Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da un assegno di ricerca della combinazione olandese Scuola Nazionale delle Ricerche, Catalisi Controlled by Design Chemical (NRSC-Catalysis). Dr. HY Steensma e Dr. GPH van Heusden da Leiden University sono riconosciuti per il loro sostegno, con l&#39;espressione ricombinante di S. cerevisiae Nar1.

1. Preparazione del programma di installazione e soluzioni <ol><li> Preparare la soluzione tampone contenente Tris 100 mM, NaCl 250 mM e 10% glicerolo a pH 8,5. Sfiatare il buffer da vampate di calore con argon. Introdurre il buffer in una camera anaerobica. </li><li> Dividere il buffer in due porzioni. Per una porzione (tampone A) aggiungere 1 mM DL-ditiotreitolo (DTT, M r 154.25 g / mol) e 1 mM L-cisteina. L&#39;altra porzione (tampone B) non contiene agenti riducenti. </li><li> Preparare soluzioni ossidanti e riducente. Effettuare 1 ml di soluzioni 2, 20, e 200 mM di potassio ferricianuro (FIC, M r 329,26 g / mol) e del ditionito di sodio (SD, M r 174.11 g / mol) in tampone anaerobica B. </li><li> Preparare mix mediatore come segue: <ol><li> Aggiungere 160 mM di ciascuno dei seguenti mediatori redox e 50 mM NaCl al buffer B: N, N, N &#39;, N&#39; tetrametil-p-phenylendediamine (TMPD, M r 237,17 g / mol, E &#39;0 0,276 V) , 2,6-diclorofenolo indofenolo(DCIP, M r 290,08 g / mol, E &#39;0 0,217 V), fenazina ethosulphate (PES, M r 334,4 g / mol, E&#39; 0 0,055 V), blu di metilene (M r 319,85 g / mol, E &#39; 0 0,011 V), resorufina (M r 235,17 g / mol, E &#39;0 -0,051 V), Indigodisulphonate (M r 466,35 g / mol, E&#39; 0 -0,125 V), 2-idrossi-1,4-naphtaquinone ( M r 174,15 g / mol, E &#39;0 -0,145 V), antrachinone-2-sulfonato (M r 328,28 g / mol, E&#39; 0 -0,225 V), Phenosafranin (M r 322,8 g / mol, E &#39;0 -0,252 V), safranina O (M r 350,84 g / mol, E &#39;0 -0,280 V), rosso neutro (M r 288,8 g / mol, E&#39; 0 -0,340 V), benzilico viologeno (M r 409,4 g / mol, E &#39;0 -0,350 V), e metil viologeno (M r 257,16 g / mol, E&#39; 0 -0,440 V). </li><li> Avvolgere la bottiglia in un foglio di alluminio per proteggere il mediatores dalla luce. </li></ol></li><li> Preparare 10 mg / ml S. cerevisiae Nar1 proteine ​​strep-tag (181 micron, M r 55.2 kDa) in tampone A. espresso S. cerevisiae Nar1 in E. coli come una proteina strep-tag con un vettore di espressione pET24A. Purificare la proteina in una camera anaerobico utilizzando supporti cromatografia Strep-Tactin (IBA) e purificare utilizzando un sistema di purificazione di proteine ​​come Akta purificatore (GE Healthcare). </li><li> Preparare la configurazione redox titolazione in una camera anaerobico come segue: <ol><li> Collegare un elettrodo di riferimento Ag / AgCl e un elettrodo a filo di platino vaso di titolazione. Collegare entrambi gli elettrodi ad un voltmetro in grado di misurare da mV a V. </li><li> Inserire un piccolo bar di agitazione. </li><li> Posizionare il vaso di titolazione sopra un agitatore magnetico. </li><li> Riempire il vaso di titolazione con tampone B, soluzione mix mediatore e soluzione proteica fino a 2 ml, cioè a concentrazioni finali di proteine ​​72 micron e 38 micron di ognimediatore. Nota: a seconda della concentrazione di proteine ​​e il mediatore richieste concentrazioni importi delle tre soluzioni dovrebbe essere regolato. </li><li> Mescolare per 30 minuti e accendere il voltmetro. </li></ol></li><li> Preparare 10 quarzo tubi EPR vetro pulito. Introdurre i tubi nella camera anaerobica. </li><li> Riempire un piccolo (circa 200 ml) dewar azoto liquido con azoto liquido. </li></ol> 2. Eseguire Redox Titolazione <ol><li> Attendere il potenziale della soluzione è stabile. Nota: In pratica, ciò significa che il potenziale derive meno di 1 mV per minuto. </li><li> Annotare il potenziale in voltmetro. </li><li> Disegnare il primo campione di 200 ml e iniettare in un tubo EPR. </li><li> Chiudere la provetta con tappo di gomma e rimuovere il tubo dalla camera anaerobica. </li><li> Congelare il tubo in azoto liquido come segue: Attenzione! Questo deve essere fatto lentamente, altrimenti il ​​tubo si rompe. <ol><li> Prima inserire il tip del tubo in azoto liquido. </li><li> Attendere un sibilo può essere ascoltato. Nota: Questo può richiedere fino a 10 sec. </li><li> Lentamente inserire il resto del tubo in modo che la parte del campione è completamente sommerso. </li></ol></li><li> Aggiungere