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Resumo

Com base em experimentos in vitro , este estudo revelou o mecanismo da crocetina na reparação do dano por estresse oxidativo de cardiomiócitos influenciando a mitofagia, na qual a via de sinalização PINK1/Parkin desempenha um papel importante.

Resumo

O objetivo deste estudo foi explorar o efeito protetor do estresse oxidativo da crocetina sobre células H9c2 H9c2 mediadaspor H2O2 através de experimentos in vitro, e explorar se seu mecanismo está relacionado ao impacto da mitofagia. Este estudo também teve como objetivo demonstrar o efeito terapêutico do ácido cártamo sobre o estresse oxidativo em cardiomiócitos e explorar se seu mecanismo está relacionado ao efeito da mitofagia. Aqui, um modelo de estresse oxidativo baseado em H 2 O2foi construído e avaliou o grau de lesão por estresse oxidativo de cardiomiócitos por meio da detecção dos níveis de lactato desidrogenase (LDH), creatina quinase (CK), malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH Px). Os corantes fluorescentes DCFH-DA, JC-1 e TUNEL que detectam espécies reativas de oxigênio (ROS) foram empregados para avaliar danos mitocondriais e apoptose. O fluxo autofágico foi medido pela transfecção do adenovírus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Proteínas relacionadas à mitofagia foram então detectadas por western blotting e imunofluorescência. No entanto, a crocetina (0,1-10 μM) pode melhorar significativamente a viabilidade celular e reduzir a apoptose e os danos causados pelo estresse oxidativo causados por H 2 O2. Em células com ativação autofágica excessiva, a crocetina também poderia reduzir o fluxo de autofagia e a expressão das proteínas relacionadas à mitofagia PINK1 e Parkin, e reverter a transferência de Parkin para as mitocôndrias. A crocetina foi capaz de reduzir o dano do estresse oxidativo mediado por H 2 O2e a apoptose das células H9c2, e seu mecanismo estava intimamente relacionado à mitofagia.

Introdução

O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma necrose miocárdica com risco de vida causada por isquemia e hipóxia graves e persistentes nas artérias coronárias 1,2. A intervenção coronária percutânea (ICP) é uma das estratégias terapêuticas de primeira linha para o IAM, e geralmente protege os cardiomiócitos do danoisquêmico3,4. O miocárdio distal carecerá de suprimento sanguíneo e de oxigênio se não for tratado pronta e efetivamente após o IAM, o que leva à necrose isquêmica e a complicações cardiovascularesadicionais 5,6. Promover a recuperação dos cardiomiócitos e minimizar o dano miocárdico irreversível após perder a oportunidade cirúrgica da ICP tem sido um ponto de pesquisa. Após o IAM, os cardiomiócitos encontram-se em estado de isquemia e hipóxia, resultando em inibição da fosforilação oxidativa mitocondrial, redução de NAD+ para NADPH e aumento da redução de um elétron7. Como resultado, a reação de redução incompleta do oxigênio gera um excesso de espécies reativas de oxigênio (EROs) e, finalmente, leva a danos por estresse oxidativo aos cardiomiócitos8. Um acúmulo excessivo de ERO desencadeia a peroxidação lipídica, interrompendo ainda mais a estrutura e a função das membranas mitocondriais. O resultado é uma abertura contínua dos poros de transição da permeabilidade mitocondrial e uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial, induzindo apoptose e necrose.

Os inibidores da enzima conversora da angiotensina (IECA), os bloqueadores dos receptores da angiotensina (BRA), os inibidores dos receptores β-adrenérgicos, os antagonistas da aldosterona e outras drogas padrão no IAM podem ajudar a melhorar a função cardíaca após o infarto do miocárdio e prevenir a ocorrência de eventos malignos, como arritmias e remodelamento ventricularesquerdo9. No entanto, a sobrevida e o prognóstico pós-infarto são muito afetados pelo tamanho do infarto, e resultados satisfatórios não têm sido alcançados para reduzir a apoptose dos cardiomiócitos10,11. Assim, o desenvolvimento de fármacos que promovam a recuperação dos cardiomiócitos após o infarto do miocárdio tornou-se uma questão urgente.

