1. Preparazione delle diluizioni del suolo

1. Per iniziare la procedura, pesare 10 g di campione di terreno e aggiungere a 95 ml di acqua deionizzata. Agitare bene la sospensione ed etichettare come "A".
2. Prima che il terreno si depositi, rimuovere 1 mL della sospensione con una pipetta sterile e trasferirla in un bianco d'acqua deionizzata da 9 mL. Vortice completo, ed etichetta come "B".
3. Ripetere questa fase di diluizione tre volte, ogni volta con 1 mL della sospensione precedente e uno spazio vuoto d'acqua deionizzato da 9 mL. Etichettali in sequenza come tubi C, D ed E. Ciò si traduce in diluizioni seriali da 10^-1 a 10^-5 grammi di terreno per mL

2. Realizzazione di piastre diffuse per la coltura batterica

1. Per far crescere le colonie batteriche, prendere tre piastre di agar peptone-lievito pre-preparate ed etichettarle come C, D ed E. Campioni di vortice C, D ed E e pipetta 0,1 ml su ciascun piatto. Questo aumenta ulteriormente il valore di diluizione, di un fattore dieci (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. Quindi, immergere uno spandi bicchiere nell'etanolo. Mettere lo spargitore in una fiamma per alcuni secondi per accendere e bruciare l'etanolo. Questo sterilizzerà lo spargitore.
3. Tenere lo spargitore sopra la prima piastra fino a quando la fiamma non si spegne. Aprire rapidamente la piastra, tenendo il coperchio vicino. Toccare lo spargitore all'agar lontano dall'inoculo (Inoculum = cellule utilizzate per iniziare una coltura) per raffreddare, quindi diffondere la goccia di inoculo intorno alla superficie dell'agar fino a quando le tracce di liquido libero scompaiono. Sostituire il coperchio della piastra.
4. Riafirgire lo spargitore e ripetere il processo con la piastra successiva, lavorando rapidamente in modo da non contaminare l'agar con organismi presenti nell'aria
5. Incubare le piastre batteriche a temperatura ambiente per 1 settimana. Assicurarsi che le piastre siano invertite durante l'incubazione per evitare che gocce di umidità dovute alla condensa cadano sulla superficie dell'agar.

3. Fare piastre di diffusione per Actinomiceti

1. Per coltivare actinomiceti, prendere tre piastre di glicerolo-caseina pre-preparate ed etichettarle come B, C e D. Usando le tecniche mostrate in precedenza, distribuire la piastra 0,1 ml dalle sospensioni B, C e D. Le diluizioni inferiori sono utilizzate perché gli actinomiceti sono tipicamente presenti come 1/10 ° della popolazione batterica (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Incubare le piastre di actinomicete (invertite) a temperatura ambiente per 2 settimane.

4. Conteggi batterici e actinomiceti

1. Dopo l'incubazione, esaminare attentamente tutte le piastre batteriche e notare le differenze nelle dimensioni e nella forma della colonia. Quando vengono coltivati su agar, i batteri producono colonie viscide che vanno dall'incolore all'arancione brillante, al giallo o al rosa. Al contrario, le colonie di actinomiceti sono gessose, sode, coriacee e si rompono sotto pressione, dove altre colonie batteriche si spalmano. Ciò consente alle colonie di essere distinte dal tocco con un anello sterile.
2. Contare e registrare il numero di colonie batteriche, compresi eventuali actinomiceti. Conta solo le piastre con 30-200 colonie per piatto.

5. Isolamento delle culture pure

1. Selezionare le singole colonie batteriche da una qualsiasi delle piastre. Più colonie possono essere selezionate se c'è particolare interesse per il suolo. Utilizzare una piastra ad alta diluizione, in quanto tende ad avere colonie pure che sono ben separate. Scegli solo colonie che sono ben separate dalle colonie vicine e sembrano morfologicamente distinte l'una dall'altra.
2. Sterilizzare il cappio immergendolo nell'alcool e infiammandolo. Apri rapidamente la capsula di Petri di interesse e tocca il cappio in un punto nudo nell'agar per raffreddarlo. Quindi, rimuovi una piccola quantità di una colonia di interesse sul loop.
3. Prendendo un piatto di lievito peptone fresco, fai una striscia lunga pochi centimetri su un lato. Sterilizzare e raffreddare di nuovo, quindi fare una striscia che attraversa la striscia iniziale solo al primo passaggio. Ripeti questo processo altre due volte nello stesso modo. Questa "diluizione" striata fa in modo che le cellule sul loop vengano separate l'una dall'altra. Posizionare la piastra in una zona buia per incubare a temperatura ambiente per due settimane.