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Environmental Microbiology

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Tecnica asettica nelle scienze ambientali

Panoramica

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Luisa Ikner

La tecnica asettica è un'abilità fondamentale ampiamente praticata nel campo della microbiologia ambientale che richiede un equilibrio tra consapevolezza e pratica in laboratorio. L'uso corretto di questa tecnica riduce la probabilità di contaminazione batterica o fungina di reagenti, mezzi di coltura e campioni ambientali. La tecnica asettica è anche vitale per garantire l'integrità dei dati e mantenere la purezza delle librerie di cultura che possono essere composte da isolati molto rari e difficili da colturare. Le fonti di contaminazione nell'ambiente di laboratorio includono microrganismi presenti nell'aria (compresi quelli che aderiscono a particelle di polvere e lanugine), microbi presenti sullo spazio di lavoro del banco di laboratorio o su vetreria o apparecchiature non sterilizzate e microbi trasferiti dal corpo e dai capelli del ricercatore. L'uso della tecnica asettica è anche una misura di sicurezza che riduce il potenziale di trasmissione di microrganismi ai ricercatori, il che è particolarmente importante quando si lavora con agenti patogeni.

Procedura

1. Preparazione per il lavoro asettico

Ottenere e applicare i seguenti DPI: camici da laboratorio, guanti in lattice o nitrile (privi di strappi o buchi) e occhiali di sicurezza (Figura 1). Per sicurezza in caso di utilizzo di una fiamma libera, legare i capelli lunghi.

Figura 1: DPI: un camice da laboratorio, guanti in lattice e occhiali di sicurezza.
Un secondo aspetto importante della tecnica a

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Risultati

L'esito della procedura dimostra una corretta tecnica asettica e una scarsa tecnica asettica. La Figura 7 illustra la contaminazione che può derivare da una scarsa tecnica asettica quando si versano piastre di agarose (piastra superiore: mezzo sterile; piastre inferiori: mezzi contaminati).

Figura 7: Contaminazione che può derivare da una scarsa tecnica asettica ..

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Applicazione e Riepilogo

Oltre all'utilizzo dei bruciatori Bunsen, gli ambienti di lavoro asettici possono anche essere mantenuti in postazioni di lavoro specializzate note come cappe a flusso laminare, che utilizzano un flusso d'aria diretto e filtri per mantenere la sterilità.

L'uso corretto della tecnica asettica è vitale per i microbiologi ambientali durante il campionamento sul campo e in laboratorio quando si lavora con mezzi, reagenti e isolati coltivati. Una scarsa tecnica asettica sul campo può comportar...

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Aseptic technique is a fundamental skill in microbiology, and has crucial applications in environmental research.

If microbiological cultures are contaminated, the time, labor, and financial costs that would be required of a lab to "clean up" or replace the cultures, particularly rare isolates from unique environments, could be very high and prohibitive, and some samples may be irreplaceable.

Proper use of aseptic techniques reduces the likelihood of bacterial and fungal contamination of reagents, culture media, and environmental samples, and also avoids cross-contamination between samples. It is also a safety measure that diminishes the potential transmission of microbes to the experimenter, which is especially important when working with pathogens.

This video will introduce the principles of asepsis; several important techniques to maintain sterile reagents and cultures; and finally, some of their uses in environmental science.

The goal of using aseptic techniques is to create and maintain a sterile working environment, equipment, and reagents, so as to minimize contamination of biological samples. Common sources of contamination include airborne microorganisms, microbes present on the laboratory bench or equipment, and those from the hair, body, and clothing of the researcher.

Two types of agents are central to removing or preventing contamination in the laboratory: disinfectant chemicals and heat. Solutions such as 70% ethanol and dilute bleach are often used to disinfect equipment, working surfaces, and experimenters' gloves before engaging in aseptic work.

At the same time, microbes on or in tools, glassware, and liquid media can be heat-killed in an autoclave, which is a chamber that sterilizes contents via exposure to high-temperature pressurized steam. In addition, tools such as glass rods used for spread plating and metal inoculation loops can be heat-sterilized using a flame source, such as a Bunsen burner.