A medicina tradicional tem sido fonte de inspiração para a pesquisa farmacêutica moderna há muitos anos12,13,14,15. A medicina tradicional chinesa (MTC) tem uma longa história no tratamento do IAM, e uma série de estudos clínicos randomizados nos últimos anos confirmou que a MTC pode realmente melhorar o prognóstico dos pacientes16,17. De acordo com a teoria da MTC, o IAM é causado pela estasesanguínea18,19, de modo que drogas para promover a circulação sanguínea são geralmente utilizadas para o tratamento do IAM na faseaguda20. Entre eles, acredita-se que o açafrão tenha um poderoso efeito na ativação e estase sanguínea, e é frequentemente usado no tratamento agudo do IAM. A crocetina, um dos principais componentes do açafrão, pode desempenhar um papel fundamental na proteção dos cardiomiócitos21.

Neste estudo, células miocárdicas H9c2 foram induzidas por H2 O2 para simular isquemia/reperfusão miocárdica, o que causa lesão cardiomiocitária do IAM, e a crocetina foi utilizada como intervenção para investigar seu efeito protetor contra lesão miocárdica induzida por estresse oxidativo. O mecanismo da crocetina protegendo os cardiomiócitos foi mais explorado através da mitofagia. Mais importante, este artigo fornece uma referência para a abordagem técnica para o estudo da mitofagia e descreve todo o procedimento experimental em detalhes.

Protocolo

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Fisiologia da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim, na China. Todos os métodos de estudo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes da Universidade de Pequim.

1. Cultura celular

  1. Adicionar 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina ao meio básico modificado de Eagle (DMEM) da Dulbecco (com 4,5 g/L de D-glicose, 4,g/L de L-glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódio; ver Tabela de Materiais) para preparar o meio completo DMEM.
  2. Descongelar as células miocárdicas H9c2 congeladas com azoto líquido (ver Tabela de Materiais) em água morna a 37 °C com uma agitação rápida e uniforme até que o gelo derreta.
  3. Transfira as células para um tubo centrífugo e adicione quatro vezes o volume do meio completo DMEM. Centrifugar a 358 x g durante 5 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta.
  4. Diluir a suspensão celular obtida com meio de cultura, soprar suavemente e inocular as células em balão de cultura. Cultura em estufa a 37 °C com 5% de CO2.

2. Determinação da viabilidade celular

  1. Dissolver crocetina (ver Tabela de Materiais) em dimetilsulfóxido (DMSO) para concentrações de 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM e 200 mM.
  2. Dissociar as células miocárdicas H9c2 por tripsina e, em seguida, neutralizar a mistura com meio completo DMEM.
  3. Transfira as células para um tubo de centrífuga e centrifugação a 179 x g por 5 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e misture as células em meio completo DMEM soprando suavemente.
  4. Contar as células utilizando uma placa de contagem de células sanguíneas22 (ver Tabela de Materiais) e diluí-las para 5 × 104 células/mL com meio completo DMEM.
  5. Divida as células em nove porções iguais. Adicionar DMSO (diluído na proporção de 1:1.000 com meio completo de DMEM) ao grupo controle e adicionar diferentes concentrações de crocetina aos demais grupos na proporção de 1:1.000.
  6. Semeando as células em placas de 96 poços a 100 μL por poço. Descarte o sobrenadante após incubação por 24 h e lave as células três vezes com PBS.
  7. Depois de adicionar 100 μL de meio basal DMEM, incubar as células por 4 h e adicionar 20 μL de MTS (ver Tabela de Materiais).
  8. Incubar as células por mais 2 h, medir a absorbância no comprimento de onda de 490 nm e calcular a viabilidade celular.
    NOTA: Viabilidade celular = (OD tratado - OD em branco) / (controle OD - OD em branco) × 100.

