Shrinky-Dink Hanging Gocce: un modo semplice per forma e cultura corpi embrionali

Riepilogo

Mostriamo un metodo semplice e rapido per caricare predefiniti numero di cellule nei pozzetti microfabbricazione e mantenerli per lo sviluppo del corpo embrionali.

Abstract

Corpi embrionali (EB) sono aggregati di cellule staminali embrionali. Il modo più comune di creare questi aggregati è il metodo goccia, un approccio laborioso di pipettaggio un numero arbitrario di celle in piastre. Le interazioni tra le cellule staminali costretti a stretta vicinanza l'uno dall'altro favorisce la generazione di EBS. Perché i media in ciascuno dei pozzi deve essere manualmente scambiati ogni giorno, questo approccio è manualmente intensiva.

Inoltre, poiché i parametri ambientali, tra cui cellula-cellula, cellula-interazioni tra fattori solubili, pH, ossigeno e la disponibilità possono essere le funzioni di taglia EB, popolazioni di cellule ottenute dalle tradizionali gocce può variare notevolmente, anche se colto in condizioni identiche. Recenti studi hanno infatti dimostrato che il numero iniziale di cellule che formano l'aggregato possono avere effetti significativi sulla differenziazione delle cellule staminali. Abbiamo sviluppato un metodo cultura semplice, rapida e scalabile per caricare predefiniti numero di cellule nei pozzetti microfabbricazione e mantenerli per lo sviluppo del corpo embrionali. Infine, queste cellule sono facilmente accessibili per ulteriori analisi e sperimentazione. Questo metodo è suscettibile di ogni laboratorio e non richiede apparecchiature dedicate. Dimostriamo questo metodo mediante la creazione di corpi embrionali utilizzando una linea cellulare rosso fluorescente mouse (129S6B6-F1).

Protocollo

1. Fare Shrinky-Mold Dink

1. Stampare il modello voluto sulla Shrinky-dink foglio utilizzando una stampante buona definizione.
2. Cuocere Shrinky-dink foglio a 163 ° C per circa 10 minuti, o fino a completo ristretto e aver acquisito una forma regolare.
3. Dopo Shrinky-dink stampo è raffreddato, immergere in un bagno di isopropanolo fino a quando l'intera superficie è a malapena coperto.
4. Attenzione, spray alcuni acetone sopra lo stampo e agitare il contenitore un paio di volte. Aggiungere più isopropanolo per lavare l'eccesso di acetone e ripetere l'operazione un paio di volte fino a quando Shrinky-muffa sembra pulito.
5. Stampo immergere in acqua distillata per 10 minuti per lavare la parte rimanente solvente organico.
6. Aria pulita Shrinky-stampo. Ri-calore per circa 5 minuti a 163 ° C. Questo inchiostro compatta e far evaporare i solventi rimanenti.

2. Fare PDMS pozzetti

1. Preparare una miscela 10:01 agente PDMS / indurimento ed agitare vigorosamente per pochi minuti.
2. Luogo Shrinky-dink stampo in una piccola scatola di Petri. Versare il composto PDMS fino a raggiungere circa 1 / 2 cm su tutta la superficie dello stampo.
3. Piatto posto sotto campana sottovuoto per eliminare tutte le bolle dalla miscela PDMS.
4. Piatto posto in forno a 70 ° C, durante la notte.
5. Tagliare solido PDMS da muffe e associarlo a un vetrino semplicemente applicando una pressione.
6. Eliminare prima micropozzetti-chip, dal momento che ha i residui di inchiostro incrostato tra PDMS.
7. Ripetete questa procedura per produrre un secondo chip che è inchiostro libero e ha una forma più definita.
8. Pulire micropozzetti chip usando la soluzione di etanolo al 70%. Posto sotto fonte di luce UV per 10 minuti per sterilizzarlo.

3. Cellule cattura in pozzetti

1. Contare le celle e diluire in terreni di coltura alla concentrazione desiderata (a seconda del numero delle cellule iniziali in pozzi che si desidera). Per esempio, per ottenere circa 10-15 cellule per pozzetto (media = 11, SD = 5.4, tasso di carico = 93%), abbiamo usato una concentrazione di 8 × 10 ⁴ cellule / ml. Per una concentrazione di 17 × 10 ⁴ cellule / ml, si potrebbe ottenere affidabile tra 25 e 35 cellule per pozzetto (media = 27,17857 DS = 7.7, tasso di carico = 100%).
2. Attentamente luogo di chip micropozzetti in un tubo da centrifuga da 50 ml contenente una base solidificato PDMS.
3. Aggiungere circa ml 2JDP della soluzione di cellula.
4. Centrifugare per 5 minuti a 760 giri al minuto e 4 ° C.
5. Pipettare in eccesso di soluzione e lavate accuratamente micropozzetti con la soluzione PBS 1X.
6. Mettere in un piatto micropozzetti Petry piccolo, facendo attenzione tenendo il chip dalla provetta.
7. Lavare l'eccesso di cellule con 1 X soluzione PBS.
8. Luogo di chip micropozzetti sotto un microscopio invertito per verificare il numero previsto di cellule per pozzetto.
9. Incubare micropozzetti contenenti cellule in condizioni standard.
   
   

4. Incubazione delle cellule

1. Seguire il protocollo normale EB in laboratorio.
2. Cambia il medium lentamente dal lato della camera, non disturbare la cella nel micropozzetti.

Discussione

Abbiamo sviluppato un metodo cultura semplice, rapida e scalabile per caricare predefiniti numero di cellule nei pozzetti microfabbricazione (stampato da Shrinky-Dinks) e mantenerli per lo sviluppo del corpo embrionali. Infine, queste cellule sono facilmente accessibili per ulteriori analisi e sperimentazione. Questo metodo è suscettibile di ogni laboratorio e non richiede attrezzature dedicate perché abbiamo ovviare alla necessità di fotolitografia. Siamo in grado di variare la dimensione dei pozzetti così come la concentrazione di cel...

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