Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

1. La crescita di cellule di lievito <ol><li> Selezionare le opportune ceppi di lievito da utilizzare per le misure di mRNA tasso di decadimento. Per inibire la trascrizione con l&#39;allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, utilizzare ceppi di lievito che ospitano la mutazione rpb1-1 1. Ottenere questo ceppo di lievito da un laboratorio che ha già uno, o generare in laboratorio utilizzando tecniche standard se un background genetico specifico è richiesto 9. </li><li> Usando una tecnica sterile, preparare mezzi lievito utilizzando le procedure standard 10. Se è necessaria alcuna selezione, preparazione rich media come YPD. In alternativa, preparare mezzi selettivi se è necessario le cellule di lievito vengono trasformate con plasmidi e selezione. Sterilizzare i media. </li><li> Crescere le cellule di lievito a 28 ° C, che è la temperatura permissiva per questo ceppo di lievito. Fate questo in due fasi: <ol><li> Per la prima O / N, crescere le cellule di lievito in 5 ml di terreni di crescita a saturazione.</li><li> Impostare la seconda O / N alla fine del secondo giorno. Per il secondo O / N, inoculare diverse quantità di cellule di lievito dal primo O / N in 100 a 150 ml di mezzi di crescita (da 100 ml a 1 ml, 2 ml o più, a seconda di quando le cellule di lievito devono essere raccolti il ​​giorno successivo). Eseguire questo passaggio per assicurare che una delle culture è alla corretta OD 600 il giorno seguente. </li></ol></li></ol> 2. Raccogliere le cellule di lievito <ol><li> Preparatevi a raccogliere le cellule di lievito. I tempi per questa fase è critica; etichettare tutti i tubi necessari e raccogliere tutte le attrezzature e materiali necessari in un unico luogo. Riscaldare a bagnomaria a 39 ° C e preriscaldare due 15 ml provette dei mezzi di crescita a 28 ° C ea 60 ° C. NOTA: Il volume del supporto 15 ml crescita può essere variato a seconda del numero di punti di tempo le cellule devono essere raccolte. </li><li> Raccogliere le cellule di lievito quando raggiungono un OD 600 da 0,4 a 0.7. Trasfer le celle a 4-6 sterili 50 ml vite bottiglie tappo. Centrifugare a 7500 xg in una centrifuga ad alta velocità per 5 minuti a RT. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in media di crescita di 15 ml che è stato equilibrante a 28 ° C. Pool le cellule di lievito in un pallone da 250 ml sterile e equilibrare per ~ 5 min alla temperatura di crescita 28 ° C. </li><li> Dopo che le cellule di lievito sono equilibrati alla temperatura di crescita, immediatamente aggiungere 15 ml di mezzi di crescita equilibrata a 60 ° C per aumentare la temperatura a 39 ° C (la temperatura nonpermissive) e collocare immediatamente il pallone nel bagno d&#39;acqua a 39 ° . Assicurarsi che il terreno di coltura rimane nel bagno d&#39;acqua 39 ° C durante le restanti fasi di raccolta delle cellule per garantire che la trascrizione è disattivata. </li><li> Raccogliere le cellule in diversi momenti dopo aver posizionato il pallone nel bagno di 39 ° C dell&#39;acqua. Per la prima volta punto, raccogliere le cellule subito dopo aver posizionato il pallone a 39 &amp; #176; C. Raccolto un&#39;aliquota 3 ml e distribuire il 3 ml in due, 1,5 ml microprovette. Agglomerare le cellule per 10 secondi in un mini centrifuga o picofuge con decelerazione rapida e versare il surnatante. </li><li> Congelare immediatamente il pellet in un bagno di ghiaccio / etanolo secco o in azoto liquido. Designare il primo punto volta le cellule vengono raccolte presso il punto di tempo zero. </li><li> Sperimentalmente determinare i punti di tempo le cellule sono raccolte in seguito da un esperimento pilota, a seconda delle mRNA di interesse. Normalmente, le cellule di lievito raccolto ai seguenti punti di