Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (NIGMS-074.696) per KAM e un American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship alla JLA Ringraziamo anche John Glover presso l&#39;Università di Toronto per la fornitura del FFL -GFP plasmide sorgente.

1. Costruzione di ceppi contenenti FFL-GFP plasmide Per questo studio, Saccharomyces cerevisiae ceppo BY4741 (MAT una, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) è stato usato in concomitanza con una delezione ceppo Hsp104 dalla collezione ko lievito (Open Biosystems / Thermo Scientific). La delezione è stata confermata usando un anticorpo Hsp104-specifico per l&#39;analisi Western blot. FFL-GFP è stata espressa da p426MET25-FFL-GFP, costruito da una fonte LEU2 basata plasmide ottenuto dal laboratorio Glover presso l&#39;Università di Toronto, 17 e ottenere, su richiesta agli autori. Espressione della proteina di fusione GFP-FFL plasmide è controllata dal promotore MET25 metionina-reprimibile. Il plasmide è stato trasformato in ogni ceppo utilizzando un protocollo è stato adattato da Gietz et. al, 1995: <ol><li> Centrifugare 25 ml o<html> f log cellule di fase in una provetta da 50 ml a 4.400 rpm per 2 minuti, lavare con 500 ml di doppia distillata H 2 0 (DDH 2 O), e scartano supernate. </li><li> Risospendere le cellule in 250 microlitri di TE / Liac (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M di acetato di litio). Incubare a 30 ° C senza miscelare per 20 min. </li><li> Trasferire 50 ml di cellule competenti in una nuova provetta con 5 ml (50 microgrammi) di DNA vettore e 5 microlitri (0,1-5 mg) di DNA plasmidico. Aggiungere 300 ml di PEG / TE / Liac (come TE / Liac più il 40% di glicole polietilene) di questa miscela, e le cellule incubare a 30 ° C per altri 30 min. </li><li> Aggiungere 1/10 del volume (v / v) di DMSO (36 mL) a questa miscela e shock termico a 42 ° C per 6 min. </li><li> Centrifugare miscela a 6.000 rpm per 30 sec e rimuovere supernate. Risospendere le cellule in 100 l di sterili DDH 2 0 e cellule piastra su un supporto completi sintetici privi uracile (SC-URA). </li></ol> 2. Induzione di FFL-GFP nt &quot;&gt; FFL-GFP è indotto volta cellule sono in fase logaritmica quindi la maggior parte della proteina prima heat-shock, di nuova costruzione per evitare le proteine ​​che sono terminalmente aggregate nel tempo a causa inadeguatezze cellulari associate all&#39;invecchiamento. <ol><li> 1 ° giorno: le cellule incubare 5 ml di SC-URA a 30 ° C di rotazione O / N. </li><li> Giorno 2: Misura OD 600 e colture fresche inoculare in 5 ml di SC-URA OD 600 ~ 0.2. </li><li> Incubare culture con rotazione a 30 ° C fino a raggiungere log fase OD 600 ~ 0.8-1.0. </li><li> Centrifugare le cellule in 15 ml provette coniche a 4.400 rpm per 3 minuti, decantare supernate e risospendere il pellet cellulare in 500 ml di DDH 2 0; soluzione di trasferimento in una provetta. </li><li> Centrifugare a 6.000 rpm e scartare supernate. </li><li> Risospendere le cellule in 5 ml di SC-URA-MET. Le cellule devono essere incubate rotante in questo media per 1 ora a 30 ° C. </li><li> Centrifugare le cellule e lavare ripetere in DDH 2 0 e scartare supernate. </li><li> Resuspecellule nd in 5 ml supporti SC-URA contenenti 100 mg / ml di cicloeximide di inibire l&#39;espressione della proteina, e procedere immediatamente al punto 3. </li></ol> 3. Enzimatica FFL-GFP Recovery Assay Questo saggio è un metodo quantitativo per determinare i livelli di enzima attivo in una popolazione. <ol><li> La preparazione di questo saggio: <ol class="lroman"><li> Misurare OD 600 per ogni campione. </li><li> Preparare necessaria quantità di D-luciferina necessario in base al numero di campioni e numero di repliche aggiungono circa 1.200 microlitri per il tubo desiderato. Concentrazione finale di D-luciferina è ~ 23 mg per 100 ml di cellule. Inizialmente si è disciolta in acqua ad una concentrazione della soluzione di 7,5 mg / ml e diluiti a 455 ug / ml in SC prima dell&#39;esperimento. Nella figura 2, tre repliche per ogni campione sono stati analizzati per un totale di 2,4 ml di D-luciferina utilizzato. </li><li> Lettore di piastre di programma per il flash lumisaggio nescence (adattato da Biotek Gen5 &quot;luminescenza Assay Flash con iniezione&quot;, per gli altri strumenti seguono le indicazioni del produttore) <ol class="lalpha"><li> Impostare la temperatura a 30 ° C </li><li> Impostare lettore di piastre per aggiungere D-luciferina, agitare e leggere ogni bene individualmente. </li><li> Leggi luminescenza (lettura finale, 5 sec il tempo di integrazione, 180 livelli di sensibilità) </li><li> Per i test di recupero tra ogni scossa lettura per 5 min, 20 min ritardare, e agitare un ulteriore 5 min. </li><li> Pipettare 