Lavoro in laboratorio dell&#39;autore è finanziato dal Canadian Institutes of Health Research, la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, le scienze naturali e ingegneria Research Council e Concordia University.

Costruzione di ceppi diploidi Protocollo per la produzione di diploidi con l&#39;accoppiamento <ol><li> I ceppi iniziale deve essere colpito sulla media YPD, o selettivo, se necessario, per la produzione di singole colonie. I due ceppi aploidi dovrebbe essere di tipo accoppiamento opposto (cioè Mata e MATα). </li><li> Utilizzando un&#39;ansa sterile inoculazione raccogliere una piccola porzione di una colonia da uno dei due ceppi aploidi. Su una striscia nuova piastra YPD il ciclo una volta in linea retta tutta la piastra. Segnare la direzione della striscia con una freccia sul fondo del piatto. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per il secondo ceppo sulla stessa piastra YPD. Questa volta la vena colonia perpendicolare alla prima, attraversando la striscia prima con la seconda. Segnare la direzione della striscia secondo e nota l&#39;area in cui la vena seconda attraversa il primo. Questa zona sarà dove diploidi saranno prodotti. </li><li> Incubare la piastra YPD a 30 ° C durante la notte. </li><li> Replica piastra la piastra YPD su terreni selettivi che permettono selettivamente la crescita della neo-costituita diploidi. </li><li> Scegli una singola colonia, se possibile, o una piccola porzione della stria diploide e strisciare sullo stesso mezzo selettivo per generare singole colonie. </li></ol> Sporulazione e la digestione di aschi Protocollo <ol><li> Scegli singole colonie dalla piastra sopra e fai piccoli (1 cm x 1 cm) patch su sporulazione (SPO) piastre e incubare a 30 ° C per 3-7 giorni a sporulare. </li><li> Sporulazione può essere controllato, cercando in cellule di ogni patch sotto un microscopio ottico. Cellule posto su un vetrino da microscopio in 5-10 microlitri di acqua, mettere un coprioggetto sulla parte superiore della goccia, e cercare la presenza di aschi. Se aschi non si trovano facilmente poi rimesso nell&#39;incubatrice. </li><li> Se c&#39;è sporulazione efficace in una delle patch, preparare una sterile tubo 15 ml coniche con 100μL di succo di tetrade. </li><li> Cellule di Pick up da questa patch sporulazione con un&#39;ansa sterile inoculazione 3 mm (le cellule dovrebbero coprire ¼ del ciclo) e posto nel succo tetrade. Capovolgere delicatamente il ciclo per permettere alle cellule di cadere il ciclo e mescolare con la soluzione. </li><li> Lasciare in succo tetrade (contenente zymolyase) per 4-10 minuti (a seconda della concentrazione e l&#39;attività di zymolyase e dello stesso ceppo). Questo permette la digestione della parete cellulare che circonda il ascospore. </li><li> Segna parte superiore e inferiore della regione inoculo su un piatto YPD. </li><li> Opzionale. Reazione può essere interrotta con l&#39;aggiunta di 1 ml di freddo ghiaccio sterile dH 2 O. Permettono alle cellule di accontentarsi di 5 minuti. Rimuovere il surnatante da 1 ml quindi mescolare delicatamente a mano e tenere sul ghiaccio. </li><li> Prendere 5μL di cellule digerito dal passaggio 5 e delicatamente posto gocce in una linea nella regione di inoculo del pre-segnato piastra YPD. </li><li> Utilizzare un&#39;ansa sterile inoculazione 3mm a molto delicatamente diffondere i tempi di 1-3 gocce in una linea, mentre appena il contatto con l&#39;agar. </li><li> Lasciare che il liquido di assorbire in agar (se viene omesso il passaggio 7, questo è quando la digestione della parete cellulare esterna sarà ridotta o fermata). Procedere al microscopio dissezione. </li></ol> Dissezione di Asci Protocollo Si noti che il protocollo qui descritto si un microscopio Singer sistema di micromanipolazione MSM 200. Questo protocollo può essere seguito con lievi modifiche se si utilizza un micromanipolatore manuale come un micromanipolatore Zeiss MR. <ol><li> Focus su una regione della piastra dove la metà del campo contiene cellule e mezzo è vuoto. Portare lentamente l&#39;ago a fuoco in modo che tocca la regione vuota del campo. Questo farà sì che l&#39;ago non contiene cellule di un uso precedente. Il contatto tra l&#39;ago e l&#39;agar è visto come un cerchio nero scuro che viene lentamente a fuoco. </li><li> Vai alla matrice in A1 posizione e fare un segno penetrante l&#39;agar di nuovo. Questo è per aiutare a determinare l&#39;orientamento della piastra se viene tolto il microscopio prima del completamento. </li><li> Passare alla modalità di ricerca. Individuare un aschi. Scegliere preferibilmente aschi che si trovano in aree in cui le cellule sono ben distribuiti. Evitare le zone con i cluster di cellule. I quattro ascospore da