Fonte: Tilde Andersson¹, Rolf Lood^1
1 Dipartimento di Scienze Cliniche Lund, Divisione di Medicina delle Infezioni, Centro Biomedico, Università di Lund, 221 00 Lund, Svezia

I virus che infettano gli organismi procariotici, chiamati batteriofagi o semplicemente fagi, sono stati identificati all'inizio del 20^° secolo da Twort (1) e d'Hérelle (2) indipendentemente. Da allora i fagi sono stati ampiamente riconosciuti per il loro valore terapeutico (3) e la loro influenza sugli ecosistemi umani (4), così come globali (5). Le attuali preoccupazioni hanno alimentato un rinnovato interesse per l'uso dei fagi come alternativa ai moderni antibiotici nel trattamento delle malattie infettive (6). Essenzialmente tutta la ricerca sui fagi si basa sulla capacità di purificare e quantificare i virus, noto anche come titolo virale. Inizialmente descritto nel 1952, questo era lo scopo del test della placca (7). Decenni e molteplici progressi tecnologici dopo, il test della placca rimane uno dei metodi più affidabili per la determinazione del titolo virale (8).

I batteriofagi sopravvivono iniettando il loro materiale genetico nelle cellule ospiti, dirottando i macchinari per la produzione di nuove particelle fagiche e alla fine causando all'ospite di rilasciare numerosi virioni di progenie attraverso la lisi cellulare. A causa delle loro dimensioni ridotte, i batteriofagi non possono essere osservati usando esclusivamente la microscopia ottica; pertanto, è necessaria la microscopia elettronica a scansione (Figura 1). Inoltre, i fagi non possono essere coltivati su piastre di agar nutrizionali come i batteri, poiché hanno bisogno di cellule ospiti per predare.

Figura 1: La morfologia di un batteriofago, qui esemplificata da un fago di E. coli, può essere studiata utilizzando la microscopia elettronica a scansione. La maggior parte dei batteriofagi appartiene a Caudovirales (batteriofagi dalla coda). Questo particolare fago ha una struttura della coda molto corta e una testa icosaedrica, collocandolo nella famiglia dei Podovirus.

Il test della placca (Figura 2) si basa sull'incorporazione di cellule ospiti, preferenzialmente in fase logaritmica, nel mezzo. Questo crea uno strato denso e torbido di batteri in grado di sostenere la crescita virale. Un fago isolato può successivamente infettare, replicarsi all'interno e lisi di una cellula. Con ogni cellula lsata, più cellule adiacenti vengono immediatamente infettate. Diversi cicli in, una zona chiara (una placca) possono essere osservati nella piastra altrimenti torbida (Figura 2B / Figura 3A), indicando la presenza di quella che inizialmente era una singola particella batteriofago. Il numero di unità formanti placche per volume(cioè PFU/mL) di un campione, può quindi essere determinato dal numero di placche generate.

Figura 2: Il test per le unità formanti placche (PFU) è un metodo comune per determinare il numero di batteriofagi in un campione. (A) La base di una capsula di Petri sterile è coperta da un adeguato mezzo nutritivo solido, seguito da una miscela di mezzi molli, cellule ospiti sensibili e una diluizione del campione di batteriofago originale. Si noti che la sospensione dei fagi potrebbe, in alcuni casi, anche essere distribuita uniformemente sulla superficie dell'agar morbido già solidificato. (B) La crescita dei batteri ospiti forma un prato di cellule nello strato superiore di agar. La replicazione dei batteriofagi genera zone chiare, o placche, causate dalla lisi delle cellule ospiti.

Figura 3: I risultati del test PFU mostrano placche multiple generate da batteriofagi. A causa della lisi delle cellule ospiti sensibili, le placche possono essere viste come zone di pulizia nel prato batterico, sia con (A) clearance completa, sia (B) parziale ricrescita causata dalla generazione di batteri resistenti (o possibilmente da fagi temperati nel ciclo lisogenico).

Alcuni fagi temperati possono adottare quello che viene definito un ciclo di vita litogenico, oltre alla crescita litica precedentemente descritta. Nella lisogenia, il virus assume uno stato latente attraverso l'incorporazione del suo materiale genetico nel genoma della cellula ospite (9), spesso conferendo resistenza a ulteriori infezioni fagiche. Questo a volte si rivela attraverso un leggero annebbiamento della placca (Figura 3B). Vale la pena notare, tuttavia, che le placche possono anche apparire sfocate a causa della ricrescita di batteri che hanno sviluppato resistenza al fago indipendentemente dalle precedenti infezioni dei fagi.