The use of a flame source is also one of the most common ways to establish an aseptic working environment. The heat from the flame causes air convection, generating an updraft that lifts any airborne contaminants away from the vicinity of the burner, and creating a "sterile field" in which to conduct aseptic experimental work.

Now that you understand the principles behind aseptic techniques and why they are important, let's go through a protocol for creating an aseptic working environment, making up sterile growth media, and aseptically transferring bacteria between different culturing conditions.

Before beginning aseptic work, it is important for the experimenter to don proper personal protective equipment, or PPE. The purpose of this is both to prevent the experimenter from contaminating the samples and lab cultures, and also to prevent the transfer of potentially pathogenic microbes to the researcher. PPE items include a lab coat, gloves, and safety goggles.

The next step is to properly sterilize and store the growth media to be used for culturing the microbial samples. First, weigh out the proper amount of solid medium components, and add them to the proper volume of liquid solvent specified by the manufacturer, such as deionized water, in an autoclavable container Add a magnetic stir bar, place the container on a hot plate stirrer, and dissolve the solid medium components with low heat and stirring.

Close the medium containers. If using a glass vessel with screw-on cap, be sure to not tighten the cap completely, as the air inside the vessels will expand due to heating during autoclaving and needs to escape. Without escape, the gas could cause the vessel to rupture. Put a piece of autoclave tape on the vessels, and autoclave the media according to the manufacturer's instructions, such as 20 min at 121 °C. After autoclaving, verify that the stripes on the autoclave tapes turned black, indicating the proper temperature was reached.

For liquid growth media, let them cool to room temperature, and store them at room temperature or with refrigeration as appropriate. For agar-based solid growth media, let them cool to approximately 50 °C, then pour into sterile Petri dishes. Allow the agar to cool and solidify before storing at the appropriate temperature.

For media that cannot be autoclaved due to the presence of heat-sensitive components, filter sterilize using a 0.22-μm filter.

A core technique in microbiological work is to aseptically transfer bacterial cultures between different growth media, both solid and liquid. Prior to beginning, clean the lab bench surface with a disinfectant. This lowers the risk of contaminating cultures or sterile media.

Transferring bacterial cultures commonly makes use of a tool called an inoculating loop, which needs to be sterilized prior to use by heating in a flame.

Turn on a flame source. Slowly pass the inoculating loop through the tip of the flame. The loop will turn red hot. To transfer a bacterial colony from a solid agar plate, open the Petri plate slightly, and gently tap the hot inoculating loop onto an empty part of the agar surface to avoid heat-killing the bacteria. Scrape a single colony with the inoculating loop, and close the plate.

To transfer bacteria from a liquid growth medium, remove the cap from the culture container. To help prevent contamination, avoiding setting the cap down onto the bench. Pass the mouth of the container 2-3 times through the hottest portion of the flame. Then, carefully touch the hot, sterilized inoculation loop onto the inside of the container and let it cool before inserting it into the broth culture. Remove one loopful of the culture, and immediately close the cap.

For transferring the obtained bacteria to a sterile growth medium, remove the cap from a container with the sterile broth and pass the container's opening through the flame 2-3 times. Then, carefully lower the inoculation loop into the medium, and agitate gently to release the bacteria. Immediately close the cap. Sterilize the inoculation loop after use.

If transferring bacteria onto a sterile agar plate, open the lid of a fresh Petri plate with uninoculated agar. Streak the inoculation loop with the bacterial culture back-and-forth across one sector of the agar. Sterilize the loop and cool it by touching an empty part of the agar, then make another streak on the agar at an obtuse angle to the first streak, making sure to cross the first streak on the first 1-2 strokes but avoid touching the first streak on subsequent strokes. Repeat the sterilization and streaking 2 more times. Close the Petri plate, and sterilize the inoculation loop.

Once inoculated, the broth or agar plate should then be incubated at the ideal growth temperature for the given microorganism to obtain viable culture. On solid medium, a lawn or continuous strand of bacteria would be visible on agar covered by the first two streaks, but individual colonies should be obtained on the final streak. Poor aseptic techniques would result in the growth of mold and other contaminants on the plate.