tempo: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 e 35 min (Figura 2B). Se l&#39;emivita mRNA non può essere determinato utilizzando i punti di tempo di cui sopra, regolare questi punti di tempo. Ad esempio, per mRNA con emivita breve previsti, utilizzare tempi più brevi punti, (cioè, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 e 18 min) e mRNA con lunghe emivite previste, estendere i punti di tempo. </li><li> Dopo che le cellule sono ahrvested, li memorizza in un -80 ° C freezer fino a quando l&#39;estrazione di RNA viene effettuata. </li></ol> 3. Estratto RNA dalle cellule di lievito <ol><li> Per la parte di estrazione di RNA del protocollo, utilizzare RNase tecniche libere per evitare la degradazione dell&#39;RNA da RNasi. Preparare RNase soluzioni gratuite, articoli in vetro e plastica ware per essere utilizzati nell&#39;estrazione dell&#39;RNA. </li><li> Estrarre il RNA dalle cellule di lievito secondo protocolli standard. In genere, utilizzare il metodo del fenolo a caldo 12. In alternativa, utilizzare i kit che possono essere utilizzate per estrarre RNA da cellule di lievito. </li><li> Determinare la quantità e la purezza del RNA, normalmente misurando l&#39;assorbanza a 260 A e 280 A di 2 ml di RNA utilizzando un Nanodrop. Determinare la concentrazione dell&#39;RNA dalla A 260. Sulla base della concentrazione, diluire l&#39;RNA a 1 mg / mL con acqua DEPC trattata. NOTA: Il rapporto tra la A 260 / A 280 fornisce informazioni sulla tegli purezza del RNA. Un campione di RNA è pura se il rapporto A 260 / A 280 è di 2,0 ± 0,1. </li></ol> 4. Northern Blot Analysis NOTA: Utilizzare macchie settentrionali per quantificare i livelli di mRNA e ottenere informazioni sulle dimensioni delle trascrizioni. Inoltre, utilizzare macchie nord per rilevare mRNA che producono molteplici isoforme dello stesso mRNA. <ol><li> Preparare un gel di agarosio-formaldeide 1,0%. Eseguire la stessa quantità di RNA del campione sul gel di agarosio formaldeide mediante elettroforesi secondo protocolli standard 12. Eseguire una scala di RNA a fianco dei campioni di RNA e utilizzarlo per determinare le dimensioni del RNA che vengono rilevati sulla macchia settentrionale. Prima di trasferire il RNA separati su gel di agarosio formaldeide ad una membrana, tagliare la sezione con la scaletta RNA dal gel e visualizzare con bromuro di etidio. NOTA: In alternativa, l&#39;intero gel può essere colorato con bromuro di etidio prima del trasferimento del RNA. </li><li> Lacampioni opo l&#39;RNA sono migrati ad una distanza appropriata sul gel, trasferire l&#39;RNA di una membrana con RNase tecniche libere. Utilizzare uno dei diversi protocolli disponibili per il trasferimento RNA a membrane 12-13. Per trasferire l&#39;RNA ad una membrana, tagliare la membrana a circa la stessa dimensione del gel. Trasferire l&#39;RNA secondo protocolli standard 12. </li><li> UV cross-link del RNA alla membrana utilizzando un reticolante UV seguendo le istruzioni del produttore. In alternativa, la membrana cuocere in forno a 80 ° C per 1 ora. Conservare la membrana a -20 ° C in un sacchetto di plastica indefinitamente finché non viene ibridato a sonde specifiche. NOTA: La membrana secca può anche essere conservato a temperatura ambiente tra carte da filtro. </li></ol> 5. Ibridare sonde complementare al RNA di interesse per la membrana NOTA: Un modo per rilevare mRNA sulla membrana è di ibridare 32 P sonde a DNA marcate. ATTENZIONE: Researchers lavorano con 32 P bisogno di utilizzare le procedure di protezione per prevenire la contaminazione. Seguire le linee guida istituzionali sull&#39;uso di materiale radioattivo. <ol><li> Preparare la sonda di DNA etichettando 25 - 50 ng del DNA da ibridati alla membrana secondo protocolli standard 12. Generare il frammento di DNA mediante