I virus possono attaccarsi, o adsorbire, solo a una gamma limitata di batteri ospiti (10). Gli intervalli dell'ospite sono ulteriormente limitati da strategie antivirali intracellulari come il sistema CRISPR-Cas (11). La resistenza/sensibilità verso specifici fagi mostrati da sottogruppi batterici è stata storicamente utilizzata per classificare i ceppi batterici in diversi tipi di fagi (Figura 4). Sebbene l'efficacia di questo metodo sia stata ora superata da nuove tecniche di sequenziamento, la tipizzazione dei fagi può ancora fornire preziose informazioni sulle interazioni batterio-fago, ad esempio, facilitando la progettazione di un cocktail di fagi per uso clinico.

Figura 4: Sensibilità ai fagi di diversi ceppi batterici. Le piastre di agar morbido con Cutibacterium acnes ceppo (A) AD27 e (B) AD35, sono state individuate con 21 diversi batteriofagi di C. acnes. Solo il fago 11 è stato in grado di infettare e uccidere AD27 mentre il ceppo AD35 ha mostrato sensibilità verso tutti i fagi. Questa tecnica, chiamata tipizzazione dei fagi, può essere utilizzata per dividere specie e ceppi batterici in diversi sottogruppi in base alla suscettibilità dei fagi.

1. Configurazione

1. Prima di iniziare qualsiasi lavoro che coinvolga i microbi, assicurarsi che lo spazio di lavoro sia sterilizzato(ad esempio pulito con etanolo al 70%). Indossare sempre un cappotto da laboratorio e guanti, tenere i capelli lunghi legati all'indietro e assicurarsi che eventuali ferite siano particolarmente ben protette.
2. Al termine, sterilizzare tutte le superfici e lavare accuratamente / sterilizzare mani e polsi.

2. Pr

Nonostante i molteplici progressi tecnologici, i saggi della placca rimangono il gold standard per la determinazione del titolo virale (come PFU) ed essenziali per l'isolamento delle popolazioni di batteriofagi puri. Le cellule ospiti sensibili vengono coltivate nel rivestimento superiore di una piastra di agar a due strati, formando un letto omogeneo che consente la replicazione virale. L'evento iniziale in cui un batteriofago isolato nel ciclo di vita della lirica infetta una cellula, si replica al suo interno e alla f

1. Twort, F. An investigation on the nature of ultra-microscopic viruses. Lancet. 186 (4814): 1241-1243. (1915)
2. d'Hérelle, F. An invisible antagonist microbe of dysentery bacillus. Comptes Rendus Hebdomadaires Des Seances De L Academie Des Sciences. 165: 373-375. (1917)
3. Cisek AA, Dąbrowska I, Gregorczyk KP, Wyżewski Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2):277-283. (2017)
4. Mirzaei MK, Maurice CF. Ménage à trois in the human gut: interactions between host, bacteria and phages. Nature Reviews Microbiology. 15 (7):397. (2017)
5. Breitbart M, Bonnain C, Malki K, Sawaya NA. Phage puppet masters of the marine microbial realm. Nature Microbiology. 3 (7):754-766. (2018)
6. Leung CY, Weitz JS. Modeling the synergistic elimination of bacteria by phage and the innate immune system. Journal of Theoretical Biology. 429:241-252. (2017)
7. Dulbecco R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 38 (8):747-752. (1952)
8. Juarez D, Long KC, Aguilar P, Kochel TJ, Halsey ES. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J Virol Methods. 187 (1):185-9. (2013)
9. Clokie MRJ, Millard AD, Letarov AV, Heaphy S. 2011. Phages in nature. Bacteriophage. 1 (1):31-45. (2011)
10. Moldovan R, Chapman-McQuiston E, Wu XL. On kinetics of phage adsorption. Biophys J. 93 (1):303-15. (2007)
11. Garneau JE, Dupuis M-È, Villion M, Romero DA, Barrangou R, Boyaval P, Fremaux C, Horvath P, Magadán AH, Moineau S.. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320):67. (2010)