50 ml di D-luciferina da un iniettore. </li></ol></li></ol></li><li> Preriscaldare-shock luminescenza è misurato immediatamente dopo che le cellule vengono aggiunti supporti contenenti cicloeximide per fermare la sintesi proteica. <ol class="lroman"><li> Trasferire 100 microlitri di cellule per ogni campione con numero desiderato di repliche in un solido bianco piastra da 96 pozzetti. </li><li> I controlli devono comprendere un vuoto d&#39;acqua e le cellule che contengono un vettore vuoto. </li><li> Avviare la lettura con la specifich elencati sopra. </li></ol></li><li> Per denaturare la porzione di FFL FFL-GFP, incubare la coltura 5 ml in una provetta di coltura di vetro a 42 ° C agitando per 25 min. </li><li> Letture luminescenza saggio di recupero iniziano subito dopo le cellule vengono rimosse dal termostato, che è punto zero tempo. Misura di luminescenza come sopra descritto per il primo punto temporale e ogni 30 min per 90 min. </li><li> Normalizzare i campioni di preriscaldare-shock valori di luminescenza che sono state regolate in base al diametro esterno 600 (dividere i valori di preriscaldamento-shock da OD 600). </li></ol> 4. Microscopia a fluorescenza Questo saggio è un metodo semi-quantitativo per determinare solubilizzazione degli aggregati nel tempo in una popolazione di cellule. <ol><li> L&#39;induzione è la stessa descritta nella sezione 2, punti 1-8 di protocolli. </li><li> Gli stessi punti di tempo sono presi come descritto sopra (sezione 3, punto 4), ma per il microfonoroscopy raccogliere 1 ml di cellule a preriscaldare-shock e ogni punto di tempo di recupero, e campioni incubare rotanti a 30 ° C in tubo di cultura. </li><li> Visualizzazione: <ol class="lroman"><li> Centrifugare 1 ml di cellule a 6.000 rpm per 30 sec e rimuovere supernate. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 2 ml di DDH 2 O. </li><li> Miscelare 2 ml di cellule più 2 ml di 2% basso punto di fusione agarosio sul vetrino e aggiungere un vetrino. Per ottenere un unico piano di cellule premere leggermente dito nel centro del vetrino e ruotare finché il vetrino è difficile da spostare. </li><li> Le cellule sono visualizzati tramite oggettiva olio 100X sul microscopio a fluorescenza; utilizzare DIC per visualizzare le cellule e il filtro FITC per visualizzare fluorescenza GFP. </li><li> Prendere più immagini per ogni ceppo ad ogni tempo per la quantificazione. I campi per le immagini devono contenere ~ 15-30 cellule per l&#39;analisi post-sperimentale quantitativa. </li><li> Per calcolare la percentuale di cellule che contengono aggregati, contare 50Cellule -100 totale e dividere il numero di celle che contengono aggregati. </li></ol></li></ol> 5. Singolo Microscopia cellulare Questo metodo è usato per seguire la solubilizzazione dei singoli aggregati in una singola cella nel tempo. <ol><li> Indurre l&#39;espressione FFL-GFP, come descritto nella sezione 2, punti 1-8. </li><li> Dopo heat-shock, le cellule da centrifuga da 15 ml tubo conico a 4.400 rpm per 2 min. </li><li> Lavare le cellule con 500 ml di acqua e risospendere in 20 ml di DDH 2 O. </li><li> Per ogni ceppo, tagliare una sezione di 5x5 mm su una piastra di agar SC-URA e utilizzando la superficie che era in contatto con la piastra di Petri, Pipetta 4 microlitri di cellule e diffuso in tutto superficie di agar con puntale. Lasciate riposare per circa 1 min. </li><li> Utilizzare le pinzette per posizionare sezione cubo agar a faccia in giù su un ~ 55 millimetri di vetro fondo piatto n ° 0 e premere leggermente. </li><li> Visualizzazione: <ol class="lroman"><li> Vedere i-iii a Sectione 4. </li><li> Impostare le coordinate di 2-4 punti focali per ogni ceppo a seconda della densità della cultura. </li><li> Impostare fotocamera per scattare foto con una Z-stack con gamma appropriata (- / + 15 micron di spessore fetta 0.5-1.0 micron) ogni 5 min per un periodo di 90 min. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis.">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins.">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li><li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding.">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li><li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo l&#39;proteina modello FFL-GFP è stato usato per dimostrare che il disaggregase lievito, Hsp104 contribuisce alla proteina re-solubilizzazione e riparazione. I saggi enzimatici e microscopia differenzialmente interrogato lo stato della stessa proteina substrato per determinare ripiegamento efficienza e la resa. Risultati dei saggi enzimatici recupero suggeriscono che non solo è il massimo recupero nel hsp104D ceppo mutante inefficiente, ma la grandezza iniziale della sollecitazione dispiega...