PCR o plasmide digestione. Determinare l&#39;attività specifica della sonda DNA contando 1 microlitri della sonda di DNA marcata dopo i nucleotidi non incorporati vengono rimossi 12. </li><li> Preriscaldare tampone prehybridization / ibridazione a 42 ° C. Utilizzare ~ 10 ml del tampone prehybridization / ibridazione per 100 cm 2 della membrana 12. </li><li> Ibridare: 1 - 5 x 10 6 cpm di sonda di DNA radiomarcato per ml di tampone di ibridazione alla membrana O / N in un fornetto per rilevare l&#39;mRNA di interesse 12. Assicurarsi che durante l&#39;ibridazione rotazione ibridazione forno è in una direzione cheprovoca tutta la membrana di essere esposti alla soluzione di ibridazione, per garantire la corretta ibridazione. </li><li> Lavare la membrana due volte a temperatura ambiente per 15 min con 50 ml di 2x SSPE e una volta a 65 ° C con 50 ml di 2x SSPE / 2% SDS per 15 min 12. Avvolgere la membrana in involucro di plastica per assicurarsi che non si secchi o contaminare lo schermo Phosphor. </li><li> Utilizzando un contatore Geiger, stimare l&#39;intensità della radioattività sulla membrana. NOTA: Questa stima assicura che la membrana è esposta alla schermata fosforoso per la quantità di tempo appropriato. Utilizzare tempi di esposizione più lunghi per le membrane con basse quantità di radioattività. </li><li> Per macchie settentrionali, utilizzare un controllo di carico per confermare che la stessa quantità di RNA vengono caricati su ogni punto. Per fare questo, striscia la membrana e reprobe con un RNA che non è influenzata dal processo in esame. Striscia la membrana ponendolo in un vassoio di vetro contenente 200 ml di soluzione bollente di stripping (0,1% SDS / 0,01 XSSC) per 2 min. Versare la soluzione stripping e ripetere la procedura per cinque volte 12. NOTA:. Un esempio di RNA usato come controllo di caricamento è SCR1 SCR1 è un trascritto RNA polimerasi III che è stabile e abbondante SCR1 RNA abbondanza non dovrebbe cambiare significativamente durante brevi periodi di RNA polimerasi II inibizione.. </li></ol> 6. Quantificare l&#39;RNA che è legato alla membrana NOTA: Per quantificare la quantità di radioattività su membrana, esporre la membrana ad uno schermo fosforoso. Dopo il tempo di esposizione del caso, la scansione della schermata Phosphor utilizzando un phosphorimager. <ol><li> Scansione schermo Phosphor utilizzando le istruzioni fornite dal produttore del phosphorimager. </li><li> Quantificare l&#39;mRNA in ogni punto. Quantificare i livelli di mRNA utilizzando il software ImageQuant o al software correlato. Normalizza l&#39;mRNA ciascun tempo al controllo di carico. Se SCR1 è stato utilizzato come il caricamentoil controllo, normalizzare i northerns emivita di SCR1. </li><li> L&#39;emivita del mRNA viene calcolata dividendo la quantità di mRNA rimanente in ciascun punto temporale dalla quantità di mRNA presenti al punto temporale 0 (il punto di tempo iniziale). Rappresentare graficamente la percentuale mRNA rimanente in funzione del tempo su un terreno semilogaritmica (Figura 2C). Calcolare emivite mRNA dalla seguente equazione: t 1/2 = -0,693 / k (negativo 0,693) </li><li> k è l&#39;inclinazione della retta di regressione e t 1/2 è l&#39;emivita mRNA. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

L&#39;inibizione della sintesi di mRNA e monitoraggio fatturato mRNA in assenza di nuova sintesi è un metodo che viene spesso utilizzato per misurare i tassi di decadimento mRNA. In S. cerevisiae, la misurazione dei tassi mRNA decadimento inibendo la trascrizione usando l&#39;allele termosensibile di RNA polimerasi II è uno dei metodi più usati. Questo metodo inibisce specificamente l&#39;RNA polimerasi II. Le fasi più critiche per la determinazione dei tassi di decadimento mRNA con questa tecnica sono: 1) ...

