방울을 공중 Shrinky - 딩크 : Embryoid 기관 폼 문화하는 간단한 방법

요약

우리는 microfabricated 우물로 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다.

초록

Embryoid 단체 (EB)는 배아 줄기 세포 집합체입니다. 이러한 집합체를 만드는 가장 일반적인 방법은 매달려 드롭 방식, 잘 접시에 세포의 임의의 숫자를 pipetting의 힘드는 접근이다. 서로의 가까이에 강제 줄기 세포 사이의 상호 작용은 EBS의 생성을 촉진. 우물의 각 미디어가 수동으로 매일 교환해야했기 때문에, 이러한 방식은 수동으로 집약적이다.

동일한 조건에서 양식 때 또한, 셀 셀, 셀 용해 계수 상호 작용, 산도, 그리고 산소의 가용성을 포함한 환경 매개 변수 EB 크기의 기능을 수 있기 때문에, 전통적인 매달려 방울에서 얻은 세포 집단도 크게 다를 수 있습니다. 최근 연구는 실제로 집계를 형성하는 세포의 초기 숫자가 줄기 세포 분화에 중요한 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 microfabricated 우물로 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해, 간단한 신속하고 확장 가능한 문화 방식을 개발했습니다. 마지막으로, 이러한 전지는 더 이상 분석 및 실험을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 실험실 의무이며 전용 장비를 필요하지 않습니다. 우리는 붉은 형광 마우스 세포 라인을 (129S6B6 - F1)를 사용 embryoid 시체를 작성하여이 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. Shrinky - 딩크 몰드 만들기

1. 좋은 정의 프린터를 사용 shrinky - 딩크 시트에 원하는 패턴을 인쇄합니다.
2. 163에서 베이크 shrinky - 딩크 시트 ° C 약 10 분, 또는 때까지 대해 전적으로 축소하고 정기적인 모양을 인수하는 데.
3. shrinky - 딩크의 금형이 냉각되면, 이소프로판올 욕조에서 잠수함 그것은 전체 표면은 거의 덮여 때까지.
4. 신중하게, 금형을 통해 몇 가지 아세톤을 스프레이하고 컨테이너 몇 번 흔들. 아세톤의 초과를 씻고 shrinky - 곰팡이가 깨끗해 보여요 때까지이 단계 몇 번 반복해야 더 이소프로판올 추가합니다.
5. 남아있는 유기 용매 씻어 10 분 정도 증류수에 담가 곰팡이.
6. 에어 shrinky - 곰팡이 청소. 163에서 5 분 동안 그것을 다시 열 ° C. 이것은 남아있는 용매를 증발 압축 잉크 및됩니다.

2. PDMS microwells 만들기

1. 10시 1분 PDMS / 치료 에이전트 혼합물을 준비하고, 몇 분 동안 적극적으로 선동.
2. 작은 페트리 접시에 넣어 shrinky - 딩크 금형. 그것은 금형 표면 2분의 1에 대한 cm에 도달할 때까지 PDMS 혼합물을 붓고.
3. PDMS 혼합물에서 모든 거품을 제거하기 위해 진공 종 아래 플레이스 요리.
4. 70 오븐에 넣어 요리 ° C, 하룻밤.
5. 금형에서 고체 PDMS를 차단하고 단지 압력을 적용하여 유리 슬라이드에 바인딩합니다.
6. 그것이 PDMS 사이 incrusted 잉크 잔류물을 가지고 있기 때문에, 첫번째 microwell 칩 폐기하십시오.
7. 잉크 무료이며 더 정의된 모양을 가지고 두 번째 칩을 생산하기 위해이 절차를 반복합니다.
8. 청소는 microwell 칩 70 % 에탄올 솔루션을 사용합니다. 그것을 소독하기 위해 10 분 동안 자외선 광원 아래로 놓으십시오.

3. microwells에서 트래핑 세포

1. 세포를 카운트하고 원하는 농도 (당신이 싶은 얼마나 많은 우물의 초기 세포에 따라)에 문화 미디어에서 그들을 희석. 예를 들어, 잘 당 약 10-15 세포 (평균 = 11, SD = 5.4, 로딩 속도 = 93%)하기 위해서, 우리는 8 농도 × 10 ⁴ 세포 / ML를 사용합니다. 17 × 10 ⁴ 세포 / ML의 농도에 대해서는 안정적으로 잘 당 25의 사이 35 세포를 (평균 = 27.17857 SD는 = 7.7, 로딩 속도 = 100 %)받을 수 있습니다.
2. 조심스럽게 확정 PDMS 기반을 포함하는 50 ML의 원심 분리기 튜브의 microwell 칩 장소.
3. 세포 솔루션의 2JDP ML에 대한 추가합니다.
4. 5 760 RPM 분만에 4 ° C.위한 원심 분리기
5. 초과 솔루션 아웃 Pipet 조심스럽게 PBS 1X 솔루션 microwell 씻는다.
6. 원심 분리기 튜브의 칩을하면서 조심하고, 작은 페트리 접시에 microwell를 배치합니다.
7. 1 X PBS 솔루션을 사용하여 셀 초과 씻으십시오.
8. 물론 당 세포의 의도 번호를 확인할 수 거꾸로 현미경 microwell 칩을 놓으십시오.
9. 부화 microwell 표준 조건에서 세포를 포함하는.
   
   

4. 세포 배양

1. 연구실에 정상 EB 프로토콜을 따르십시오.
2. 천천히 챔버의 측면에서 매체를 변경, microwell에있는 세포를 방해하지 마십시오.

토론

우리는 microfabricated 웰스 (Shrinky - Dinks에서 성형)에 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해, 간단한 신속하고 확장 가능한 문화 방식을 개발했습니다. 마지막으로, 이러한 전지는 더 이상 분석 및 실험을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 실험실 의무이며, 우리가 석판술의 필요성을 사전에 제거하다 때문에 아무 전용 장비를 필요하지 않습니다. 우리는 embryoid ?...

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