un aschi dovrebbe essere ancora attaccati l&#39;uno all&#39;altro. Due ascospore possono essere leggermente più grande rispetto agli altri due. Evitare di raccogliere aschi ascospore dove si è sciolto e non collegata al resto del ascospore. </li><li> Prendere un asco con l&#39;ago. Portare lentamente l&#39;ago fino alla piastra. Quando l&#39;ombra del microago è visto, questa linea con l&#39;asco di essere raccolti. Nuovo approccio l&#39;ago fino a quando la sagoma nera di un cerchio (la punta dell&#39;ago) si vede. Toccare il tetrade con questo cerchio e poi rapidamente tirare l&#39;ago via. Assicurarsi che i quattro ascospore da un asco hanno aderito l&#39;ago e che non le cellule supplementari sono stati raccolti sulla microago che non fanno parte di questo ASCUS. </li><li> Tirare il microago lontano dal piatto e andare alla matrice (per la asco prima, andare aposizione A1). Prendere nota di ogni posizione in cui viene spostato uno asco. Posizionare il asco giù toccando il piatto con il microago e tirando via fino a tutte e quattro le ascospore si stacca il microago. Picchiettando leggermente il braccio ago o la piattaforma che fissano la piastra YPD è spesso utile in questa fase. </li><li> Ripetere i passaggi 3-5 e posto aschi giù in posizioni consecutive sulla matrice fino a quando il numero desiderato di aschi sono stati raccolti. </li><li> Torna alla ciascun asco e rompere le quattro celle a parte da prendere in giro con l&#39;ago, picchiettando delicatamente la piattaforma o una combinazione di entrambi. Raccogliere le cellule lasciando uno dietro a una nuova posizione nella matrice fino a che ogni ascospore in ogni asco è divisa in file di quattro. </li><li> Posizionare la piastra YPD in un incubatore a 30 ° C per diversi giorni per osservare il modello di crescita. </li><li> Replica piastra le cellule sezionato per terreno selettivo se necessario. </li></ol> Trasferimento di zigoti Protocollo <ol><li> Streak fuori due ceppi aploidi con i tipi di accoppiamento opposto sul terreno adeguato per ottenere colonie singole. </li><li> Compagno di questi due ceppi, come descritto sopra e lasciar crescere da 4 a 6 ore (o tutta la notte se necessario). </li><li> Verificare la presenza di zigoti sotto un microscopio ottico. Zigoti apparirà come manubrio a forma di cellule con o senza una gemma. </li><li> Raccogliere le cellule con un ciclo inoculazione 3 mm (le cellule dovrebbero coprire ¼ del ciclo) e posto delicatamente in 100μL di sterili dH 2 O. </li><li> Segna parte superiore e inferiore della regione inoculo su un piatto YPD. </li><li> Prendere 5μL e delicatamente posto gocce in una linea nella regione di inoculo del pre-segnato piastra YPD. </li><li> Usare un ciclo 3 millimetri inoculazione di diffondere le gocce in una linea molto delicatamente, mentre appena il contatto con l&#39;agar. </li><li> Lasciare che il liquido di assorbire in agar. Procedere al microscopio dissezione. </li><li> Focus su una regione della piastra dove la metà del campo contiene cellule e mezzo è vuoto. Portare lentamente l&#39;ago a fuoco in modo che tocca la regione vuota del campo. Questo farà sì che l&#39;ago non contiene cellule di un uso precedente. Il contatto tra l&#39;ago e l&#39;agar è visto come un cerchio nero scuro che viene lentamente a fuoco. </li><li> Vai alla matrice in A1 posizione e fare un segno penetrante l&#39;agar di nuovo. Questo è per aiutare a determinare l&#39;orientamento della piastra se viene tolto il microscopio prima del completamento. </li><li> Passare alla modalità di ricerca. Individuare uno zigote. </li><li> Prendete uno zigote con l&#39;ago. </li><li> Luogo zigoti individualmente sulla matrice. </li><li> Lasciare zigoti a crescere per alcuni giorni. </li><li> Piastra replica il zigoti sul mezzo adeguato selettivo. </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> Figura 1: L&#39;accoppiamento di due ceppi aploidi di tipi di accoppiamento opposto genera un ceppo diploide. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> Figura 2: (A) Un piatto YPD con risultati thre di un incrocio tra un ceppo sensibile alla temperatura (con un auxotrophy leu2) e un ceppo wild-type (LEU2). Cellule digeriti sono sparsi nella regione di inoculo sulla sinistra dove si vede la crescita di spessore tra le due linee nere. Aschi che sono stati sezionati crescere equidistanti nella matrice di destra. (B) La piastra in (A) è stato replicato su una SD-Leucina drop-out piatto. Si noti la 02:02 di crescita per il marcatore LEU2 indica un ascospore convalidato è stato dissezionato. (C) La piastra in (A) è stato replicato su un piatto YPD e incubate a 37 ° C. Si noti il ​​02:02 crescita che conferma ulteriormente che un ascospore è stato dissezionato.

