Questo lavoro è stato finanziato dalla US Cystic Fibrosis Foundation (CFF), attraverso la sua struttura consortile CFTR 3D. TR è stato finanziato da una borsa di studio nel Regno Unito CF Trust, e NC da una borsa di studio nel Regno Unito BBSRC. Noi riconosciamo i nostri colleghi della struttura consortile CFF CFTR 3D per il loro aiuto e consigli e per la progettazione dei polli sequenza CFTR e di depurazione tag codone ottimizzato.

1. Preparazione di buffer <ol><li> Per rendere lo stock 100x inibitori della proteasi (PI) cocktail sciogliere 96 mg AEBSF, 3,5 mg chimostatina, 10 mg E64, 16,5 mg leupeptina, 16,5 mg pepstatina, 348 mg PMSF, e 4 mg Bestatin in 20 ml di DMSO. Fai aliquote da 1 ml e conservare a -20 ° C. Per fare una scorta 100x di benzamidina sciogliere 720 mg in 20 ml di acqua ultrapura (DDH 2 O) e conservare in 1 ml aliquote a -20 ° C. Questa quantità è sufficiente per una purificazione. In tutti i buffer, le scorte PI e benzamidina sono usati alla diluizione 1:100. </li><li> Preparare &#39;MPIB&#39; (0,3 M Tris pH 8, 0.3 M saccarosio, 2 mM DTT) e &#39;CFTR&#39; (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) di glicerolo, 1 mM DTT) tamponi e freddo a 4 ° C . Prima dell&#39;uso, aggiungere 1:100 del cocktail di inibitori di proteasi e 1:100 benzamidina base al volume di MPIB usato per risospendere il pellet cellulare (ad esempio, utilizzare 3,5 ml PI e 3,5 ml benzamidina in un volume totale di 350 ml MPIB). </li><li> Preparare solubilization buffer. Liso-fosfatidil glicerolo-14 (GPL) tampone di solubilizzazione (50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) di glicerolo, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, inibitori della proteasi (PI) e 4% (w / v) GPL) e maltoside dodecil (DDM) tampone di solubilizzazione (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glicerolo, 1 M NaCl, 1 mM DTT, inibitori della proteasi, 4% (w / v) DDM). Buffer può essere sonicata in un bagno di sonicazione (35 W, 40 kHz) per assistere con dispersione del detersivo, ma evitare vortex la miscela, come questo crea bolle. Freddo a 4 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> CFTR buffer di purificazione per la purificazione GPL è Tris 50 mM, 10% (v / v) di glicerolo, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (p / v) GPL-14 e inibitori della proteasi. Preparare 350 ml di questo buffer, e 150 ml dello stesso tampone e 1 M imidazolo. Regolare il pH di entrambi i buffer a 8. </li><li> Il tampone per la purificazione in DDM costituito da 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glicerolo, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) DDM. Preparare 350 ml di questo buffer, e 150 ml dello stesso tampone e 1 M imidazoLe. Regolare il pH di entrambi i buffer a 8. </li><li> Per la cromatografia a permeazione di gel (GPC) tampone contenente GPL, preparare 50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) di glicerolo, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,05% (w / v) GPL-14. Per GPC usando DDM preparare un tampone di 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) glicerolo, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) DDM. Tutti i tamponi e DDH 2 O utilizzati sulla colonna GPC devono essere filtrati (0,2 micron filtro) e degasate prima dell&#39;uso. </li><li> Tampone campione SDS-PAGE (2x la concentrazione di lavoro): 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5% (v / v) glicerolo, EDTA 5 mM, 0,02% (w / v) di blu di bromofenolo. Rendere 700 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C. Prima dell&#39;uso, aggiungere 200 ml di 20% (w / v) di sodio dodecil solfato (SDS) e 100 ml di fresco 0,5 M DTT. Incubare per almeno 10 min con il campione a temperatura ambiente prima di caricare su gel. Non riscaldare; questo denaturare la GFP e può causare CFTR aggregare. </li><li> Per rendere le scorte lipidiche per la ricostituzione, sciogliere un 4:01 (w / w), miscela di E. coli lipidi und in cloroformio e metanolo colesterolo (2:1 v / v), e secca in una fiala di vetro sotto N 2 gas per 2 ore