Negli esseri umani malattie neurodegenerative tra cui l&#39;Alzheimer, il Parkinson e le malattie di Huntington sono stati collegati a misfolding e aggregazione 10. Le cellule impiegano chaperon molecolari per prevenire intrappolamento cinetica delle proteine ​​cellulari in strutture inattive mal ripiegate 6. Accompagnatori partecipano a reti di interazione complessi all&#39;interno della cellula, ma non è completamente noto come la somma di queste interazioni contribuisce a proteostasis organismal. Uno degli accompagnatori principali responsabili della maggior parte dei citosolica ripiegamento delle proteine ​​è il 70 kD proteina da shock termico (Hsp70) famiglia 19. È stato dimostrato che la perdita di lievito Hsp70 diminuisce la capacità di piegare nascente FFL heterologously espresso e ripiegare la proteina endogena, ornitina transcarbamoylase, in vivo 18, 7. La capacità di analizzare pieghevole con risoluzione tempo quasi reale faciliterà la comprensione di come ulteriore fattori cellulari contribute a questo processo Hsp70-dipendente. Inoltre, piegatura / ripiegamento reazioni potrebbe non essere completamente dipendente da queste proteine ​​che contribuiscono, in modo dosaggi devono essere abbastanza sensibile per rilevare piccole e grandi cambiamenti nella cinetica e di efficienza. Il disaggregase cellula di lievito, Hsp104, svolge un ruolo fondamentale nella riparazione di proteine ​​mal ripiegate aggregati. Sebbene Hsp104 omologhi sono stati identificati in funghi e piante, questa famiglia sembra essere assente in metazoi. E &#39;stato proposto che altri chaperon come quelle della famiglia Hsp110 eseguire alcuni dei noti Hsp104 attività nei mammiferi 16. Hsp104 è un +, complesso proteico esamerica AAA che funziona in lievito di aggregati proteici rimodellare, contribuendo a ripiegamento e riparazione 13. Hsp104, insieme con il lievito Hsp70, Ssa1, e il lievito Hsp40, Ydj1, necessario per il ripristino di FFL denaturato in cellule di lievito 5, 8. La piccola proteina da shock termico, Hsp26, ha anche dimostrato di essere requirosso per disaggregazione Hsp104-mediata di FFL 2. FFL è una proteina due dominio che lega il substrato luciferina nel sito attivo e seguendo un cambiamento conformazionale che richiede ATP e ossigeno, decarbossila il substrato rilasciando oxyluciferin, anidride carbonica (CO 2), adenosina monofosfato (AMP), e la luce 11, 9, 3. Il substrato disponibile in commercio FFL, D-luciferina, provoca emissione di luce tra 550-570 nm che possono essere rilevati usando un luminometro 15. FFL è squisitamente sensibile alla denaturazione da trattamenti chimici o di calore e aggrega rapidamente a dispiegarsi. Se esposto a temperature tra 39-45 ° C FFL è reversibile spiegato ed inattivato 12. In contrasto, GFP e suoi derivati ​​sono altamente resistenti alla proteina dispiegarsi sollecitazioni 14. Pertanto fusione di queste due proteine ​​permette FFL aver operato come frazione sperimentalmente labile in grado di colpire G funzionaleFP a intracellulare depositi che possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza sia la popolazione e livelli di cellule singole. Applicazione del saggio enzimatico in un lettore di piastre multimodale semi-automatico accoppiato con microscopia automatizzata consente la valutazione simultanea senza precedenti di cinetica e di rendimento di ripiegamento reazioni. Inoltre, la genetica molecolare facili del modello eucariote Saccharomyces cerevisiae consente sia precisa manipolazione della rete di controllo della qualità delle proteine ​​e l&#39;opportunità di approcci basati scoperta per identificare nuovi giocatori che contribuiscono alla risposta allo stress cellulare e proteostasis. In questo studio, i ceppi wild-type (WT) e Hsp104 cancellazione esprimono FFL-GFP sono soggetti a denaturazione delle proteine ​​da shock termico. FFL-GFP ripiegamento viene monitorata attraverso sia un saggio enzimatico e microscopia come visualizzatore proxy per la riparazione del proteoma espresso in un corso di tempo di ripristino. Se paragonato alle cellule WT, mostriamo the Hsp104 ceppo cancellazione è ~ 60% meno efficiente a ripiegamento FFL-GFP, sostenendo risultati precedenti che istituisce un ruolo per Hsp104 nella riattivazione di denaturato FFL 2.