<ol>
	<li>Sherman, F., Hicks, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+and+Dissection+of+Asci.">Micromanipulation and Dissection of Asci.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 21-37 (1991).</li></ol>

Dissezione lievito è un utile strumento per selezionare nuove varietà con marcatori desiderato. Nel determinare il modello teorico di crescita di quattro ascospore è importante guardare al genotipo della cellula vegetativa. Se un plasmide è presente, si deve sapere se è solo esemplare, alto o basso, come questo influirà che ascospore (s) ricevono il plasmide e influenzerà le previsioni e conclusioni per quanto riguarda i ceppi manipolati. Alcuni ceppi possono sporulare meglio di altri...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Singer MSM System 200</td>
<td>Microscope</td>
<td>Singer Instruments</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-sorbitol</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOR508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zymolyase 100T</td>
<td>Reagent</td>
<td>Seikagaku Corporation</td>
<td>120493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YEX401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PEP 403</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YNB406</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bio-tryptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOD002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium acetate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>POA 301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>AGR003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenine sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ADS201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-uracil</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>URA 241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>HIS 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-arginine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Amresco</td>
<td>0877-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-methionine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>MET 222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tyrosine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TYR 333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-isoleucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ISO 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-valine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>VAL 201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LYS 101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-phenylalanine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PHA 302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU 202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-threonine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>THR002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LEU 222</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of saccharomyces cerevisiae asci

Il lievito è un sistema modello altamente trattabile che viene utilizzato per studiare molti processi cellulari diversi. Il ceppo di laboratorio comune<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Esiste sia in una aploide o stato diploide. La possibilità di combinare gli alleli di due haploids e la possibilità di apportare modifiche al genoma richiede la produzione e la dissezione di aschi. Produzione di aschi da cellule aploidi inizia con l&#39;accoppiamento di due ceppi di lievito aploidi con tipi di accoppiamento compatibile per la produzione di un ceppo diploide. Questo può essere ottenuto in diversi modi, sia su terreno solido o liquido. È vantaggioso per selezionare i diploidi in mezzo che favorisce selettivamente la crescita rispetto ad uno dei due ceppi aploidi. I diploidi sono poi permesso di sporulare sul poveri di nutrienti medio per formare aschi, un fascio di quattro cellule figlie aploidi derivanti dalla riproduzione meiotica della diploide. Una miscela di cellule vegetative e aschi viene poi trattata con l&#39;enzima per digerire zymolyase via la membrana che circonda il sacco ascospore di aschi. Mediante micromanipolazione con un microago al microscopio dissezione si può raccogliere e separare i singoli aschi e ricollocare i quattro ascopores. Aschi sezionato sono coltivate per diversi giorni e testati per i marcatori o alleli di interesse da parte placcatura replica su appropriati terreni selettivi.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipolazione di cellule di lievito è necessaria per l&#39;analisi genetica meiotica o per selezionare zigoti diploidi. Queste micromanipolazioni vengono effettuate utilizzando il microago di un microscopio dissezione. Il microago viene utilizzato per trasferire le cellule ed è controllato da un micromanipolatore che sono disponibili con diversi gradi di automazione.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

18.4K Views.  Concordia University. Micromanipolazione di cellule di lievito è necessaria per l'analisi genetica meiotica o per selezionare zigoti diploidi. Queste micromanipolazioni vengono effettuate utilizzando il microago di un microscopio dissezione. Il microago viene utilizzato per trasferire le cellule ed è controllato da un micromanipolatore che sono disponibili con diversi gradi di automazione.

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Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Ricerca

Biologia

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR monitorata Redox Titolazione dei cofattori di<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...