una piccola aliquota 1-2 microlitri della soluzione 2 mM SD alla soluzione nel recipiente di titolazione per abbassare il potenziale della soluzione -0.6 V. Nota: Se più di 10 ml deve essere aggiunto, passare alla soluzione mM 20. Poiché è molto difficile poise a un valore potenziale specifico, i valori effettivi rilevati sul voltmetro sono scritte e utilizzati per costruire la curva di titolazione. </li><li> Disegnare un campione come descritto al punto 2,3-2,5. </li><li> Annotare il potenziale effettivo in voltmetro. </li><li> Aggiungere ossidante finché il potenziale è aumentata di circa 50 mV. Inizia aggiungendo una piccola aliquota 1-2 microlitri della soluzione 2 mM FIC. Se più di 10 microlitri deve essere aggiunto, passare alla soluzione 20 mM. </li><li> Annotare how la maggior parte delle soluzioni è stato aggiunto. Nota: Ciò è necessario per correggere diluizione del campione durante la titolazione. </li><li> Disegnare un campione come descritto nella procedura 2,3-2,5. </li><li> Annotare il potenziale effettivo in voltmetro. </li><li> Ripetere i punti 2.9 e 2.12 fino alla gamma potenziale da -0,6 V a +0,2 V è stato coperto e tutti i 10 tubi EPR sono riempiti ognuno con 200 ml. Nota: Poiché il volume di ogni recesso è diminuito il posizionamento degli elettrodi può essere necessario regolare avere un buon contatto con la soluzione senza interferenze della agitazione. Può essere difficile misurare il potenziale dopo il ritiro dell&#39;ultimo campione e quindi il potenziale di tale campione può essere meno accurate. </li><li> Facoltativamente, conservare i campioni EPR congelati in azoto liquido finché le misure EPR può avvenire. </li></ol> 3. Misurare titolazione campioni utilizzando EPR Spettroscopia e analisi dei dati <ol><li> Record EPR spettri del diversocampioni di titolazione come segue: <ol><li> Utilizzare una pompa ad alto vuoto per evacuare un criostato quarzo a &lt;10 -5 bar. </li><li> Accendere il raffreddamento ad acqua del magnete EPR. Aprire il flusso di aria secca attraverso la cavità EPR. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione al magnete e il computer del EPR. </li><li> Eseguire un programma di calibrazione della frequenza. Impostare i parametri di misura EPR. Collegare il criostato per l&#39;elio liquido dewar. Raffreddare la cavità di 9-16 K. </li><li> Introdurre il campione EPR nella cavità. Registrare lo spettro EPR. </li></ol></li><li> Identificare le diverse specie EPR e utilizzare il miglior spettri di quantificare i segnali. Ottenere EPR quantificazione mediante doppia integrazione degli spettri e confronto con lo spettro di una soluzione standard di rame esterna CuSO 10 mM 4/10 mM HCl / 2 M NaClO 4. 8 </li><li> Effettuare la curva di titolazione come segue: <ol><li> Tracciare l&#39;ampiezza del segnale EPR ad un valore g che è caratteristico per la paraspecie magnetici di interesse rispetto al potenziale. </li><li> Modificare l&#39;EPR scala ampiezza del segnale di un giri / scala molecola utilizzando la quantificazione EPR dal punto 3.2. </li><li> Correggere l&#39;ampiezza di ciascun campione per la diluizione che si è verificato a causa delle aggiunte di ossidante o riducente segnale. </li><li> Correggere il potenziale per il potenziale punto medio della elettrodo di riferimento Ag / AgCl. Nota: L&#39;elettrodo di riferimento Ag / AgCl (con KCl saturo) ha un potenziale punto medio di 0,194 V rispetto Hydrogen Electrode standard (SHE) a 25 ° C. Pertanto, se il potenziale sul voltmetro legge circa -0.6 V, il potenziale con riferimento alla SHE è -0.4 V. </li></ol></li><li> Montare il segnale alla equazione di Nernst come segue: Per una specie che è paramagnetico allo stato ridotto: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq1.jpg" width="200" /> Per una specie che è paramagnetica in oStato xidized: <img alt="Equazione 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq2.jpg" width="200" /> Per una specie che è paramagnetico in uno stato intermedio: <img alt="Equazione 3" fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq3.jpg" width="220" /> Queste equazioni sono validi per reazioni redox in cui un elettrone viene trasferito, quindi n = 1. E = potenziale in Volt E m = potenziale punto medio in Volt F = costante di Faraday = 96.480 C · mol -1 R = Gas costante = 8,314 J · K -1 · mol -1 T = temperatura in Kelvin </li></ol>

