질과 항체 사이의 비특이적 결합을 방지하고 형광 배경을 줄이기 위해 1시간 동안 동물이 없는 블록 용액( 재료 표 참조)으로 차단합니다.
4. 1차 항체(Parkin and Tom20; 재료 표 참조)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
5. 형광 2차 항체( 재료 표 참조)를 추가하고 어둠 속에서 1시간 동안 배양합니다.
6. DAPI 함유 형광 소광 정제를 추가하고 컨포칼 현미경으로 이미지를 캡처합니다.

10. 통계 분석

1. 그래프 및 분석 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
2. 일원 분산 분석을 사용하여 그룹 간 계량형 변수를 비교합니다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

결과

세포 생존율에 대한 크로세틴의 효과
0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM 및 100 μM의 크로세틴은 세포에 상당한 증식 효과를 보인 반면, 200 μM 이상의 농도에서 크로세틴은 H9c2 세포의 증식을 유의하게 억제했습니다(그림 1A). 400 μM H 2 O₂로 4 시간 처리 한 후, 세포 생존율은 상당히 감소되었고, 크로세틴은 이러한 변화를 어느 정도 되돌릴 수 있?...

토론

첨단 기술을 통해 천연 약물의 복잡한 화합물에서 유효 성분을 탐색하는 것은 TCM 연구²⁹의 핫스팟이었으며 검증 후 향후 약물 개발을 위한 실험실 증거를 제공할 수 있습니다. 홍화는 "혈액 순환을 촉진하고 혈액 정체를 최소화하는"치료의 대표적인 약물이며 심근 경색 치료에 널리 사용됩니다^30,31. 사프란은 홍화와 유사한 효과가 있?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	2323363
1% Penicillin-streptomycin	Sigma	V900929
5x protein loading buffer	Beijing Pulilai Gene Technology	B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus	Beyotime	C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZF-0513
Animal-free blocking solution	CST	15019s
Anti-Parkin antibody	Santa Cruz	sc-32282
Anti-PINK1 antibody	ABclonal	A11435
Anti-TOM20 antibody	ABclonal	A19403
Anti-β-actin  antibody	ABclonal	AC026
BCA protein assay kit	KeyGEN Biotech	KGP902
Blood cell counting plate	Servicebio	WG607
CAT assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Chemiluminescence detection system	Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory	ChemiScope 6100
CK assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10)	Macklin	C6129
Crocetin	Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.	RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9557
DCFH-DA	Beyotime	S0033S
DMSO	Solarbio	D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution	NCM Biotech	P10100
Fetal bovine serum (FBS)	Corning-Cellgro	35-081-CV
GraphPad Prism 7.0	https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A005-1-2
H9c2 myocardial cells	Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.	CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit	LABLEAD	J22202
LDH assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A020-2-2
MDA assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A003-2-2
Methanol	Aladdin	A2114057
MTS assay	Promega	G3581
Perhydrol	G-clone	CS7730
Phosphatase inhibitor	CWBIO	CW2383
Polybrene	Beyotime	C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer	Solarbio	R0010
SDS-PAGE gels	Shanghai Epizyme Biomedical Technology	PG112
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder	Servicebio	G2017-1L
SOD assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-2-2
Tris-buffered saline powder	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Sigma	SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit	Beyotime	C1086
Tween-20	Solarbio	T8220