Test di calore dolore utilizzando il Thermostimulator TSA II 1. Introduzione <ol><li> Questa procedura utilizza il TSA II, disponibile in commercio termo-analizzatore sensoriale che offre stimoli di calore alla pelle con un thermode (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Un&#39;unità centrale genera e trasmette il segnale al thermode. Questo segnale è controllato dal software proprietario in genere archiviati su un computer portatile collegato all&#39;unità centrale. Anche associate alle unità centrale è un portatile di controllo che permette ad un oggetto di studio per fermare il riscaldamento del thermode. </li><li> Sette gli stimoli di calore sequenziale e identici sono consegnati, con inter-stimolo intervalli di 30 anni. La temperatura basale thermode è fissato ad un comodo 35 ° C. La velocità con cui il thermode riscalda è fissata al 1 º C / s, mentre il tasso a cui si raffredda è fissato a 10 º C / s. La temperatura massima thermode è impostato a 52 ° C. </li></ol> 2. Preparazione e formazione i soggetti <ol><li> Per preparare i soggetti per la sede di prova di calore dolore li comodamente su una sedia reclinabile che fornisce il supporto adeguato per la testa, braccia e gambe. La sedia dovrebbe inoltre consentire un facile accesso ai siti del corpo esaminato. </li><li> L&#39;impianto di prova deve essere a temperatura ambiente confortevole, e fornire un ambiente tranquillo e neutro, senza distrazioni. </li><li> Prima di iniziare l&#39;esperimento, tutti i partecipanti devono essere ben preparati in tutti gli aspetti del dolore test di calore. La formazione può avvenire in qualsiasi momento prima dell&#39;esperimento. </li><li> Le interazioni tra soggetti dello studio e gli investigatori dovrebbero essere limitate a quelle necessarie per la raccolta dei dati. Scherzi e chiacchiere sono scoraggiati perché possono compromettere la coerenza dei dati. Soggetti in studio sono informati che le interazioni intenzionalmente essere un po &#39;monotona e neutrale durante gli esperimenti. </li><li> Conservare le istruzioni chiare, semplici e coerenti. Sottolineare che il dolore è soggettivo, e non ci sono risposte giuste o sbagliate. E &#39;più importante essere coerenti. Definire la soglia del dolore di calore come il punto tra l&#39;essere &quot;in procinto di essere doloroso&quot; e &quot;appena diventato doloroso.&quot; </li><li> È fondamentale che un soggetto sa esattamente cosa aspettarsi nel corso di una sessione di test. Qualsiasi &quot;sorprese&quot; potrebbero risultare in meno di dati coerenti, in quanto fattori di confondimento come l&#39;ansia può essere generato. Per esempio, se sette stimoli dolorosi di calore sono utilizzati per determinare la soglia del dolore di calore, il soggetto deve sapere questo. </li><li> In qualsiasi momento, il soggetto può fermare il thermode da ottenere alcun caldo premendo il pulsante di un portatile di controllo. Avere il controllo sarà ridurre l&#39;ansia del soggetto e rendere i dati più affidabili. </li><li> La sessione di formazione offre l&#39;opportunità di valutare le prestazioni di un soggetto di studio. Può essere meglio di formare soggetti in 2-4 cicli di prova così la loro soglia del dolore individuale variano da un massimo di 0,8 ° C, e, idealmente, da non più di 0,6 ° C tra le ultime due cicli di prova. I soggetti che non riescono a svolgere sempre sono in genere esclusi dallo studio. </li></ol> 3. Determinazione della soglia del dolore <ol><li> Per iniziare i cicli di test di soglia del dolore segnare la posizione del thermode sulla pelle del soggetto. In questo esperimento la lesione stessa pelle infiammata utilizzato per microdialisi saranno testati per il dolore di conoscere biochimiche rilasciato in risposta al test dolore. </li><li> Poi, iniziare ciascun ciclo ponendo il thermode sulla zona della pelle segnata. Corrispondere alla posizione del thermode con le marcature il più fedelmente possibile. Lasciare che la temperatura tra la pelle e il thermode per equilibrare a 35 ° C - una temperatura che in modo sicuro causerà alcun dolore. Questo richiederà circa 5 secondi e sarà indicato da una lettura di 35 ° C sullo schermo del computer. </li><li> Prima di iniziare, dare la mano il controllo al soggetto. </li><li> Utilizzare una pressione costante e delicata per mantenere l&#39;intera superficie del thermode in pieno contatto con la pelle del soggetto durante i test. </li><li> Ora inizia la pre-programmati algoritmo di prova. Il thermode inizierà riscaldamento fino a 1 ° C / s. Non appena il dolore soggetto esperienze, faranno premere il dispositivo portatile. </li><li> Dopo la pressione del pulsante sul dispositivo portatile, il dolore temperatura thermode causando verrà registrato automaticamente e inizierà a diminuire a un ritmo di 10 ° C / s fino alla sua temperatura basale di 35 ° C. </li><li> La sonda di temperatura viene automaticamente mantenuto a 35 ° C per 30 s prima che inizia a salire di nuovo a 1 ° C / s, fino a quando un soggetto spinge di nuovo il tasto del dispositivo portatile. Appena prima che la temperatura thermode è in procinto di aumentare ancora una volta, ricordare al soggetto che sta per accadere. Ciò manterrà il soggetto a fuoco. </li><li> Questa sequenza viene ripetuta fino a sette registrazioni di temperatura sono stati registrati. Calcolare la media di questi temletture ratura, questa è la soglia del dolore di calore. </li></ol> Dolore prove meccaniche con sonde di pressione punteggiati 1. Introduzione <ol><li> Noi usiamo le sonde calibrate su misura pressione punteggiato, perché forniscono risultati più coerenti rispetto alle tradizionalmente utilizzate e disponibili in commercio peli von Frey. Le sonde sono fatti di fili identici cilindrico in acciaio inox (240 micron di diametro), montato su barre di rame di vario peso (1, 2, 4, 8, 16, 32, 49, 64, e 81 grammi) che si muovono liberamente all&#39;interno di un più ampio a mano tenuto tubo di alluminio. </li><li> Le stesse condizioni generali sperimentali descritte per il test di calore dolore si applicano ai test dolore meccanico. I soggetti devono essere ben preparati e formati. E &#39;particolarmente importante per rassicurare i soggetti che le sonde sono smussati e non forare la pelle. Questo aiuterà i soggetti di rilassarsi e di fornire dati coerenti. </li></ol> 2. Determinazione della soglia del dolore meccanico <ol><li> Per determinare la soglia del dolore meccanico, applicare prima la punta del filo di acciaio più leggeri sonda perpendicolarmente alla pelle, al centro della lesione sperimentalmente infiammata. </li><li> Il portatile tubo di alluminio viene poi abbassata verso la pelle senza toccarlo. In questo modo, l&#39;intero peso del rame all&#39;interno del tubo di alluminio poggia sulla punta filo d&#39;acciaio. </li><li> Il soggetto studio indica poi se la sonda provoca dolore dicendo &quot;sì&quot; o &quot;no&quot;. </li><li> Se il soggetto risponde &quot;no&quot;, allora o la sonda stesso o quello successivo sonda più pesanti saranno utilizzati prossimo. Questo algoritmo si chiama una sequenza di stimolazione ascendente. Casualmente determinare se la sonda successivo è più pesante o dello stesso peso. Ciò manterrà un soggetto cieco per l&#39;algoritmo. </li><li> Applicare le sonde in ordine crescente fino a quando un soggetto risponde &quot;sì&quot;. Il peso medio degli ultimi due sonde di questa serie viene registrato come il punto di deflessione per primo. </li><li> Dopo che il soggetto risponde &quot;sì&quot;, iniziare ad usare una sequenza di stimolazione discendente, e utilizzare una sonda più chiara o la sonda stessa di prima. Casualmente determinare se la sonda successivo è più leggero o dello stesso peso. Ciò manterrà un soggetto cieco per l&#39;algoritmo. </li><li> Applicare le sonde in una sequenza discendente fino alla risposta del soggetto &quot;no&quot;. Il peso medio degli ultimi due sonde in questa sequenza costituiscono il secondo punto di deflessione. </li><li> Quando il soggetto risponde &quot;no&quot;, tornare a una sequenza di stimolazione ascendente. Si alternano tra ascesa e discesa sequenze fino a sette punti di rinvio sono registrati. La media di questi sette punti è la soglia del dolore meccanico. </li></ol>