3. Determinação de lactato desidrogenase (LDH), creatina quinase (CK), malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH Px) e catalase (CAT)

  1. Semeando as células H9c2 em uma placa de 6 poços a uma densidade de 1 × 105 células. Recolher o sobrenadante após a intervenção e detectar os níveis de LDH e SOD, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
  2. Recolher o sobrenadante e lavá-lo com solução salina tamponada com fosfato (PBS) uma vez. Adicione o lisado celular à placa de cultura e deixe descansar no gelo por 20 min. Recolher o líquido da placa de cultura num tubo de centrifugação.
  3. Detectar os níveis de CK, MDA, GSH-Px e CAT de acordo com as instruções do fabricante23 (ver Tabela de Materiais e Arquivo Suplementar 1).
  4. Detectar a concentração de proteína total da lise pelo método do ácido bicinconínico (BCA) para corrigir a concentração de CK, MDA, GSH-Px e CAT24 (ver Tabela de Materiais).

4. Determinação de ROS

  1. Semeando as células H9c2 em uma placa de 48 poços a uma densidade de 5 × 103 células. Diluir DCFH-DA (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:1.000 com o meio sem soro. Descarte o sobrenadante celular e lave a célula duas vezes com um meio sem soro.
  2. Adicionar 150 μL de DCFH-DA diluído em cada poço e incubar a 37 °C durante 20 min. Lave as células três vezes com um meio livre de soro e capture imagens sob um microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais).

5. Detecção do potencial de membrana mitocondrial

  1. Detectar o potencial de membrana mitocondrial usando um kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial JC-125 (ver Tabela de Materiais). Descarte o meio de cultura e lave-o uma vez com meio sem soro.
  2. Adicione a solução de trabalho JC-1 a cada tubo e misture-os bem. Incubar a 37 °C durante 20 min e lavar as células duas vezes com tampão corante JC-1. Adicione meio completo a cada poço e capture fotografias sob um microscópio de fluorescência.

6. Ensaio de coloração TUNEL

  1. Use um kit de ensaio de apoptose TUNEL (ver Tabela de Materiais) para determinar as taxas de apoptose26. Descarte o sobrenadante e lave o pellet uma vez com meio sem soro.
  2. Adicionar a solução de fixação celular e lavá-las com PBS uma vez após incubar à temperatura ambiente por 30 min.
  3. Adicionar 0,3% de triton-100 a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Lave as células com PBS duas vezes. Adicionar a solução de trabalho de detecção TUNEL e incubar a 37 °C no escuro durante 60 minutos.
  4. Adicione um comprimido de vedação antifluorescência contendo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; ver Tabela de Materiais) e capture fotografias em um microscópio de fluorescência.

7. Monitoramento do fluxo autofágico por transfecção do adenovírus mCherry GFP-LC3B

  1. Substitua metade do meio em cada poço por meio fresco. Adicionar o adenovírus Ad-mCherry GFP-LC3B (multiplicidade de infecção [MOI] de 2) ao meio de cultura e adicionar 5 μg/mL de polibreno (ver Tabela de Materiais) para melhorar a eficiência da infecção.
  2. Substitua o meio fresco após 24 h e observe a expressão da proteína fluorescente em microscópio confocal.
  3. Cultivar as células com as mesmas condições da seção 1 após confirmação de infecção viral bem-sucedida e capturar imagens sob microscópio confocal27.
    NOTA: Mais de 20% das células apresentaram fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP), indicando uma infecção bem-sucedida.

8. Análise de Western blot

  1. Coletar células para extração de proteínas inteiras e lisá-las (RIPA, inibidor de protease e inibidor de fosfatase = 100:1:1; ver Tabela de Materiais) em gelo por 30 min.
  2. Adicionar 5x tampão de carga de proteína à amostra de proteína após a quantificação da proteína e ferver as amostras por 10 min.
  3. Eletroforese as amostras que contêm quantidades iguais de proteína com géis de eletroforese em gel de poliacrilamida de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE)28. Em seguida, transfira as amostras para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF).
  4. Bloquear as membranas de PVDF durante 1 h com leite em pó desnatado a 5% e incubar com o anticorpo primário (PINK1, Parkin; ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite e o anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Detecte as bandas alvo usando a solução de quimioluminescência aprimorada (ECL) e o sistema de detecção de quimioluminescência. Utilizar o software Image J para quantificar as bandas via densitometria28.