Aseptic techniques are important in many experiments involving microbial samples from the environment. In this study, researchers isolated bacteriophages, which are bacteria-infecting viruses, from the common soil bacterium Arthrobacter. Arthrobacter cultures were first grown under aseptic conditions. Soil samples were then washed and filtered in phage buffer, and the phage solution was mixed with the bacterial culture and plated onto agar plates. A bacterial lawn would form on the plate, but there would be clearings, or "plaques", at spots where the virus had infected and killed the bacteria. Phage could then be purified from these plaques for further study.

Other than using Bunsen burners, aseptic working environments can also be maintained in specialized workstations known as laminar flow hoods, which use directed airflow and filters to maintain sterility. Here, scientists worked in a flow hood to isolate potential pathogenic bacteria and viruses from water samples. These isolates were then cultured together with amoebae. Because amoebae normally eat or "phagocytose" bacteria, any bacteria that were able to resist amoebal digestion and remain in these organisms can also potentially remain viable in human cells and cause diseases.

Finally, sterile conditions permit detailed study of ecological mechanisms such as the formation of root nodules in legume plants - bacteria-filled organs that "fix" atmospheric nitrogen into ammonia, which is used by the plant for growth. Researchers here created "microcosms" for studying the nodulation process using notched Petri plates with plant growth medium, placed seedlings into them and inoculated the seedlings with nodule-forming rhizobial bacteria. The aseptic environment of the flow hood prevents contamination of the cultures with other bacteria or fungi.

You've just watched JoVE's video on aseptic techniques in environmental science. You should now understand why aseptic working conditions are important; how to aseptically perform microbiological experiments; and some applications of aseptic techniques to environmental research. As always, thanks for watching!

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1. Preparazione per il lavoro asettico

Ottenere e applicare i seguenti DPI: camici da laboratorio, guanti in lattice o nitrile (privi di strappi o buchi) e occhiali di sicurezza (Figura 1). Per sicurezza in caso di utilizzo di una fiamma libera, legare i capelli lunghi.

Figura 1: DPI: un camice da laboratorio, guanti in lattice e occhiali di sicurezza.
Un secondo aspetto importante della tecnica asettica è la corretta sterilizzazione e conservazione dei mezzi/reagenti da utilizzare in laboratorio. Preparare il brodo liquido medio(ad esempio,brodo di soia tripttico) e il mezzo a base diagar (ad esempio,R2A) pesando la giusta quantità di polvere di base essiccata, che viene aggiunta alla quantità appropriata di acqua deionabilizzata.
Per il mezzo di brodo, sciogliere la polvere su una piastra calda a fuoco basso applicato ed erogare il liquido in volumi da 100 ml in palloni di vetro a vite o in volumi da 10 ml in provette a vite di vetro. Utilizzando una barra magnetica, mescolare il mezzo di agarose sull'agitatore a piastra calda fino a quando la polvere non è completamente sciolta.
Applicare il nastro adesivo per autoclave sui contenitori e autoclave il supporto secondo le istruzioni del produttore (ad esempio,20 min a 121 °C) (Figure 2 e 3). Si noti che il colore delle strisce sul nastro autoclave dovrebbe cambiare da bianco (pre-autoclave) a nero (post-autoclave). Sebbene il cambiamento di colore indichi generalmente che la sterilizzazione ha avuto successo, i controlli di sterilità utilizzando kit di strisce di spore possono essere condotti per verificare il processo di autoclave.

Figura 2: Nastro adesivo applicato al materiale.