<ol>
	<li>Angst, M. S., Clark, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comment+on+Koltzenburg+et+al.:+Differential+sensitivity+of+three+experimental+pain+models+in+detecting+the+analgesic+effects+of+transdermal+fentanyl+and+buprenorphine.">Comment on Koltzenburg et al.: Differential sensitivity of three experimental pain models in detecting the analgesic effects of transdermal fentanyl and buprenorphine.</a> Pain. 126, 165-174 (2006).</li><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation,+noxious+stimulation,+and+administration+of+a+COX-inhibitor:+A+microdialysis+study.">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation, and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. , (2008).</li><li>Angst, M. S., Koppert, W., Pahl, I., Clark, J. D., Schmelz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+infusion+of+the+mu-opioid+agonist+remifentanil+in+humans+causes+hyperalgesia+during+withdrawal.">Short-term infusion of the mu-opioid agonist remifentanil in humans causes hyperalgesia during withdrawal.</a> Pain. 106, 49-57 (2003).</li><li>Lotsch, J., Angst, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mu-opioid+agonist+remifentanil+attenuates+hyperalgesia+evoked+by+blunt+and+punctuated+stimuli+with+different+potency:+a+pharmacological+evaluation+of+the+freeze+lesion+in+humans.">The mu-opioid agonist remifentanil attenuates hyperalgesia evoked by blunt and punctuated stimuli with different potency: a pharmacological evaluation of the freeze lesion in humans.</a> Pain. 102, 151-161 (2003).</li></ol>