La trascrizione e il decadimento di mRNA specifici sono determinanti cruciali della espressione genica. La velocità di sintesi e decadimento di specifici mRNA determina il livello di stato stazionario di quel particolare mRNA. I livelli di stato stazionario di mRNA governano l&#39;abbondanza di mRNA e di determinare quanto di ogni mRNA è disponibile per la sintesi proteica. Misure di emivita di mRNA sono ampiamente utilizzati per determinare il tasso di decadimento di mRNA. MRNA specifico decadimento a tassi diversi che sono legati alle caratteristiche del mRNA, la funzione della proteina codificata dal mRNA e delle condizioni ambientali. A seconda della tecnica utilizzata per determinare i tassi di decadimento mRNA, le misurazioni del tasso di decadimento possono essere determinati a livello globale o per i singoli trascrizioni. In lievito S. cerevisiae, le tecniche che sono più comunemente usati per misurare i tassi di decadimento mRNA globale includono utilizzando un ceppo di lievito ospitare l&#39;allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II e transc chimicainibitori riptional come thiolutin e 1,10-fenantrolina 1-5. Questi metodi possono anche essere utilizzati per misurare mRNA individuale decay rates 4. Altri metodi possono anche essere utilizzati per misurare i tassi di decadimento mRNA. Questi metodi includono approccio alla etichettatura stato stazionario o l&#39;utilizzo di molecole di mRNA che vengono espresse da un promotore regolamentato che si esprime solo in alcune condizioni. Ognuna di queste tecniche presenta alcuni vantaggi e limitazioni. La tecnica qui descritta utilizza l&#39;allele termosensibile di RNA polimerasi II. Questo metodo utilizza S. cerevisiae come il modello, ma può modificato e utilizzato in altri sistemi utilizzando apposite tecniche di inibizione trascrizionale 6. mRNA misure emivita utilizzando l&#39;allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II sono ampiamente utilizzati per entrambe le misure genome-wide e individuali di mRNA decadimento 4-5. Questa tecnica richiede l&#39;uso di un speciflievito ic che ospita un allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, rpb1-1 1. Il razionale di questa tecnica è che l&#39;esposizione del ceppo di lievito termosensibile alla temperatura nonpermissive inibisce la sintesi di mRNA. Successivamente, il decadimento del mRNA preesistente viene monitorato in diversi momenti dopo la trascrizione è stato inibito. La scomparsa del mRNA preesistente è monitorato estraendo RNA dalle cellule di lievito a tempi diversi dopo la trascrizione è stata spenta. I punti di tempo in cui le cellule di lievito vengono raccolte sono predeterminati da un esperimento pilota, e dipendono dalle trascrizioni e il sistema in fase di studio. Punti di tempo più rapidi sono utilizzati per le trascrizioni di breve durata, mentre i punti di tempo più lunghi sono utilizzati per le trascrizioni lungo vissuto. Successivamente, il decadimento del mRNA è monitorato da una analisi Northern blot, PCR quantitativa o RNAseq. Misura di emivita di mRNA utilizzando un temperature allele sensibile di RNA polimerasi II ha i suoi vantaggi. In primo luogo, questa tecnica è facile e semplice. In secondo luogo, una volta che il ceppo di lievito è acquisito o generato in laboratorio gli mRNA misure mezza vita possono essere determinati in diverse condizioni di crescita; consentire la ricostruzione della influenza ambientale sul mRNA decadimento. In terzo luogo, i tassi di decadimento mRNA possono essere monitorati a livello di genoma. L&#39;utilizzo di altre tecniche di inibizione della trascrizione ha anche vantaggi e limiti. Ad esempio, l&#39;uso di un promotore inducibile richiede subcloning per generare un mRNA che è sotto il controllo del promotore regolato. Thiolutin non è prontamente disponibile ed è costoso quando disponibile. Inoltre, la modalità di thiolutin di azione non è completamente noto ed è stato segnalato per influire su altri processi cellulari, tra cui l&#39;inibizione mRNA decadimento 7. In alternativa, 1,10-fenantrolina, è più facilmente disponibile. Inoltre, tutte le tecniche utilizzate per inibire la trascrizione può Perturb funzione cellulare e può colpire diversi mRNA in modi diversi. Un investigatore deve determinare il metodo più appropriato da utilizzare nelle loro condizioni sperimentali per ottenere i risultati più affidabili. Per determinare qual è il metodo più adatto per la loro applicazione, un ricercatore ha bisogno di identificare le trascrizioni