Figura 3: Notare il cambiamento di colore delle strisce sul nastro autoclave dal bianco (pre-autoclave) al nero (post-autoclave).
Raffreddare i brodi liquidi a temperatura ambiente, quindi conservare a temperatura ambiente o refrigerati a 4 °C.
Raffreddare il mezzo di agarose mettendo il contenitore in un bagno d'acqua impostato a ~ 50 °C. Una volta raffreddato, il supporto può essere versato in piastre di Petri sterili. Lasciare raffreddare e solidificare il supporto, quindi consolidare per la conservazione alle temperature specificate dal produttore.
Esistono diverse varietà di terreni di coltura che non possono essere autoclavati poiché le alte temperature degradano gli ingredienti critici. La sterilizzazione di questi richiede la sterilizzazione del filtro utilizzando un sistema di filtrazione sotto vuoto che impiega un filtro da 0,22 μm, seguito dalla conservazione alla temperatura appropriata.
Prima di eseguire il lavoro sul banco, disinfettare la superficie utilizzando una soluzione appropriata(ad esempio,candeggina da 500 ppm). Ciò riduce il rischio di trasferire contaminanti dalla superficie di lavoro a colture e mezzi sterili.
Per stabilire un campo sterile, accendere un bruciatore Bunsen. Il tipo di fiamma più adatto per sterilizzare i circuiti di inoculazione del metallo è una fiamma blu intenso, con un cono blu definitivo osservato nel mezzo (Figura 4).

Figura 4: Un trasferimento di batteri da una piastra di Petri che mostra la crescita di un isolato coltivato a un'altra piastra di Petri non inoculata contenente un mezzo di crescita a base di agar.
Passare lentamente il ciclo di inoculazione attraverso la parte più calda della fiamma (punta del cono blu). Il loop dovrebbe diventare rovente ai fini della sterilizzazione.

2. Trasferimenti batterici: dalla piastra di Petri alla piastra di Petri

Uno scenario di trasferimento di batteri è da una piastra di Petri che mostra la crescita di un isolato coltivato a un'altra piastra di Petri sterile contenente un terreno di crescita a base di agar.
Per iniziare, aprire leggermente la piastra di Petri contenente la coltura batterica pura e picchiettare delicatamente il cappio inoculante caldo e sterilizzato sulla superficie dell'agar.
Recupera una colonia isolata dalla superficie della piastra usando l'anello di inoculazione raffreddato e chiudi la piastra di Petri.
Eseguire una striscia per l'isolamento utilizzando una piastra di Petri fresca contenente terreno di coltura, con il coperchio leggermente socchiuso.
Per ogni porzione della striscia di isolamento (3 totali per piastra), sterilizzare a fiamma il ciclo di inoculazione appena prima dell'uso. Inoltre, sterilizzare a fiamma il loop subito dopo l'esecuzione della striscia finale al fine di prevenire la contaminazione della superficie del banco e come considerazione per gli altri in laboratorio che potrebbero successivamente utilizzare o entrare in contatto con i loop di inoculazione.
Posizionare le piastre striate in un'incubatrice per la crescita durante la notte.

3. Trasferimenti batterici: dalla coltura del brodo alla piastra di Petri

Un secondo scenario di trasferimento di batteri è da una coltura di brodo che mostra crescita, come generalmente osservato dalla torbidità, a una piastra di Petri sterile contenente terreno di crescita.
Rimuovere il tappo dalla provetta (o pallone) contenente la coltura batterica pura e passare l'apertura del contenitore 2-3 volte attraverso la parte più calda della fiamma. Per evitare contaminazioni, non appoggiare il tappo sul piano di lavoro.
Abbassare con attenzione l'anello di inoculazione sterilizzato nel tubo/pallone e premere delicatamente contro il lato del contenitore per raffreddare appena prima dell'inserimento nella coltura del brodo.
Rimuovere un ciclo di coltura di brodo (Figura 5 )e sostituire immediatamente il tappo.

Figura 5: Un ciclo di cultura del brodo.
Eseguire una striscia per l'isolamento utilizzando una piastra di Petri fresca contenente terreno di coltura, con il coperchio leggermente socchiuso.
Per ogni porzione della striscia (3 totali per piastra), sterilizzare a fiamma il ciclo di inoculazione appena prima dell'uso. Inoltre, sterilizzare a fiamma il loop subito dopo l'esecuzione della striscia finale al fine di prevenire la contaminazione della superficie del banco e come considerazione per gli altri in laboratorio che potrebbero successivamente utilizzare i loop di inoculazione.
Posizionare le piastre striate per l'isolamento in un'incubatrice per la crescita durante la notte.

