Name: low-density primary hippocampal neuron culture
Uploaded: 2017-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 46 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da CIHR MOP-142.209 a TJS.

Tutti gli esperimenti e protocolli che utilizzano animali da laboratorio sono stati approvati dal comitato etico dell&#39;Università di Manitoba animali ed erano conformi alle linee guida del Canadian Council on Animal Care. 1. Preparazione di strumenti, Tamponi e soluzioni <ol><li> Sterilizzare in autoclave tutte le apparecchiature dissezione, pipette Pasteur in vetro, le punte delle pipette, apparecchio filtrante, e acqua deionizzata. </li><li> Preparare un 20% (w / v; 1,1 M) soluzione madre di glucosio in acqua deionizzata e filtro-sterilizzare. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare una soluzione 100 mM di piruvato di sodio in acqua deionizzata e filtro-sterilizzare. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione salina bilanciata calcio-magnesio e privo di Hank (HBSS-CMF) facendo una soluzione di 10% HBSS (10x), 10 mM HEPES, e 100 U / ml di penicillina-streptomicina in acqua deionizzata. Conservare a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi. </li><li> Preparare 10 mg / mL deossiribonucleasi I (DNasi) in CMF-HBSS,e poi filtrare-sterilizzare e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare mezzo gliale facendo una soluzione di 30 mM glucosio (dalla soluzione sterile), 95 U / ml di penicillina-streptomicina, e 10-15% di siero bovino della crescita (BGS) in Minimum Essential Medium (MEM). NOTA: Come indicato nel protocollo, una soluzione di 5% BGS può essere utilizzato, se necessario per rallentare la proliferazione cellulare. Cavallo siero può essere usato al posto di BGS, ma si noti che ogni partita deve essere testato prima dell&#39;utilizzo a causa di variazione inter-lotti. Conservare la soluzione preparata a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi. Anche se molti laboratori utilizzano FBS, abbiamo costantemente osservato che la crescita gliali in BGS è così robusta come in FBS. BGS è derivato da siero di vitello fetale che è integrato con componenti chimicamente definite. Inoltre, BGS è sostanzialmente più economico di FBS. </li><li> Preparare la crescita neurone e mezzo di mantenimento (Neurobasal-B27, ETE) facendo una soluzione di 1x B27 supplemento e 0,5 mM di L-glutammina in 500 mL Neurobasal Medium. Conservare a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi. L-glutammina può essere sostituito con Glutamax, che è stato suggerito di essere più stabili nel mezzo di crescita. </li><li> Preparare il neurone placcatura mezzo facendo una soluzione di 30 mM glucosio (dalla soluzione sterile), 1 mM sodio piruvato (dalla soluzione sterile), e il 10% in BGS MEM. Conservare a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi. </li><li> Preparare una soluzione di 1 mM citarabina (Ara-C) e filtro-sterilizzare. Aliquotare in 1 porzioni ml e conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare una soluzione di 100 mM APV in 100 mN sterilizzata per filtrazione NaOH. Conservare a -20 ° C. </li><li> Sciogliere 1 mg / ml di poli-L-lisina in tampone borato, pH 8,5 (50 mM di acido borico e 12 mM borace) e filtro-sterilizzare. Aliquotare e conservare a -20 ° C. Invece di poli-L-lisina, si può usare poli-L-ornitina che può essere meno tossico per le cellule. </li></ol> 2. Preparazione Glia Culture <ol><li> Preparare coltura cellulare astroglia corticale <ol><li&gt; Ottenere cuccioli di ratto entro 24 ore dalla nascita. Posizionare i cuccioli sul ghiaccio anestetizzare loro. </li><li> Spruzzare i cuccioli con il 70% di etanolo e di decapitarlo. </li><li> Posizionare le testine in un piatto 100 mm su ghiaccio contenente 15 mL CMF-HBSS. </li><li> Sezionare ogni cervello tagliando il cuoio capelluto, aprendo il cranio, tagliando il tronco cerebrale, e poi trasferire il cervello a 60 mm di