Questo video dimostra algoritmi per la valutazione della soglia del dolore termico e meccanico in pelle infiammata di volontari umani. La percezione del dolore è soggettiva. Raccolta dei dati di dolore adeguata richiede un apposito centro di test (ad esempio tranquillo e confortante), la formazione completa dei partecipanti allo studio con incorporato misure di qualità dei dati di controllo (test-retest), il rispetto rigoroso di un protocollo di studio standardizzato, e di evitare fattori di confondimento (ad esempio lo stress, ansia). Dati affidabili soggettiva sensibilità al dolore, in coppia con interventi come la somministrazione di un farmaco analgesico e la raccolta di dati meccanicistici come il rilascio locale di mediatori nocicettivo fornire informazioni preziose sui meccanismi del dolore, e dei mezzi per prevenire o attenuare esso.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>TSA-II Neuro Sensory Analyzer</td>
<td>Tool</td>
<td>Medoc Advanced Medical Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puntuated Pressure Probes</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alternatively, commercially available von Frey Hairs can be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In un precedente articolo sul Journal of Experiments Visualizzato abbiamo dimostrato tecniche di microdialisi pelle per la raccolta di sostanze biochimiche infiammatorie nocicettivo e tessuto-specifica negli esseri umani. In questo articolo mostreremo dolore test paradigmi che vengono spesso utilizzati in tandem con le procedure di microdialisi. La combinazione di test di dolore con microdialisi fornisce il collegamento fondamentale tra i dati comportamentali e biochimici che permette di identificare sostanze biochimiche chiave responsabile della generazione e propagazione del dolore. Due modelli di dolore che evoca in pelle infiammata dei partecipanti allo studio umano sono mostrati. Il primo modello evoca il dolore con l&#39;aiuto di stimoli di calore. Il dolore di calore evocato come descritto qui è mediato principalmente da piccole fibre periferiche non mieliniche nervose nocicettive (fibre-C). Il secondo modello evoca il dolore attraverso gli stimoli della pressione punteggiato. Dolore pressione punteggiato evocata è mediato principalmente da piccole fibre mieliniche dei nervi periferici nocicettive (fibre A-delta). I due modelli sono meccanicamente distinte e indipendenti esaminare l&#39;elaborazione nocicettivo dalle due popolazioni di fibre del nervo periferico principali coinvolti nella segnalazione dolore. Il calore è il dolore evocato con l&#39;aiuto del TSA II, disponibile in commercio termo-analizzatore sensoriale (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Configurazione dello stimolo e la consegna è gestita con l&#39;aiuto di software specifici. Thermodes variano in dimensioni e forma, ma in linea di principio costituiti da una piastra metallica che può essere riscaldata o raffreddata a tassi diversi e per periodi di tempo diversi. Algoritmi di valutazione calore evocato il dolore sono molteplici. Negli esperimenti qui, partecipanti allo studio sono pregati di indicare a che punto iniziano a sperimentare il dolore, mentre il thermode in contatto con la pelle viene riscaldata ad un tasso prestabilito a partire da una temperatura che non evoca il dolore. Thermode la temperatura alla quale un soggetto inizia a sperimentare il dolore costituisce la soglia del dolore di calore. Dolore meccanico è evocata con sonde punteggiato. Queste sonde sono disponibili in commercio da diversi produttori (peli von Frey). Tuttavia, l&#39;accuratezza di von Frey capelli è stato criticato e molti ricercatori utilizzano sonde di misura della pressione punteggiato. Negli esperimenti qui otto sonde punteggiato misura di peso diverso vengono applicate in ordine consecutivo, una procedura chiamata up-down algoritmo, per identificare i punti di rinvio percettive, cioè un cambiamento da non sentire dolore per provare dolore o viceversa. Il peso medio causando una flessione percettive costituisce la soglia del dolore meccanico.