9. Detecção da translocação mitocondrial de Parkin por imunofluorescência

  1. Observar a colocalização de Parkin com mitocôndrias por dupla imunofluorescência. Descarte o sobrenadante celular de cada grupo e lave-o três vezes com PBS.
  2. Fixar as células por 10 min à temperatura ambiente com paraformaldeído a 4% e adicionar triton-100 a 0,1% em PBS.
  3. Bloquear com solução de bloco livre de animais (ver Tabela de Materiais) durante 1 h para evitar a ligação inespecífica entre proteínas e anticorpos e reduzir o fundo de fluorescência.
  4. Incubar com um anticorpo primário (Parkin e Tom20; ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
  5. Adicione um anticorpo secundário fluorescente (ver Tabela de Materiais) e incube no escuro por 1 h.
  6. Adicione os comprimidos de têmpera antifluorescência contendo DAPI e capture imagens sob o microscópio confocal.

10. Análise estatística

  1. Realizar análise estatística utilizando software de gráficos e análise (ver Tabela de Materiais).
  2. Comparar variáveis contínuas entre os grupos usando ANOVA one-way. Considerou-se estatisticamente significante < de p 0,05.

Resultados

Efeitos da crocetina na viabilidade celular
A crocetina a 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM e 100 μM teve um efeito proliferativo significativo sobre as células, enquanto a crocetina em concentrações acima de 200 μM inibiu significativamente a proliferação de células H9c2 (Figura 1A). Após 4 h de tratamento com 400 μM H 2 O2, a viabilidade celular foi reduzida consideravelmente, e a crocetina conseguiu reverter essa alteração...

Discussão

A exploração de ingredientes eficazes a partir de compostos complexos de fármacos naturais por meio de tecnologia avançada tem sido um ponto crítico de pesquisa em MTC29, e pode fornecer evidências laboratoriais para o desenvolvimento futuro de fármacos após verificação. O cártamo é uma droga representativa no tratamento de "promover a circulação sanguínea e minimizar a estase sanguínea" e é amplamente utilizado no tratamento do infarto domiocárdio30,31

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (No. 7202119) e pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82274380).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsinGibco2323363
1% Penicillin-streptomycinSigmaV900929
5x protein loading bufferBeijing Pulilai Gene TechnologyB1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirusBeyotimeC3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0513
Animal-free blocking solutionCST15019s
Anti-Parkin antibodySanta Cruzsc-32282
Anti-PINK1 antibodyABclonalA11435
Anti-TOM20 antibodyABclonalA19403
Anti-β-actin  antibodyABclonalAC026
BCA protein assay kitKeyGEN BiotechKGP902
Blood cell counting plateServicebioWG607
CAT assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Chemiluminescence detection systemShanghai Qinxiang Scientific Instrument FactoryChemiScope 6100
CK assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10)MacklinC6129
CrocetinChengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tabletsZhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9557
DCFH-DABeyotimeS0033S
DMSOSolarbioD8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Gibco8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solutionNCM BiotechP10100
Fetal bovine serum (FBS)Corning-Cellgro35-081-CV
GraphPad Prism 7.0 https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA005-1-2
H9c2 myocardial cellsBeijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kitLABLEADJ22202
LDH assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA020-2-2
MDA assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-2-2
MethanolAladdinA2114057
MTS assayPromegaG3581
PerhydrolG-cloneCS7730
Phosphatase inhibitorCWBIOCW2383
PolybreneBeyotimeC0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranesMilliporeISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis bufferSolarbioR0010
SDS-PAGE gelsShanghai Epizyme Biomedical TechnologyPG112
SDS-PAGE running buffer powderServicebioG2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powderServicebioG2017-1L
SOD assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-2-2
Tris-buffered saline powderServicebioG0001-2L
Triton X-100SigmaSLCC9172
TUNEL apoptosis assay kitBeyotimeC1086
Tween-20SolarbioT8220

Referências

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