Petri su ghiaccio contenente 3 mL CMF-HBSS. </li><li> Separare gli emisferi cerebrali dalla dell&#39;ippocampo e poi spogliare le meningi li circondano. Esercitare precauzioni adeguate per garantire la contaminazione minimo da fibroblasti meningei. fibroblasti meningei nella cultura può competere con glia per la crescita ed essere dannoso per la salute dei neuroni. Raccogliere tutti gli emisferi cerebrali in 60 mm Petri su ghiaccio contenente 5 ml di CMF-HBSS. </li><li> Rimuovere la CMF-HBSS e poi tritare il tessuto corticale raccolto più finemente possibile utilizzare molle-forbici micro-dissezione. </li><li> Aggiungere sufficiente CMF-HBSS per il tagliotessuti PED. Usando una pipetta Pasteur di vetro, trasferire i pezzi di tessuto in una provetta da 15 ml. Portare il volume totale di 12 ml con l&#39;aggiunta di CMF-HBSS. </li><li> Aggiungere 1,5 ml ciascuna del 2,5% tripsina e 10 mg / mL di soluzione DNasi. Incubare la miscela risultante a 37 ° C a bagnomaria per 12 min. </li><li> Triturare il tessuto 10-15 volte usando una pipetta Pasteur di vetro, e in seguito incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 3 min. </li><li> Filtrare il surnatante con foglio lente o una rete filtrante in una provetta da 50 ml contenente 5 ml di BGS. Questo viene fatto per rimuovere pezzi di tessuto non dissociato. In alternativa, utilizzare filtri cellulari disponibili in commercio. </li><li> Aggiungere 13,5 ml di CMF-HBSS e 1,5 ml di 2,5% tripsina al tubo contenente i pezzi di tessuto rimanenti e in seguito incubare a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua per altri 10 min. </li><li> Triturare il tessuto rimanente ancora una volta, e poi filtrare nuovamente la sospensione nella provetta da 50 ml contenente il filtrato iniziale. Avanti, sciacquare il lecarta ns con 3 mL di BGS. Il volume finale deve essere di circa 38 mL. </li><li> Centrifugare la sospensione contenente le cellule gliali dissociate per 6 minuti a 130 x g. Eliminare attentamente il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Assicurarsi che le cellule pellet in fondo non sono disturbati. Il fondo del pellet appare leggermente rossastro contenenti componenti del sangue. </li><li> Trasferire le cellule gliali in 1 ml di mezzo gliale in una nuova provetta, facendo attenzione a non disturbare la porzione rossastra del pellet. </li><li> Aggiungere fino a 2 ml di terreno gliali ogni cucciolo per sospendere di nuovo il combinato dissociato cellule gliali. Ad esempio, se 10 cuccioli sono stati utilizzati, e quindi il volume totale risospensione sarebbero 20 mL. </li><li> Preparare cultura beuta una compressa da 75 cm2 di cellule per cucciolo. Aggiungere 18 ml di pre-riscaldato medio gliale ad ogni pallone. </li><li> Trasferire 2 ml di sospensione cellulare a ciascuna beuta e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Dopo un giorno, sostituirli con 20 mL gliale medium. In questa fase, la cultura è un mix di gliali e di altri tipi di cellule indesiderate. </li><li> Quattro giorni dopo la semina delle cellule, vigorosamente scuotere i palloni per staccare le cellule non-astrociti. Per fare questo, lavare i flaconi una volta con CMF-HBSS, e quindi aggiungere 10 ml fresca CMF-HBSS ad ogni pallone. Agitare vigorosamente i palloni 5-10 volte, e quindi aspirare al largo della CMF-HBSS. Risciacquare due volte con CMF-HBSS, e poi aggiungere 20 ml di media gliali. NOTA: Questo passaggio è fondamentale per garantire la rimozione di tipi di cellule non bersaglio, e non dovrebbe comportare la perdita delle astrociti desiderati. </li><li> Sostituire con terreno gliale fresco due volte a settimana fino a quando le cellule sono confluenti (Figura 1). </li></ol></li><li> congelamento glia <ol><li> Una volta che le colture sono confluenti, aspirare off medio e lavare il monostrato cellulare con 10 mL di CMF-HBSS. </li><li> Aggiungere 10 ml di 0,25% tripsina / EDTA a ciascun pallone e incubare a 37 ° C per 3 min. </li><li> Toccare fiaschi delicatamente per sloggiare le cellule. Aggiungere 1 ml BGS to ciascun pallone e trasferire le sospensioni cellulari in 15 provette ml. </li><li> Centrifugare le provette a 130 xg per 6 min. Eliminare il surnatante risultante. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno gliale. </li><li> Preparare il mezzo di congelamento gliale (1-parte dimetilsolfossido e 4-parti BGS). Aggiungere 0,5 ml di questa soluzione a ciascuno dei 4 fiale criogeniche per bombola. </li><li> Trasferire 0,5 ml di sospensione cellulare per ogni fiala, e poi congelare le cellule lentamente ponendo i flaconi in un contenitore isolato in un congelatore C -80 ° durante la notte. Dopo un giorno, trasferire le fiale per un congelatore azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol></li><li> Placcatura rivivere glia <ol><li> glia piastra 1-2 settimane prima del giorno cultura neurone. </li><li> Preparare una provetta da 50 ml con 10 ml riscaldato medio gliale. </li><li> Scongelare 1 fiala congelata di cellule gliali in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 2-3 min. </li><li> Trasferire il contenuto della fiala nella provetta da 50 ml contenente 10 ml di mezzo gliale. </li><li> Centrifuge il tubo per 5 minuti a 130 xg ed aspirare il sopranatante. </li><li> Risospendere il pellet in 20 mL di terreno gliale. </li><li> Aggiungere 3 mL di terreno fresco gliali a ciascuna delle piastre di coltura (60 mm), e quindi trasferire 1 ml di sospensione cellulare per ogni piatto. Incubare le colture a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Nutrire le cellule due volte a settimana. Se la densità cellulare raggiunge% di confluenza 50 ben prima del giorno cultura neurone, passa a mezzo gliale contenente 5% BGS per rallentare il tasso di crescita gliale. La confluenza desiderato del monostrato gliali cultura neurone è del 50% - 70%. </li><li> Sostituire il mezzo gliale con il mezzo NBG (6 mL / piatto) 1-2 giorni prima della cultura neurone. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione Coverslip <ol><li> Pulizia e la preparazione di perline di paraffina <ol><li> Immergere coprioggetto in acido nitrico concentrato (70% p / p; ATTENZIONE: altamente corrosivo) e sonicare per 30 minuti a temperatura ambiente. Altri laboratori hanno found vantaggioso incubare i vetrini in acido nitrico 70% in scaffali ceramica 12-24 ore a temperatura ambiente invece. </li><li> Eliminare attentamente l&#39;acido nitrico in una cappa designata secondo le linee guida istituzionali. Lavare i coprioggetti 3-5 volte con acqua deionizzata. </li><li> Immergere i coprioggetti in acqua deionizzata e sonicare nuovamente per 30 min (saltare se seguendo il metodo alternativo). </li><li> Rimuovere l&#39;acqua deionizzata e lavare i coprioggetti altre tre volte. </li><li> Immergere i coprioggetti in 50 mL di acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. In alternativa, sterilizzare i coprioggetti a 225 ° C in un forno per 6 h. Se si utilizza questo approccio alternativo, passare al punto 3.1.9. </li><li> Una volta autoclavato, trasferire i coprioggetti ad una cappa a flusso laminare sterile per le fasi successive. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua deionizzata e risciacquare con 20-30 ml di etanolo al 100%. </li><li> Aggiungere 20-30 ml di etanolo al 100% e trasferire i coprioggetti eetanolo da 100 mm piastra di Petri. </li><li> Utilizzare pinzetta smussata per trasferire coprioggetti a 60 mm di Petri, 4-5 coprioggetto per piatto, e poi lasciare asciugare appoggiando i coprioggetti contro il bordo del piatto. Una volta che l&#39;etanolo evaporato, porre i coprioggetti piano sulla superficie. </li><li> Trasferire 10 g di paraffina ad un idoneo bottiglia di vetro termoresistente. Sciogliere la paraffina e mantenerla a circa 150-200 ° C su una piastra calda per almeno 1 ora. La temperatura ideale a cui deve essere