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Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Algoritmi di valutare la soglia del dolore termico e meccanico in pelle sperimentalmente infiammata di soggetti umani studio sono mostrati. I due paradigmi di prova dolore nocicettivo indipendentemente esaminare l&#39;elaborazione da parte dei due principali popolazioni nervo periferico in fibra di trasmissione del dolore, cioè, non mieliniche delle fibre C e piccole mieliniche A-delta fibre.

Determinazione calore e soglia del dolore meccanico in pelle infiammata dei soggetti umani

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

determining-heat-mechanical-pain-threshold-inflamed-skin-human

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  Stanford University School of Medicine. Algoritmi di valutare la soglia del dolore termico e meccanico in pelle sperimentalmente infiammata di soggetti umani studio sono mostrati. I due paradigmi di prova dolore nocicettivo indipendentemente esaminare l'elaborazione da parte dei due principali popolazioni nervo periferico in fibra di trasmissione del dolore, cioè, non mieliniche delle fibre C e piccole mieliniche A-delta fibre.

Video: Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizzando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) per sviluppare strumenti diagnostici

Ricerca

Biologia

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Trapianto di pelle murina

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

L&#39;impianto di ingegneria tessutale nel Cuore Rat

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

Dimostrazione di Allodinia cutanea In associazione con dolore pelvico cronico

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura embrionali di topo della pelle e live-imaging delle Migrazioni Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Here we present a method to measure organismal fat levels in the third instar (L3) larval stage of Drosophila melanogaster. This method exploits the comparatively low density of fat tissue to differentiate between larvae with altered fat stores. Buoyancy-based analysis is a valuable tool for rapid, reproducible, and economical screening.

Un metodo galleggiabilità a base della determinazione dei livelli di grasso nel<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...