per formare un film lipidico. Aggiungere tampone GPC (senza NaCl) ad una concentrazione lipidica di 40 mg / ml e utilizzare vortex ripetuta e sonicazione (35 W, 40 kHz) per chiarire la soluzione. </li><li> Per il saggio ATPasi, preparare 100x scorte di inibitori ATPasi sciogliendo SCH28080 a 1 mM in DMSO, NaSCN a 1 M in DDH 2 O e oligomicina a 2,5 mM in 100% (v / v) di etanolo. Conservare in aliquote a -20 ° C. Rendere 100 ml di tampone ATPasi con 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NH 4 Cl, 5 mM MgSO 4 e 0,02% (w / v) NaN 3. Questo può essere conservato a temperatura ambiente e utilizzato per diversi saggi. Preparare uno stock di 5 mM ATP immediatamente prima dell&#39;uso e tenere in ghiaccio. (NB Usa Na 2 ATP per evitare un eccessivo segnale di fondo del fosfato nel saggio). Preparare la soluzione di SDS arresto (12% (w / v) di SDS in DDH 2 O). </li><li> Per la rilevazione Chifflet preparare tampone A (3% (w/ V) ascorbato, 0.5% (w / v) molibdato di ammonio, 0,5 M HCl) immediatamente prima dell&#39;uso e tampone B (2% (w / v) citrato di sodio, 2% (w / v) di sodio meta-arsenito, 2% (v / v) di acido acetico). </li></ol> 2. Isolamento di Microsomes lievito <ol><li> S. cerevisiae esprimendo CFTR pollo sono coltivate come descritto in O&#39;Ryan et al. (2012) 14. Conservare il materiale da una fermentazione L 20 in due aliquote a -80 ° C per 6 mesi. </li><li> Scongelare una aliquota di cellule rapidamente e risospendere in 3 ml MPIB refrigerate per grammo di cellule. </li><li> Distruggere le cellule in un mulino a sfere con perle di vetro di 425-600 micron di diametro. Utilizzare cinque periodi 1 min di rottura delle cellule separate da 1 min periodi di riposo. (I periodi di riposo sono essenziali per assicurare che le cellule non sono riscaldate durante l&#39;interruzione.) </li><li> Controllo rottura delle cellule mediante centrifugazione di un campione di 1 ml di lisato cellulare dal mulino a sfere. Centrifuga (12.000 xg, 4 ° C, 5 min) in un centr da bancoifuge. Diluire il surnatante a 1:50 con MPIB in una provetta e misurare la A 380. Se A 380&gt; 0,1, o ha smesso di aumentare, nonostante diversi cicli bead-battenti ripetuti, procedere al passo successivo. In caso contrario, ripetere 2,3-2,4. </li><li> Centrifugare il lisato cellulare totale (12.000 x g, 4 ° C, 20 min). Conservare il surnatante. Eliminare il pellet (contenente cellule intatte e mitocondri), ma se c&#39;è qualche dubbio circa l&#39;efficienza di rottura cella (si veda 2.4), quindi conservare il pellet anche. </li><li> Centrifugare il surnatante della fase precedente (200.000 xg, a 4 ° C, 1,5 hr). Eliminare il surnatante e sospendere nuovamente le membrane microsomiali pellet in tampone CFTR. Se i microsomi sono destinati purificazione utilizzando DDM, integrare il buffer CFTR con 1 M NaCl. </li><li> Ripetere la centrifugazione della frazione di membrana risospeso (100.000 x g, 4 ° C, 1 ora) e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in microsomiun volume minimo di tampone CFTR (volume finale 5-15 ml, proteina microsomiale totale 70-200 mg). Un saggio Bradford può essere utilizzato per determinare la concentrazione totale di proteine ​​microsomiali 25. Inoltre deve essere misurato lo spettro di emissione di fluorescenza delle membrane (eccitazione = 485 nm, emissione = 500-600 nm) e dovrebbe avere un picco di fluorescenza GFP distinta (massimo a 512 nm). CFTR può essere specificamente rilevato su un gel SDS-PAGE, scansionata in condizioni fluorescenza GFP (Figura 1). </li><li> Flash-congelare i microsomi risospeso immergendo in azoto liquido e conservare a -80 ° C, o passare alla Fase 3. </li></ol> 3. Solubilizzazione di Microsomes <ol><li> Se congelato, scongelare microsomi immediatamente prima dell&#39;uso in un bagnomaria regolato a 10 ° C. </li><li> Per la solubilizzazione delle membrane, diluire i microsomi con un volume uguale di tampone di solubilizzazione pertinente (Passo 1.3) per ottenere una concentrazione finale di detersivo2% (w / v) e una proteina microsomiale concentrazione 5 mg / ml. Incubare questa miscela per 1 ora a 4 ° C con agitazione (tubo rotatore). Conservare 200 ml per l&#39;analisi. </li><li> Centrifugare la miscela (100.000 xg, a 4 ° C, 45 min). Rimuovere il surnatante contenente le proteine ​​di membrana solubilizzate, passare attraverso un filtro a siringa da 0,45 micron e memorizzare sul ghiaccio. Misurare la fluorescenza del sovranatante (come al punto 2.8). </li><li> Risospendere frazione insolubile in 1% (w / v) di SDS per un volume corrispondente alla frazione solubile. Misurare la fluorescenza in questa frazione e mantenere una aliquota di 50 microlitri per l&#39;analisi SDS-PAGE. </li></ol> 4. Nickel-affinità Purificazione di CFTR <ol><li> Colonne collegamento due 5 ml di nichel sefarosio in serie. Lavare con 2 volumi di colonna (CV) 20% (v / v) etanolo, seguito da 2 CV DDH 2 O, poi lavare la colonna con 2 CV di tampone di solubilizzazione (Passo 1.4-1.5), contenente 1 M imidazolo. Ripetere con 2 CV di solubilization tampone privo di imidazolo. </li><li> Aggiungere imidazolo ad una concentrazione finale di 5 mM al materiale solubilizzato (Passo 2.8) e caricate manualmente il materiale sulla colonna o in un ciclo campione se si utilizza un dispositivo automatizzato di cromatografia liquida. </li><li> Caricare il materiale solubilizzato sulla colonna ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min, e lavare con 2 CV di tampone imidazolo-lacunoso a parità di portata per rimuovere materiale non legato. Raccogliere le frazioni in 50 ml provette Falcon. </li><li> Per il primo lavaggio, utilizzare 3 CV di tampone di purificazione con imidazolo 40 mM ad un flusso di 1 ml / min. Raccogliere 2 ml frazioni. </li><li> Per il secondo lavaggio, utilizzare 3 CV di tampone di purificazione con imidazolo 100 mM. Raccogliere 2 ml frazioni. </li><li> Eluire CFTR dalla colonna HisTrap con 3 CV di tampone depurazione mediante imidazolo 400 mm. Raccogliere 2 ml frazioni. </li><li> Controllo fluorescenza in frazioni eluite (Passo 2.8). </li><li> Conservare le aliquote di frazioni di punta per l&#39;analisi SDS-PAGE. Freeze flash restante picco fcampioni raction e conservare a -80 ° C, o continuano a purificazione prossimo passo. </li></ol> 5. Permeazione di gel Chromatography (GPC) Purificazione di CFTR <ol><li> Equilibrare la colonna (Superose 6 10/300 GL) con 1,2 CV DDH 2 O seguita da 1,2 tampone CV GPC. </li><li> Durante Fase 5.1, concentrare le Ni-affinità frazioni purificate con la massima fluorescenza GFP usando un filtro centrifugo 100.000 MWCO a 4 ° C. Se purificante in DDM, evitare di concentrare l&#39;esempio di sopra di una concentrazione proteica di 0,3 mg / ml di proteine ​​come questo causerà la perdita significativa del campione. Rimuovere il ritentato dal concentratore e centrifugare a 100.000 x g per 30 min a 4 ° C per sedimentare le particelle più grandi. </li><li> Iniettare il campione attraverso la colonna ed eluire con una pendenza isocratica di 1,2 CV buffer di GPC. Raccogliere 0,5 ml frazioni. </li><li> Misurare la fluorescenza GFP come nella sezione 2.8 di identificare quelle frazioni contenenti CFTR. Conservare un piccolo volume (ad es &lt;/ Em&gt; 50 microlitri) di ciascuno per analisi mediante SDS-PAGE. </li><li> Congelare le frazioni in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol> 6. Ricostituzione di CFTR <ol><li> Aggiungere lipidi (passo 1,8) al CFTR purificata ad lipide-to-proteina rapporto 100:1 (w / w) e incubare a 4 ° C per 1 ora. Analogamente impostare un controllo solo lipidi, sostituendo la proteina purificata con lo stesso volume di tampone GPC. </li><li> Rimuovere il detersivo dalla miscela di proteine ​​/ lipidi con perline adsorbenti idrofobiche. Lavare perline adsorbenti in 5 CV DDH 2 O, 5 CV 70% (v / v) etanolo, 5 CV DDH 2 O e 5 tampone CV GPC manca il detersivo. Aggiungere 200 mg di perline adsorbenti lavate per ml di proteina purificata e incubare a 4 ° C per una notte con agitazione. </li><li> Raccogliere il campione di ricostituzione delle perle adsorbenti in una nuova provetta utilizzando un puntale