<ol>
	<li>Lippard, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).</li><li>Bertini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).</li><li>Leger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+Electrokinetics:+Using+Protein+Film+Voltammetry+To+Investigate+Redox+Enzymes+and+Their+Mechanisms.">Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms.</a> Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).</li><li>Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Electron+Transfer+of+Redox+Proteins+at+the+Bare+Glassy+Carbon+Electrode.">Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode.</a> Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).</li><li>Pierik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Properties+of+the+Iron-Sulfur+Clusters+in+Activated+Fe-Hydrogenase+from+Desulfovibrio+vulgaris+(Hildenborough).">Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough).</a> Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hydrogenase-like+Nar1p+is+Essential+for+Maturation+of+Cytosolic+and+Nuclear+Iron-Sulphur+Proteins.">The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins.</a> EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).</li><li>Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Iron-Sulfur+Cluster+Assembly+(CIA)+System:+Factors,+Mechanism,+and+Relevance+to+Cellular+Iron+Regulation.">Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation.</a> J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).</li><li>Aasa, R., V&#228;nng&#229;rd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+Signal+Intensity+and+Powder+Shapes.">EPR Signal Intensity and Powder Shapes.</a> A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., M&#252;hlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nar1p,+a+conserved+eukaryotic+protein+with+similarity+to+Fe-only+hydrogenases,+functions+in+cytosolic+iron-sulphur+protein+biogenesis.">Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis.</a> Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).</li><li>Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferene+-+a+new+spectrophotometric+reagent+for+iron.">Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron.</a> Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).</li><li>Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarase+A+from+Escherichia+coli:+purification+and+characterization+as+an+iron-sulfur+cluster+containing+enzyme.">Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme.</a> Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).</li><li>Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch, ., Landa, I., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+Redox+Chemistry:+a+Re-evaluation.">Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation.</a> FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).</li><li>Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+relative+contributions+of+redox+and+steric+issues+to+laccase+specificity+towards+putative+substrates.">An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates.</a> Organic &amp; biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La serie di 13 mediatori redox permette un equilibrio redox nella soluzione nel range da -0.45 a +0,3 V rispetto SHE (Tabella 1 e Figura 3). Ben sopra e sotto tutti questi potenziali mediatori sono o completamente ridotti o completamente ossidate e quindi non ulteriormente equilibrazione con i centri attivi redox della proteina possono verificarsi. Questo è un concetto importante, come nella letteratura titolazioni redox talvolta vengono eseguite con solo due o tre mediatori, consenten...