riscaldata la paraffina può richiedere qualche ritocco. Le temperature non ideali possono portare a difficoltà a produrre la dimensione corretta delle perline di paraffina. Il periodo di attesa dopo la fusione aiuta a garantire la temperatura costante per tutto il liquido. </li><li> Immergere una pipetta Pasteur in paraffina, e poi rapidamente toccarla a tre punti vicino al bordo di ogni vetrino (ogni punto essendo di circa 120 °). Le gocce si solidificano in perline alti di circa 0,3-0,5 mm e 1,0-2,0 mm di diametroeter e funziona per fornire uno spazio tra i neuroni sul vetrino e il monostrato gliali sotto (Figura 2). </li><li> Sterilizzare i piatti sotto luce UV per 30 minuti, e poi coprire con un foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente. coprioggetto preparati possono essere memorizzati e utilizzati per un massimo di un mese. perle di paraffina dovrebbe essere consentito di rispettare i coprioggetti per almeno una settimana prima dell&#39;uso. Questo consentirà di evitare la paraffina si stacchi durante i passaggi rimanenti del protocollo. </li></ol></li><li> Coprioggetto rivestimento con Poli-L-lisina <ol><li> Ottenere piastre Petri contenenti coprioggetto precedentemente preparate con le perline di paraffina. </li><li> Aggiungere 200 ml di poli-L-lisina in tampone borato alla superficie di ciascun coprioggetto e lasciare che la soluzione sedersi sul coprioggetto durante la notte, coperto, a temperatura ambiente. Rivestire la stessa superficie come quella su cui si trovano le perle di paraffina. Si noti che, se adeguatamente puliti, il poli-L-lisina dovrebbe diffondersi facilmenteper coprire la superficie del vetrino. </li><li> Dopo un giorno, lavare i coprioggetti due volte immergendoli in acqua deionizzata sterile per 2 ore ogni volta. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, sostituire l&#39;acqua con 4 ml di terreno di placcatura neuronale a piatto. Si noti che è importante che la superficie non coprioggetto lasciare asciugare dopo essere stato rivestito con poli-L-lisina. </li><li> Porre le capsule contenenti coprioggetto a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Il coprioggetto rivestiti devono essere incubate per almeno 24 ore prima della coltura neurone. Questo viene fatto per innescare il mezzo per la cultura neurone. </li></ol></li></ol> 4. dissezione di ippocampo e placcatura neuroni <ol><li> Ottenere un ratto incinta (embrionale giorno 18-19, misurata dal giorno della scoperta spina vaginale) e eutanasia per decapitazione isoflurano anestetizzati o altro metodo approvato. </li><li> Spruzzare la parte inferiore del ratto con 70% di etanolo, e poi fare un&#39;incisione della regione pubico through alla estremità della cavità addominale. Per evitare la contaminazione, fare attenzione a tagliare solo attraverso la pelle in questa fase. </li><li> Risciacquare gli strumenti di dissezione nuovo con etanolo al 70%, e poi tagliare attraverso la parete addominale per esporre l&#39;utero. Rimuovere le due corna uterine e metterli in una sterile 100 millimetri Petri. </li><li> Eseguire i passaggi rimanenti in una cappa a flusso laminare. Rimuovere la membrana uterina circonda feti. li decapitate e posizionare le teste da 100 mm piastra di Petri contenente 20 mL CMF-HBSS. </li><li> Sezionare il cervello e immediatamente metterli in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 2 mL CMF-HBSS su ghiaccio. Raccogliere solo 2-3 cervello per piatto per lasciare spazio sufficiente per il passaggio successivo. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione spogliare meningi dalla linea mediana degli emisferi cerebrali, e poi sezionare le dell&#39;ippocampo e metterli in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 4,5 mL CMF-HBSS. Si noti che l&#39;ippocampo può essere distinto come strut a forma di mezzalunature nella superficie mediale dell&#39;emisfero corticale, ed è facile da rimuovere in quanto è delimitato lateralmente da un ventricolo. </li><li> Trasferire il tessuto dell&#39;ippocampo raccolto e CMF-HBSS ad una provetta da 15 ml. Aggiungere 0,5 ml di 2,5% tripsina, e incubare a 37 ° C per 10 min. Papaina può essere usato al posto di tripsina perché è più delicato e può aumentare la resa. </li><li> rimuovere delicatamente la soluzione di tripsina da pipetta Pasteur, lasciando il tessuto dell&#39;ippocampo indisturbati sul fondo della provetta. </li><li> lavare delicatamente il tessuto due volte con 5 mL di CMF-HBSS mentre incubazione è a 37 ° C per 5 min. Dopo il secondo lavaggio, portare il volume totale ad almeno 5 ml aggiungendo un volume sufficiente di CMF-HBSS al tessuto. Se ci sono ippocampi provenienti da più di 10 cuccioli, fino a 8 mL CMF-HBSS può essere aggiunto. </li><li> Preparare due varianti di pipette fuoco lucido per la dissociazione dei tessuti. La punta di una variante è del normale diametro della pipetta ma con i bordi levigati incendio lucidato. L&#39;altra Variformica è uno con la punta di diametro ridotto della metà. esporre brevemente la punta di una pipetta Pasteur di vetro diagonalmente ad una sorgente di fiamma, e quindi esaminare le punte delle pipette. <ol><li> Ripetere questo passaggio finché il bordo punta era stato lisciato o il diametro è stato ridotto. È importante praticare per trovare il diametro ideale per garantire che il tessuto si dissocia per produrre cellule singole senza danneggiare queste cellule. </li></ol></li><li> Triturare il tessuto ippocampali primo di circa 10 passa attraverso un normale vetro pipetta Pasteur buon taglio, e quindi un ulteriore 5 a 10 passa attraverso la pipetta con il diametro ridotto. L&#39;obiettivo è quello di ottenere una soluzione omogenea di cellule senza o con qualche ciuffo di tessuto. </li><li> Determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Tipicamente, 0,8 e 1,0 milioni di cellule per cuccioli vengono ottenuti quando ippocampi dei due emisferi sono combinati. </li><li> Trasferire un volume sufficiente di sospensione cellulare per piatticontenenti coprioggetto poli-L-lisina rivestite in 4 mL placcatura mezzo per ottenere una densità di placcatura di 300.000 cellule per piastre da 60 mm. La densità delle celle può variare da 100.000 a 500.000, a seconda l&#39;esperimento previsto. </li><li> Dopo 3-4 ore, trasferire i coprioggetti con neuroni attaccati ai piatti contenenti cellule gliali in terreno NBG. Questo dovrebbe essere fatto in modo tale che il lato in cui sono state piastrate i neuroni sia rivolta verso lo strato di cellule gliali. Aggiungere un totale di 4-5 vetrini per piastra glia. </li><li> Due o tre giorni dopo la placcatura, aggiungere la soluzione di Ara-C ad una concentrazione finale di 5 mM per ogni piatto di arrestare la crescita gliale. </li><li> Alimentare le cellule una volta alla settimana, sostituendo 2 mL del vecchio mezzo con 2,5 ml di mezzo fresco ad ogni pasto. Il mezzo supplementare aggiunto è per compensare l&#39;evaporazione nel tempo, e solo una porzione del mezzo viene cambiato di assicurare la coerenza di condizionamento del fluido dalle cellule gliali. Queste culture sono in genere sani per almeno un mese (Figura 3). Neurone sopravvivenza può essere migliorata aggiungendo APV al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 100 pM. APV è un antagonista del recettore NMDA e promuove la sopravvivenza riducendo glutammato eccitotossicità. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre il metodo &quot;sandwich&quot; di neuroni in coltura è stata ben descritta-altrove 2, 11, ci sono diversi passaggi in tutto il protocollo che sono molto difficili da descrivere in solo testo, che può portare alla frustrazione per gli investigatori che vogliono adottarlo. Il metodo può essere suddiviso in tre grandi flussi di lavoro: cultura gliali, preparazione coprioggetto e cultura neurone e manutenzione. Ognuno dei tre p...