e la funzione delle proteine ​​codificate dai trascrizioni di essere indagati. Le misurazioni dei tassi di mRNA decadimento più affidabili sono quelli che sono determinato usando diverse tecniche e mostrare lo stesso tasso di decadimento. Nessuna singola tecnica è sempre la migliore, e la tecnica più appropriata dipende dalla situazione specifica. Numerosi studi in S. cerevisiae hanno misurato i tassi di decadimento mRNA in varie condizioni e background genetico. Le condizioni che i tassi di decadimento mRNA sono misurati in dipendono dalla esperimento specifico oggetto di indagine. Misurare i tassi di decadimento mRNA in differenti ambienti cellulari determina se le condizioni di essereesaminati preferenzialmente influenzare i tassi di decadimento di mRNA specifici. I tassi di decadimento di mRNA può anche variare a seconda del ceppo di lievito utilizzato. Ad esempio, i tassi di decadimento mRNA possono essere determinati in cellule di lievito wild-type e le cellule di lievito con un nonsense-mediata mRNA degradazione (NMD) percorso non funzionali. Questo degrado percorso mRNA si trova in tutti gli organismi eucarioti che sono stati esaminati finora e si innesca la degradazione di mRNA che terminano prematuramente traduzione 8. NMD è stato inizialmente identificato come un percorso che degrada mRNA con codoni di terminazione prematuri o codoni nonsenso, ma è ormai riconosciuto come un percorso che regola anche l&#39;espressione di non-nonsense contenente mRNA naturali. mRNA che sono gli obiettivi del percorso sono rapidamente degradati in cellule di lievito con un percorso NMD funzionale e stabilizzato in cellule di lievito con un percorso NMD non funzionale. Così, l&#39;emivita di mRNA che sono obiettivi diretti di questa via sono più brevi in ​​wild-type lievito cells rispetto alle cellule di lievito con un percorso NMD non funzionali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNA livelli allo steady variano a seconda delle condizioni ambientali. Regolamento delle costanti livelli di accumulo stato di un mRNA che assicura la corretta quantità di proteine ​​è sintetizzata per le condizioni di crescita specifici della cellula. Un approccio per misurare i tassi di decadimento mRNA è inibire la trascrizione e successivamente monitorare la scomparsa del già presente mRNA. La velocità di degradazione dell&#39;mRNA può essere quantificato, e un accurato emivita può essere determinata utilizzando diverse tecniche. In S. cerevisiae, protocolli che misurano mRNA sono stati sviluppati emivita includono inibendo la trascrizione di mRNA utilizzando ceppi che ospitano un allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, rpb1-1. Altre tecniche per mRNA emivite includono l&#39;inibizione della trascrizione con inibitori trascrizionali come thiolutin o 1,10-fenantrolina, oppure misurando, utilizzando mRNA che sono sotto il controllo di un promotore regulatablecome il galattosio promotore inducibile e il sistema TET-off. Qui, descriviamo la misurazione di S. cerevisiae mRNA tassi di decadimento con l&#39;allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II. Questa tecnica può essere usata per misurare mRNA tassi di decadimento di singoli mRNA o di tutto il genoma.

<html> La capacità di questo protocollo per misurare con precisione i tassi di decadimento mRNA dipende l&#39;inibizione della trascrizione, la raccolta di cellule di lievito nei momenti opportuni, e l&#39;utilizzo di tecniche di RNasi libero, mentre l&#39;estrazione dell&#39;RNA e Northern blotting. Probing per due mRNA controllo notoriamente instabile e stabile, rispettivamente, prevede la fiducia che l&#39;esperimento ha funzionato. Ad esempio, questo può essere realizzato attraverso una prova con una sonda che rile...

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Il livello di stato stazionario di specifici mRNA è determinata dalla velocità di sintesi e decadimento del mRNA. Velocità di degradazione mRNA genome-wide o dei tassi di decadimento di specifici mRNA può essere misurata determinando emivita mRNA. Questo protocollo si concentra sulla misurazione del mRNA tassi di decadimento in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

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Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

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Video: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR monitorata Redox Titolazione dei cofattori di<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...