4. Trasferimenti batterici: dalla piastra di Petri con crescita al mezzo liquido sterile

Un terzo scenario di trasferimento di batteri è da una piastra di Petri contenente una striscia di coltura isolata a un tubo / pallone contenente un mezzo di crescita liquido sterile.
Aprire leggermente la piastra di Petri contenente la coltura batterica pura e raffreddare il ciclo di inoculazione caldo picchiettandolo delicatamente sulla superficie dell'agar.
Recupera una colonia isolata dalla superficie della piastra usando l'anello di inoculazione raffreddato e chiudi la piastra di Petri.
Rimuovere il tappo dalla provetta (o pallone) contenente il mezzo di coltura liquido sterile e passare l'apertura del contenitore 2 o 3 volte attraverso la parte più calda della fiamma. Per evitare contaminazioni, non appoggiare il tappo sul piano dilavoro.
Abbassare con attenzione la colonia estratta nel mezzo di brodo liquido e agitare delicatamente il cappio per rilasciare i batteri. Sostituire immediatamente il tappo.
Sterilizzare a fiamma il circuito di inoculazione al fine di prevenire la contaminazione della superficie del banco e come considerazione per gli altri in laboratorio che potrebbero successivamente utilizzare i loop di inoculazione.
Metti il pallone in un'incubatrice per la crescita durante la notte.
Rimuovere il pallone dall'incubazione il giorno successivo. Eseguire una serie di diluizione per enumerare la lingua.
Placcare le diluizioni della serie su mezzi di coltura di agarose e incubare le piastre durante la notte.
Rimuovere le piastre il giorno successivo e osservare eventuali contaminazioni.

5. Trasferimenti batterici: dalla coltura del brodo al mezzo di crescita liquido sterile

Un quarto scenario di trasferimento di batteri è da una coltura di brodo che mostra crescita a un tubo / pallone contenente un mezzo di crescita liquido sterile.
Rimuovere il tappo dalla provetta (o pallone) contenente la coltura batterica pura e passare due volte l'apertura del contenitore attraverso la parte più calda della fiamma. Per evitare contaminazioni, non appoggiare il tappo sul piano di lavoro.
Abbassare con attenzione l'anello di inoculazione nel tubo/pallone e premere delicatamente contro il lato del contenitore per raffreddare appena prima dell'inserimento nella coltura del brodo.
Rimuovere un ciclo di coltura di brodo e sostituire immediatamente il cappuccio.
Rimuovere il tappo dalla provetta (o pallone) contenente il mezzo di coltura liquido sterile e passare due volte l'apertura del contenitore attraverso la parte più calda della fiamma. Per evitare contaminazioni, non appoggiare il tappo sul piano di lavoro.
Abbassare con attenzione il loopful estratto nel mezzo di brodo liquido sterile e agitare delicatamente il loop per rilasciare i batteri. Sostituire immediatamente il tappo.
Sterilizzare a fiamma il circuito di inoculazione (Figura 6) al fine di prevenire la contaminazione della superficie del banco e come considerazione per gli altri in laboratorio che possono successivamente utilizzare i circuiti di inoculazione.

Figura 6: Ciclo di inoculazione che diventa rovente durante la sterilizzazione con un bruciatore Bunsen.
Metti il pallone in un'incubatrice per la crescita durante la notte.
Rimuovere il pallone dall'incubazione il giorno successivo. Eseguire una serie di diluizione per enumerare la lingua.
Placcare le diluizioni della serie su mezzi di coltura di agarose e incubare le piastre durante la notte.
Rimuovere le piastre il giorno successivo e osservare eventuali contaminazioni.

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Overview

1:10

Principles of Aseptic Technique

3:02

Preparation for Aseptic Work

5:10

Aseptic Transfer of Bacteria Between Liquid Media and Petri Plates

8:13

Applications

10:20

Summary

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