sottile-ended. </li></ol> 7. Misurazione della ATPasi attività <ol><li> Determinare il tasso di CFTATPasi attività specifica-R utilizzando un saggio modificato Chifflet 26,27 in un formato di piastra da 96 pozzetti. Con la soluzione stock di fosfato di sodio (0,65 mm) preparare 0-20 nmol fosfato in un volume finale di 50 microlitri come standard. Utilizzare una miscela 1:1 di tampone CFTR e tampone ATPasi per diluire il brodo fosfato. </li><li> Incubare sia CFTR ricostituito e liposomi bianco con 1:100 (v / v) gli inibitori ATPasi (Passo 1.9) in ghiaccio per 10 min. Utilizzare almeno 5 mg di CFTR ricostituito. </li><li> Aggiungere ATP (Passo 1.9) ad una concentrazione finale di 2 mM e incubare a 25 ° C per 1 ora. Arrestare la reazione aggiungendo 40 ml di 10% (w / v) di SDS (punto 1.9) a ciascun pozzetto (compresi gli standard). </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone A (punto 1.10) e incubare per 10 min. Aggiungere 100 microlitri tampone B (1,10) a ciascun pozzetto e misurare l&#39;assorbanza alla lunghezza d&#39;onda di 800 nm in un 96-ben UV / Vis spettrofotometro compatibile piastra. </li><li> Convertire assorbanza a 800 nm in una quantità di fosfato liberato usando l&#39;standard di fosfati. Calcolare il tasso di idrolisi dopo aver sottratto il segnale di fondo (liposomi solo pozzetti). </li><li> Per CFTR non ricostituito seguire lo stesso protocollo utilizzando tampone CFTR per le letture di fondo. </li></ol>

<ol>
	<li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+(ABCC7)+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel.">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li><li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK:+1947-2003.">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li><li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li><li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration.">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li><li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung.">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li><li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology:+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates.">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li><li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line.">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li><li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+of+MRP1+(ABCC1)+and+related+ATP-dependent+drug+transporters.">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li><li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li><li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis.">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li><li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter.">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li><li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter.">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li><li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate/tungstate+ABC+transporter.">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li><li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA:+Alternating+access+with+a+twist.">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li><li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter:+structure+and+allosteric+regulation.">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li><li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding.">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li><li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids.">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+functional+characterization,+and+NMR+studies+of+human+KCNE1,+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome.">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein:+Application+to+lens+ATPases.">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li><li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence.">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione né altri interessi in conflitto rispetto a questo lavoro.