Colpisce il fatto che i processi chimici fondamentali che sostengono la vita su questo pianeta, la fotosintesi, la fissazione dell&#39;azoto e la respirazione, sono catalizzate da grandi complessi proteici contenenti una vasta gamma di cofattori redox organici e inorganici. È stato stimato che circa il 30% di tutte le proteine ​​contengono uno o più cofattori metallici. 1,2 identificare e caratterizzare i cofattori redox possono essere stabilite con elettrochimica diretta (ad esempio, la proteina pellicola voltammetria) o titolazioni redox. Le due tecniche sono complementari nella loro natura e applicabilità. Voltammetria offre un rapido accertamento delle potenzialità del punto medio e di trasferimento elettronico cinetica di cofattori che possono reagire con una superficie dell&#39;elettrodo. 3,4 solito questo funziona bene per le proteine ​​di trasferimento elettronico, come il citocromo c o ferredossina. E funziona a volte per proteine ​​più complessi che sono stati immobilizzati su una superficie dell&#39;elettrodo. La conoscenza dettagliata dellanatura cofattori nella proteina deve essere disponibile, come voltammogramma non darà alcuna informazione diretta sulla identità del cofattore. Titolazioni redox sono più laborioso da eseguire e richiedono quantità mg di proteina. Tuttavia, offrono informazioni sul potenziale punto medio e l&#39;identità del cofattore. 5 Inoltre in una singola titolazione più cofattori in una proteina può essere monitorato. Il principio di una titolazione redox è che la proteina redox attivo o enzima viene ridotto o ossidato chimicamente. Per assicurarsi che i cofattori reagiscono con i mediatori riducente o ossidante redox sono utilizzati. Questi mediatori redox reagiscono anche con un elettrodo in modo che il potenziale della soluzione può essere misurata. I mediatori agiscono come tampone redox e equilibrare tra i cofattori nella proteina e l&#39;elettrodo. Dopo poising chimicamente il potenziale al valore desiderato, un campione viene prelevato e congelati in azoto liquido AW rapidamenteAit ulteriori analisi con tecniche spettroscopiche. Spettroscopia EPR è particolarmente utile a questo proposito in quanto può essere utilizzato per misurare quantitativamente centri metallici paramagnetici o radicali organici. La titolazione redox può essere eseguita in due direzioni: da basso ad alto o da alto a basso potenziale punto medio. La scelta dipende dalla stabilità dei cofattori sotto studio. Spesso è saggio iniziare a basso potenziale e aggiungere ossidante al graduale aumentare il potenziale. Questo è chiamato una titolazione ossidativo ed è descritto qui. Qui vi mostriamo la titolazione redox del cluster ferro-zolfo contenenti proteine ​​Nar1 da Saccharomyces cerevisiae. Questa proteina è coinvolta, probabilmente come una proteina scaffold, nel ferro-zolfo del cluster biosintetico macchine citosolica (CIA via). 6,7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference electrode (Ag/AgCl)</td>
			<td style="width:101px;">Radiometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EPR spectrometer</td>
			<td style="width:101px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) &#183;(HCl)2</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">637-01-4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">620-45-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenazine ethosulfate (PES)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">10510-77-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">122965-43-9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resorufin, sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">34994-50-8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Indigodisulfonate (indigo carmine)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">860-22-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-hydroxy-1,4-naphtaquinone</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">83-72-7</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">153277-35-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenosafranin</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">81-93-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safranin O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">477-73-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral red</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">553-24-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1102-19-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1910-42-5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epr monitored redox titration of the cofactors of saccharomyces cerevisiae nar1

Risonanza Paramagnetica Elettronica (EPR) monitorato titolazioni redox sono un potente metodo per determinare il potenziale punto medio di cofattori di proteine ​​e di identificare e quantificare i cofattori nel loro stato redox rilevabile. La tecnica è complementare elettrochimica diretta (voltammetria) si avvicina, in quanto non offre informazioni sulla velocità di trasferimento di elettroni, ma non stabilire l&#39;identità e redox stato dei cofattori nella proteina in esame. La tecnica è ampiamente applicabile a qualsiasi proteina contenente un elettrone risonanza paramagnetica (EPR) cofattore rilevabile. Una titolazione tipica richiede 2 ml proteina con una concentrazione cofattore nell&#39;intervallo 1-100 micron. La proteina viene titolato con un riducente chimico (ditionito di sodio) o ossidante (ferricianuro di potassio) per poise il campione ad un certo potenziale. Un filo di platino e un elettrodo di riferimento Ag / AgCl sono collegati ad un voltmetro per misurare il potenziale della soluzione proteica. Un set di 13 diversi mediatori redox viene utilizzato per equilibrare tra i cofattori redox della proteina e gli elettrodi. I campioni sono disegnati in diverse potenzialità e gli spettri Electron Risonanza Paramagnetica, caratteristici per le diverse cofattori redox nella proteina, sono valutate. La trama dell&#39;intensità del segnale rispetto al potenziale di campione viene analizzato usando l&#39;equazione di Nernst per determinare il potenziale del punto medio cofattore.

La titolazione redox del cluster ferro-zolfo contenenti proteine ​​Nar1 da Saccharomyces cerevisiae portato all&#39;identificazione di tre diversi cofattori: Nar1: a [3Fe-4S] grappolo, un [4FE-4S] grappolo e mononucleare centro Fe (Figura 1) . I segnali EPR sono caratterizzate da g-valori: per la [3Fe-4S] + g z 2,01, g incrocio 2.00 (Figura 1B); per la [4FE-4S] +, z g 2,02 g 1,93 y, x 1,82 g (Figura C...

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EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR monitorata Redox Titolazione dei cofattori di<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

13.4K Views.  Delft University of Technology. The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

Video: EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.