Il cervello è organizzato in reti complesse di neuroni. Il contributo dei singoli neuroni per attività di rete e la funzione cerebrale può essere studiato alterazione selettiva della loro composizione molecolare e perturbazione delle loro proprietà fisiologiche. Genetica e chimica manipolazione di singoli neuroni è senza dubbio più facile nei neuroni in coltura che in tessuto cerebrale intatto, libera da eterogeneità cellulare di quest&#39;ultimo e la complessità. Neuroni in coltura sviluppano assonale ben definita e arbors dendritiche e formano estese connessioni sinaptiche con l&#39;altro. Mentre la cultura neurone da animali adulti o da altre regioni del sistema nervoso è possibile, colture ippocampali embrionali sono spesso preferiti a causa della loro popolazione cellulare piramidale definita e densità relativamente bassa gliale 1, 2. neuroni dell&#39;ippocampo coltivati ​​a bassa densità in coltura sono particolarmente amenable allo studio della localizzazione subcellulare, il traffico di proteine, di polarità neuronale e lo sviluppo delle sinapsi. Neuroni in coltura sono anche stati ampiamente impiegati in studio dei processi molecolari nella plasticità sinaptica 3, 4, 5, 6. Preparati cultura Neuron da topi con delezioni genetiche globali che non sopravvivono dopo la nascita sono stati particolarmente utili nello studio ruoli cellulari e sinaptici di alcuni geni 7. Come nel cervello, in coltura neuroni dell&#39;ippocampo sono dipendente dal sostegno trofico dalle cellule gliali. Questo complica la loro cultura, e ha portato allo sviluppo di diversi metodi con cui questo supporto è fornita. Un metodo comunemente usato comporta placcatura neuroni direttamente su un monostrato di cellule gliali 8, o che consentono cellule gliali contaminanti dal hipp acquisitatessuto ocampal a proliferare e formare un monostrato sotto i neuroni 9. Mentre questo metodo ha trovato un certo successo, l&#39;impurità della cultura neuronale risultante è svantaggioso per esperimenti di imaging. Un altro metodo comunemente usato di cultura neurone è lasciare-out l&#39;alimentatore gliali strato del tutto, e invece fornire supporto trofico nella forma di un mezzo di crescita definito 10. Qui, descriviamo il &quot;sandwich&quot; o il metodo &quot;Banker&quot; della cultura neurone 2, 11. Questo metodo comporta placcatura neuroni ippocampali su vetrini, che vengono poi sospesa su un monostrato di cellule gliali separate da perline di cera di paraffina. Questo facilita coltura a lungo termine di una popolazione omogenea di neuroni senza contaminare glia pur consentendo supporto trofico dal monostrato gliale sottostante. Quando i neuroni sono in età sufficiente o livello di maturità,i coprioggetti neuroni possono essere capovolte-out del piatto gliali e usati nell&#39;imaging o saggi funzionali.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps (#5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps (#PP)</td><td>Roboz</td><td>RS-4950</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%)</td><td>Gibco</td><td>15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex Filter Holder, 25&amp;nbsp;mm</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0002500</td><td>Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave</td></tr><tr><td>Isoflorane</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Grade 105 Lens Cleaning Tissue</td><td>GE Healthcare</td><td>2105-841</td><td>Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes with cotton filter</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)</td><td>Gibco</td><td>14-185-052</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Butane bunsen burner</td><td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td><td>Model 65</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish (100 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish (60 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11-095-080</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21-103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium</td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Culture Flasks (75 cm^2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Cytarabine (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Growth Serum (BGS)</td><td>HyClone</td><td>SH3054103</td><td>Heat-inactivation is recommended before use.</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials</td><td>VWR</td><td>89094-806</td><td></td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Coverslip Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate decahydrate (borax)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast Paraffin Wax</td><td>Fisher</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>Gravity Convection Oven</td><td>VWR</td><td>89511-404</td><td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td></tr><tr><td>Ultrasonic Bath (Sonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337400</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>Anachemia</td><td>62786-460</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Staining Racks</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&amp;nbsp;GmbH</td><td>1001/18</td><td>Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe Filters</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Used with BD syringe for filter-sterilization</td></tr><tr><td>Syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>302832</td><td>Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-16Q</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td><td>ThermoScientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