Abbiamo precedentemente descritto un metodo per la sovraespressione di CFTR murino 14. Dopo la pubblicazione di tale protocollo, abbiamo espresso e purificato diversi ortologhi diversi di CFTR utilizzando lo stesso sistema. Tutti gli ortologhi testati finora purificati bene il detersivo GPL, mentre la purificazione DDM mostrato più variazione tra differenti ortologhi (dati non mostrati). Questa flessibilità illustra la forza dell&#39;approccio lievito: è possibile schermare molti costrutti con relativa rapidità al fine di selezionare uno per uno scopo particolare. Lavare i microsomi lievito con tampone contenente 1 M NaCl prima di solubilizzazione con i risultati DDM in una preparazione microsome più pulita e riduce gli agenti inquinanti in fasi successive. Questo passo è necessario nel protocollo GPL come campione CFTR finale è&gt; 90% puro senza lavaggio microsome. Inoltre, purificazione nel DDM richiede alcune modifiche ai buffer di solubilizzazione unnd purificazione, cioè l&#39;aggiunta di glicerolo oliva e sale. Insieme, queste aggiunte notevolmente aumentato il legame della proteina DDM-solubilizzato alla colonna. La metodologia purificazione DDM ha margini di miglioramento, in particolare alla rimozione di un importante contaminante 40 kDa che, giudicato mediante spettrometria di massa, è dovuto alla subunità ribosomiale L3 lievito, che sembra avere un&#39;affinità intrinseca per la resina nichel. Non c&#39;è polyHis evidente sequenza nella proteina L3, ma l&#39;esame della sua struttura 3D quando si lega al ribosoma (PDB = 1FFK) mostra che la subunità L3 piegato ha un potenziale polyHis cluster. Che questa band è meno problematica in materia GPL-purificato potrebbe essere dovuto al più duro detersivo GPL. Sebbene la purificazione nel DDM sembra essere più povera di quella a GPL, detergenti lievi come DDM può essere più compatibile con analisi funzionali e strutturali e sono già stati utilizzati in vari crystall X-raystudi radiografico delle proteine ​​di membrana 15-21. Inoltre, i nostri risultati hanno indicato che l&#39;uso del GPL porta alla perdita della funzione ATPasi in CFTR relativo alla purificazione in DDM. Quindi si consiglia il protocollo di purificazione a base di GPL per la generazione di CFTR dove la purezza è cruciale, per esempio in applicazioni come la caratterizzazione di modificazioni post-traduzionali, o nella generazione di anticorpi, il protocollo basato GPL-verrebbe scelto . D&#39;altra parte in applicazioni dove è essenziale l&#39;attività e stato completamente nativo della proteina, proponiamo il protocollo basato DDM-come una scelta migliore. Per concludere, questo protocollo descrive un metodo riproducibile per l&#39;isolamento di CFTR nella zwitterionici detersivo GPL-14 o il detergente non ionico DDM. Come tale indica una più ampia gamma di condizioni di depurazione per CFTR che precedentemente sono stati segnalati 10-13. Inoltre milligrammi quantità di CFTR purificata possono essereottenuti mediante questi procedimenti quando combinato con un sistema di crescita del lievito alto volume come un fermentatore 20 L e un sistema di raccolta di cellule di capacità elevata come una L 6 bassa velocità del rotore della centrifuga. Il CFTR ottenuto ha un tag GFP scindibile, che consente un facile monitoraggio della proteina in vari saggi biochimici e biofisici. Il reagente descritto in questo manoscritto (pollo plasmide-CFTR contenenti o cellule di lievito congelate) può essere ottenuto attraverso la Cystic Fibrosis Foundation (USA).

La fibrosi cistica (FC) è la malattia genetica più diffusa in Europa e Nord America, con un&#39;incidenza di circa 1 su 2.500 nati vivi. CF si verifica quando le mutazioni del regolatore transmembrana della fibrosi cistica conduttanza (CFTR) perdita di proteine ​​causa della sua funzione a livello della membrana plasmatica delle cellule epiteliali 1. La conseguenza più grave di questo difetto è un danno polmonare irreversibile, che riduce l&#39;aspettativa di vita dei malati a &lt;40 anni di 2,3 anni. CFTR è un ATP-binding cassette (ABC) trasportatore che si è evoluto per diventare un 1,4 canale ionico. Nonostante la sua funzione abbastanza alterato nella membrana plasmatica delle cellule, mantiene ancora una significativa omologia di sequenza con altri trasportatori ABC. Curiosamente, le parti specializzate di CFTR (cioè la sua regione regolatrice e il suo N-e C-terminali) non condividono rilevante somiglianza di sequenza con altri metazoi ABC trasportatori, quindi non ci sono indizi al secoloe le origini di queste sequenze in CFTR. Sulla base della sua struttura primaria, CFTR è classificato come un membro C-famiglia della famiglia trasportatore ABC, ma non vi è una forte evidenza di un legame funzionale residua a questa sottofamiglia. Ci sono state alcune segnalazioni di attività di trasporto glutatione per CFTR 5-7, che sarebbe coerente con i ruoli degli altri membri della famiglia C-8,9, anche se altri rapporti suggeriscono che il glutatione ridotto può inibire l&#39;attività di CFTR ATPasi, piuttosto che mostrare l&#39; substrato indotta da stimoli che caratterizzano i trasportatori ABC 10. Misurazione della conduttanza ionica è sufficientemente sensibile per consentire l&#39;attività del canale di singole molecole CFTR da studiare 1 e proprietà del canale CFTR è stata