1. Ottenere un campione di acque reflue o acqua contenente colifagi.
2. Diluire il campione 1:10 e 1:100 utilizzando il buffer Tris. Fallo trasferendo 1,0 ml di coltura a 9 ml di tampone Tris e quindi effettuando una seconda diluizione di 10 volte.
3. Sciogliere tre tubi di agar morbido (0,7% di agar nutriente o agar di soia triptasi per tubo da 3 ml) mettendoli in un bagno di vapore o in autoclave.
4. Mettere l'agar a bagnomaria a 45-48 °C per 15 minuti per consentire alla temperatura dell'agar di adattarsi a 45 °C.
5. Alla prima provetta, aggiungere 1 mL di una coltura di brodo in fase logaritmica di E. coli¹ e 1 mL di campione non diluito.
6. Rimuovere il tubo dal bagno d'acqua e oscillare delicatamente tra le mani per mescolare la sospensione per 2-3 s.
7. Pulire l'acqua dal tubo con un tovagliolo di carta e versare l'agar su una capsula di Petri precedentemente preparata contenente agar inferiore (agar nutriente regolare o agar di soia triptasi).
8. Ruotare rapidamente la piastra per stendere l'agar superiore. Assicurati che l'agar copra l'intera superficie.
9. Ripetere i passaggi 5-8 con gli altri due tubi di agar morbido, utilizzando 1 mL di batteri e 1 mL di diluizione del campione (Figura 2).
10. Dopo che l'agar si è solidificato, invertire le piastre di Petri e incubare a 37 °C per 48 ore. Eliminare l'umidità dal coperchio della capsula di Petri. Se una goccia di umidità cade su una placca, causerà la diffusione del virus sulla superficie dell'agar.
11. Dopo l'incubazione, contare il numero di placche su ogni diluizione (Figura 3) e calcolare la concentrazione di fagi nel campione originale. Registrare eventuali differenze importanti nelle dimensioni o nell'aspetto delle placche.

Figura 2. Procedura per la preparazione di un prato batterico utilizzando l'agar superiore per l'enumerazione dei colifagi.

Figura 3. Placche fagiche su un prato batterico.

¹E. coli ceppo ATCC 15597 di solito produce il maggior numero di placche da campioni di acque reflue. Deve essere coltivato durante la notte in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL contenente 100 mL di brodo di soia nutriente o triptasi e incubato in condizioni di agitazione a 35 °C. 3 ore prima del saggio fagico inoculare un mL di questa coltura in un matraccio fresco contenente 100 ml di brodo di soia nutriente o triptasi e posto in un bagno d'acqua tremante a 35-37 °C. Ciò garantirà che i batteri siano nella fase di log della crescita.