low-density primary hippocampal neuron culture

La capacità di sondare la struttura e la fisiologia delle singole cellule nervose in coltura è fondamentale per lo studio della neurobiologia, e consente flessibilità nella manipolazione genetica e chimica delle singole cellule o reti definite. Tale facilità di manipolazione è semplice nel sistema di coltura ridotta rispetto al tessuto cerebrale intatto. Mentre esistono molti metodi per l&#39;isolamento e la crescita di questi neuroni primari, ognuno ha i suoi limiti. Questo protocollo descrive un metodo per la coltura a bassa densità ed elevata purezza roditori embrionali neuroni dell&#39;ippocampo su vetrini, che vengono poi sospesa su un monostrato di cellule gliali. Questo &#39;coltura a sandwich&#39; consente esclusiva crescita a lungo termine di una popolazione di neuroni pur consentendo supporto trofico dal monostrato gliale sottostante. Quando i neuroni sono in età sufficienti o livello di maturità, i coprioggetti neuroni possono essere capovolte-out del piatto gliali e usati nell&#39;imaging o saggi funzionali. neuroni grown con questo metodo tipicamente sopravvivere per diverse settimane e sviluppare ampie pergole, connessioni sinaptiche, e le proprietà di rete.

In questo metodo &quot;sandwich&quot; della coltura primaria di cellule nervose, neuroni dell&#39;ippocampo (Figura 3) crescono su un letto di cellule gliali (Figura 1) separati da perline di paraffina (Figura 2). Questo assicura che i neuroni crescono selettivamente su vetrini con minima contaminazione delle cellule gliali ma ricevano un adeguato supporto trofico da glia crescente sul piatto di coltura tissutale. Tipicamente, i neuroni ...

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Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Questo articolo descrive il protocollo per la coltura a bassa densità primari neuroni ippocampali crescono su vetrini invertiti su un monostrato gliale. Gli strati neuroni e gliali sono separati da perline di cera di paraffina. I neuroni coltivati ​​con tale metodo adatto per imaging ottico ad alta risoluzione e saggi funzionali.

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.5K Views.  University of Manitoba.  Questo articolo descrive il protocollo per la coltura a bassa densità primari neuroni ippocampali crescono su vetrini invertiti su un monostrato gliale. Gli strati neuroni e gliali sono separati da perline di cera di paraffina. I neuroni coltivati ​​con tale metodo adatto per imaging ottico ad alta risoluzione e saggi funzionali. 