monitorata in funzione del tempo, temperatura, concentrazione di ATP, potenziale di membrana, e stato di fosforilazione, nonché nella presenza di una miriade di piccoli inibitori della molecola, potenziatori e modificatori. QuesteGli studi hanno anche aggiunto in modo significativo alla nostra conoscenza di come funzionano trasportatori ABC. Tuttavia, l&#39;espressione di CFTR in quantità significativa e la sua successiva purificazione ha dimostrato di essere particolarmente impegnativo e successo limitato a pochi laboratori 10-13. La necessità di sviluppare farmaci più efficaci è pressante, ma questo processo è stato ostacolato dalla mancanza di CFTR purificato per lo screening di piccole molecole. Risolvere il problema espressione CFTR e purificazione consentirebbe high-throughput screening di farmaci volti a correggere il difetto primario nella FC e sarebbe anche aprire un percorso per studi strutturali ad alta risoluzione per informare la progettazione razionale di farmaci. Inoltre, anche relativamente caratteristiche biochimiche fondamentali della proteina, come lo stato oligomerico funzionale, proteine ​​interagenti e ATPasi rimangono poco caratterizzati. Abbiamo precedentemente riportato un protocollo per l&#39;espressione su larga scala di GFP-e His-tag CFTR murinoin S. cerevisiae 14 e ora descrivere ulteriormente i protocolli per la purificazione della proteina CFTR. Abbiamo usato questi metodi per purificare cinque ortologhi di CFTR e dati presenti per la purificazione di CFTR pollo come esempio. La selezione di detergenti per solubilizzazione e purificazione è un passaggio fondamentale nella purificazione di qualsiasi proteina di membrana. Avendo a screening per la solubilità di CFTR in diversi detergenti, abbiamo scelto due contrastanti detergenti per uso nella purificazione. Dodecil-β-D-maltoside (DDM) è un detergente non ionico che è stato ampiamente utilizzato per entrambi gli studi strutturali e funzionali delle proteine ​​di membrana 15-21. Il detergente ionico 1-tetradecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerolo) (LPG-14) è molto efficace nella solubilizzazione di CFTR ed è stato precedentemente utilizzato nella purificazione di proteine ​​di membrana funzionali 10, 22,23, compreso purificazione della CFTR da S. cerevisiae 24. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:492px;" width="491">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;M syringe filter&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sartorius</td>
			<td style="width:161px;">FC121</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane)</td>
			<td style="width:115px;">Vivaspin</td>
			<td style="width:161px;">VS0641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">72.695</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40Ti rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;"><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Sterile Falcon Tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">62.547.254</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A26209&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid chromatography system</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28-4062-64</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A8456</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bead-beating cell disrupter</td>
			<td style="width:115px;">BioSpec</td>
			<td style="width:161px;">1107900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">HERMLE</td>
			<td style="width:161px;">Z300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5417R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop microfuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">13-100-511</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzamidine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">434760</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">114391</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">357000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">170-808</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chymostatin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C7268</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">43815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">E.coli total lipid extract</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">100500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">E3132</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass beads, acid washed</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8772</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">65017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap HP columns (5 ml)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5247-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapid Coomassie Stain</td>
			<td style="width:115px;">Novexin</td>