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, definiti come i processi combinati di proteine ​​pieghevole / biogenesi, ripiegamento / riparazione, e il degrado, è un delicato equilibrio cellulare che deve essere mantenuta per evitare conseguenze deleterie 1. Fattori esterni o interni che sconvolgono questo equilibrio può portare ad aggregazione proteica, la tossicità e la morte cellulare. Negli esseri umani questo è un fattore importante che contribuisce ai sintomi associati a patologie neurodegenerative come la corea di Huntington, il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer 10. È pertanto essenziale che le proteine ​​coinvolte nel mantenimento di proteostasis essere identificati per sviluppare trattamenti per queste malattie debilitanti. In questo articolo vengono descritte le tecniche per il monitoraggio in ripiegamento delle proteine ​​vivo a risoluzione quasi in tempo reale utilizzando il modello di proteina lucciola luciferasi fusa alla proteina fluorescente verde (GFP-FFL). FFL-GFP è una proteina chimerica modello unico come la frazione FFL è estremamente sensibile allo stress indotto misfolding e aggregazione, che inattiva l&#39;enzima 12. Attività di luciferasi è monitorata utilizzando un saggio enzimatico, e la frazione GFP fornisce un metodo di visualizzazione FFL solubile o aggregate utilizzando la microscopia automatizzata. Questi metodi accoppiati incorporano due approcci paralleli e tecnicamente indipendenti per analizzare sia ripiegamento e riattivazione funzionale di un enzima dopo stress. Attività di recupero può essere direttamente correlata con la cinetica di disaggregazione e ri-solubilizzazione per capire meglio come proteine ​​fattori di controllo di qualità come chaperon proteine ​​collaborano per eseguire queste funzioni. Inoltre, delezioni o mutazioni geniche possono essere usati per testare contributi di proteine ​​specifiche o subunità proteiche a questo processo. In questo articolo esaminiamo i contributi della proteina disaggregase Hsp104 13, nota di collaborare con il fattore di scambio Hsp40/70/nucleotide (NEF) Sistema 5 ripiegamento, di ripiegamento delle proteine ​​per validare questo approccio.

Lievito dipende dalla disaggregase, Hsp104 per ripiegare efficientemente proteine ​​denaturate termicamente. L&#39;attività di FFL-GFP è stata monitorata dopo uno shock termico 25 min, utilizzando un flash assay luminescenza Figura 1. I risultati di questo test automatizzati illustrato nella figura 2 hanno rivelato un aumento graduale dell&#39;attività durante 90 min ha permesso di ottenere un recupero&gt; 80% in cellule WT. Il ceppo hsp104Δ recuperato il 19% dell&#39;a...

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Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Questo articolo descrive l&#39;uso di una proteina di fusione GFP-luciferasi lucciola per indagare<em&gt; In vivo</em&gt; Folding delle proteine ​​in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Usando questo reagente, ripiegamento di una proteina modello denaturato al calore può essere monitorato contemporaneamente mediante microscopia a fluorescenza e un saggio enzimatico per sondare i ruoli dei componenti di rete proteostasis nel controllo di qualità delle proteine.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K Views.  University of Texas Medical School. Questo articolo descrive l'uso di una proteina di fusione GFP-luciferasi lucciola per indagare In vivo Folding delle proteine ​​in Saccharomyces cerevisiae. Usando questo reagente, ripiegamento di una proteina modello denaturato al calore può essere monitorato contemporaneamente mediante microscopia a fluorescenza e un saggio enzimatico per sondare i ruoli dei componenti di rete proteostasis nel controllo di qualità delle proteine.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine in ripiegamento