Video: Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Ricerca

Neuroscienze

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

Cultura primaria di neuroni dell&#39;ippocampo da P0 ratti neonati

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Biologia

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms responsible for those differences remain unclear. Primary disassociated embryonic neuronal culture provides a simplified experimental model with which to investigate the neuronal cell signaling involved in cell death as a result of ischemia or disease; however, most neuronal cultures used in research today are mixed sex. Researchers can and do test the effects of sex steroid treatment in mixed sex neuronal cultures in models of neuronal injury and disease, but accumulating evidence suggests that the female brain responds to androgens, estrogens, and progesterone differently than the male brain. Furthermore, neonate male and female rodents respond differently to ischemic injury, with males experiencing greater injury following cerebral ischemia than females. Thus, mixed sex neuronal cultures might obscure and confound the experimental results; important information might be missed. For this reason, the Herson Lab at the University of Colorado School of Medicine routinely prepares sex-stratified primary disassociated embryonic neuronal cultures from both hippocampus and cortex. Embryos are sexed before harvesting of brain tissue and male and female tissue are disassociated separately, plated separately, and maintained separately. Using this method, the Herson Lab has demonstrated a male-specific role for the ion channel TRPM2 in ischemic cell death. In this manuscript, we share and discuss our protocol for sexing embryonic mice and preparing sex-stratified hippocampal primary disassociated neuron cultures. This method can be adapted to prepare sex-stratified cortical cultures and the method for embryo sexing can be used in conjunction with other protocols for any study in which sex is thought to be an important determinant of outcome.

Primary disassociated embryonic hippocampal neuronal cultures are useful for investigating the signaling mechanisms involved in neuron death. Sexing the embryos before the isolation and dissociation of the hippocampus allows the preparation of separate male and female cultures, which enables the researcher to identify and investigate sex-specific cell signaling.

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Un metodo semplificato per Ultra-Low Density, Long-Term primaria ippocampale Neuron Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal neurons allows the study of individual neurons or subcellular components. We have shown subcellular protein localization within a neuron by immunocytochemistry, neuronal polarity, synaptic morphology, and its developmental change using a low-density primary hippocampal culture. Recently, ready-to-use frozen stocks of neurons have become commercially available. These frozen stocks of neurons reduce the time needed to prepare animal experiments and also contribute to the reduction of the number of animals used. Here, we introduce a reproducible low-density primary culture method using a 96-well plate. We used a commercially available frozen stock of neurons from the rat embryonic hippocampus. The neurons can be stably cultured long-term without media changes by reducing the growth of glial cells at particular timepoints. This high-throughput assay using low-density culture allows reproducible imaging-based evaluations of synaptic plasticity.

A ready-to-use frozen stock of neurons is a powerful tool for evaluating synaptic functions. Here, we introduce an easy low-density primary culture from frozen stock using a 96-well plate.

Coltura primaria a bassa densità facile e riproducibile utilizzando stock congelati di neuroni ippocampali embrionali

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

A Technique to Culture Mouse Hippocampal Neurons

Source: Yang, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61411">Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing neurons from murine hippocampi. Initially, the hippocampi undergo enzymatic digestion to break down the extracellular tissue matrix. Subsequently, the digested tissue is mechanically disrupted to isolate individual neurons. Finally, these neurons are cultured on glial feeder cells.

Una tecnica per coltivare i neuroni dell'ippocampo del topo

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparing glia cell feeder dishes ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Generating a Low-Density Primary Neuron Culture From Frozen Embryonic Neurons

Source: Koganezawa, N. et al., <a href="https://app.jove.com/v/64872">Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2023)
This video demonstrates the method of culturing cryopreserved embryonic neurons, involving controlled thawing, dilution with a neurobasal medium, and seeding onto a poly-L-lysine-coated plate. Subsequent incubation supports the growth and maintenance of neuronal connections.

Generazione di una coltura di neuroni primari a bassa densità da neuroni embrionali congelati

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Plate coating

	Coat a 96-well ...