			<td style="width:161px;">ISB1L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge JA-17 rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">369691</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:115px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">108975</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG)</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">858120</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO4</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel tank SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">165-8006</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">n-dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:115px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:161px;">D310S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S6191</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NaN3</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9434</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">75351</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">392050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prestained protein standards</td>
			<td style="width:115px;">Fermentas</td>
			<td style="width:161px;">SM1811</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Desalting columns (Sephadex G-25)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-0851-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin A</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P4265</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P7626</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sch28080</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S4443</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">L37771</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium thiocyanate (NaSCN)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">251410&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel filtration 10/300 GL column</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5172-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-base</td>
			<td style="width:115px;">Formedium</td>
			<td style="width:161px;">TRIS01</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">355618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:115px;">Star Labs</td>
			<td style="width:161px;">N2400-0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:115px;">Ultrawave</td>
			<td>F0002202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode plate reader</td>
			<td style="width:115px;">BioTek</td>
			<td style="width:161px;">BTH1MF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein expressed in saccharomyces cerevisiae

Difetti nel regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) proteine ​​causano fibrosi cistica (CF), una malattia autosomica recessiva che limita l&#39;aspettativa media di vita dei malati a &lt;40 anni di età. Lo sviluppo di molecole di farmaci innovativi per ripristinare l&#39;attività di CFTR è un obiettivo importante nel CF trattamento, e l&#39;isolamento di CFTR funzionalmente attivo è un utile passo verso il raggiungimento di questo obiettivo. Descriviamo due metodi per la purificazione di CFTR da un sistema di espressione eterologo eucariotico, S. cerevisiae. Come sistemi procariotici, S. cerevisiae può essere rapidamente coltivata in laboratorio a basso costo, ma può anche traffico e posttranslationally modificare grandi proteine ​​di membrana. La selezione di detergenti per solubilizzazione e purificazione è un passaggio fondamentale nella purificazione di qualsiasi proteina di membrana. Dopo aver proiettato per la solubilità di CFTR in diversi detergenti, abbiamo scelto due contrasting detergenti per uso nella purificazione che permette la preparazione finale CFTR venga adattata agli esperimenti successivamente pianificati. In questo metodo, forniamo confronto della purificazione di CFTR in dodecil-β-D-maltoside (DDM) e 1-tetradecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerolo) (LPG-14). Proteina purificata in DDM con questo metodo mostra ATPasi in saggi funzionali. Proteina purificata in GPL-14 mostra elevata purezza e resa, possono essere utilizzati per studiare le modificazioni post-traduzionali, e può essere utilizzato per i metodi strutturali come piccolo angolo X-ray scattering e microscopia elettronica. Tuttavia visualizza ATPasi notevolmente inferiore.

Il protocollo descritto sopra è un mezzo efficace per isolare microsomi CFTR arricchito, con quasi totale recupero del CFTR durante la rottura delle cellule e la preparazione dei microsomi greggi (Figura 1). Altri metodi di rottura delle cellule possono anche essere impiegati efficacemente. Abbiamo utilizzato una cella francese pressione, e altri dispositivi high-pressure/cavitation (anche in combinazione con un impatto contro un bersaglio rubino) con uguale efficienza. Per comodità e basso costo iniziale delle attrezzature, troviamo il metodo bead-battere i migliori. Utilizzo di GPL per solubilizzare e purificare proteine ​​CFTR prodotto 80 ug / L coltura a&gt; 90% di purezza (Figura 2). L&#39;alto rendimento è dovuto alla solubilizzazione efficiente di CFTR GPL (confronta Figura 2b, corsie 2 e 4). Inoltre, efficiente e stretto legame alla colonna provocato minima perdita di CFTR della frazione non legata e l&#39;assenza di CFTR nelle frazioni di lavaggio (figura 2, corsie 3, 5, e6). La proteina eluita aveva una purezza&gt; 90%, stimato da Coomassie macchiati gel SDS-PAGE e utilizzando densitometria del CFTR e bande contaminanti. Cromatografia a permeazione di gel (GPC) separato GPL-CFTR purificato da contaminanti a basso peso molecolare (Figura 4, pannello inferiore). Il protocollo di purificazione CFTR utilizzando DDM dà purezza di circa il 60% e la resa di circa 50 mg / L (Figura 3). La microscopia elettronica (EM) di frazioni colorate negativamente dalla GPC eluizione a circa 10 ml (Figura 4) ha mostrato che CFTR DDM-purificato contiene aggregati di diametro 20-30 nm e le particelle più piccole di 10 nm di diametro (dati non mostrati). E &#39;possibile che i piccoli aggregati possono reversibilmente associare e dissociare come ultrafiltrazione con un filtro cut-off 1 MDa omesso di rimuovere gli aggregati EM-rilevabili. Materiale LPG-purificato non assorbire a una griglia incandescente scaricata, quindi è stato studiato da Cryo-EM delle frazioni non colorati. Questo ha dimostratouna popolazione molto omogenea delle particelle di una dimensione relativamente piccola (6-8 nm di diametro, dati non mostrati). Infine, l&#39;attività ATPasi delle proteine ​​purificate è stata misurata (Figura 5). Come membro della famiglia delle proteine ​​ABC, CFTR ha due domini nucleotide-binding (NBDS) in grado di legare e / o idrolisi dell&#39;ATP. I dati indicano che la proteina purificata non era in grado di idrolizzare ATP nello stato GPL-solubilizzato e ha mostrato attività ATPasi debole in presenza di DDM (Figura 5, bar vacanti). Dopo l&#39;aggiunta di lipidi e rimozione detersivo, ATPasi è 4 volte maggiore per campioni che erano stati purificati in DDM (13 nmol ATP / min / mg di proteina). L&#39;aggiunta di lipidi e rimozione di GPL attività simile ripristinato CFTR che era stato isolato utilizzando GPL, ma con un tasso inferiore finale (1,5 nmol ATP / min / mg proteina) rispetto al materiale DDM purificato e ricostituito. <img alt="Figura 1"fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Livelli di monitoraggio di CFTR pollo in lisato cellulare (CL), surnatanti (S) e pellets (P) durante varie fasi di centrifugazione utilizzati per l&#39;isolamento microsome e lavaggio. Gel SDS-PAGE sono state visualizzate utilizzando la fluorescenza in-gel della GFP tag. Il surnatante dopo la rottura delle cellule e centrifugazione a 14.000 xg contiene praticamente tutto il CFTR (compresi i prodotti di degradazione). Ultracentrifugazione a 200.000 xg sedimenti tutto il full-length CFTR lasciando alcuni frammenti nel supernatante. Ultracentrifugazione a 100.000 xg di sale lavato microsomi pellets quasi tutto il CFTR con la rimozione di alcune ulteriori frammenti. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> Figura 2. Purificazione di CFTR pollo in GPL mediante cromatografia di affinità ione metallo immobilizzato. Frazioni sono state analizzate mediante SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie (pannello superiore) e rivelazione per fluorescenza del tag GFP (pannello inferiore). Tracks: (1) microsomi. (2) microsomi GPL-solubilizzati. (3) Il materiale non legato. (4) Il materiale insolubile. (5) e (6) 40 e 100 mM imidazolo lavaggi. (7) Materiale eluita con imidazolo 400 mM. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> Figura 3. Purificazione di CFTR pollo in DDM mediante cromatografia di affinità ione metallo immobilizzato. Frazioni sono state analizzate mediante SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie. Il pannello a sinistra mostra le frazioni prima di eluizione. Più frazioni di eluizione consecutivi sono mostrati nel pannello a destra con CFTR inindicato da freccia. Frazioni successive sono arricchiti in un contaminante 40 kDa, che è stato identificato mediante spettrometria di massa come proteina ribosomiale L3. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> Figura 4. Purificazione di CFTR pollo mediante cromatografia a permeazione di gel. CFTR purificato mediante cromatografia Ni-affinità è stata concentrata e applicata a una colonna GPC. Il profilo di eluizione per CFTR (pannello superiore) purificato in tampone contenente GPL-14 (linea continua) o DDM (linea tratteggiata) sono sovrapposti. SDS-PAGE (pannello inferiore) ha rivelato che CFTR eluito tra 8 e 11 ml. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> Figura 5. ATPasi activitY di frazioni purificate CFTR pollo. proteina purificata in DDM o GPL è stata saggiata usando un saggio modificato Chifflet 26 in presenza di un cocktail di inibitori ATPasi di eliminare qualsiasi sfondo ATPasi da F-, P-e V-ATPasi di tipo (bar vacanti ). Il tasso di idrolisi dell&#39;ATP è stata misurata anche dopo la rimozione del detersivo e l&#39;aggiunta di lipidi (barre piene). Il grafico mostra la media e la deviazione standard (n = 3). Le differenze tra i valori medi per ATPasi in presenza e assenza di lipidi, e differenza tra attività DDM e GPL sono significativi per p &lt;0,05.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Espressione eterologa e purificazione del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) sono sfide importanti e fattori limitanti per lo sviluppo di terapie farmacologiche per la fibrosi cistica. Questo protocollo descrive due metodi per l&#39;isolamento di quantitativi milligrammo di CFTR adatti per studi funzionali e strutturali.

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance-regulator

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

14.4K Views.  University of Manchester.  Espressione eterologa e purificazione del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) sono sfide importanti e fattori limitanti per lo sviluppo di terapie farmacologiche per la fibrosi cistica. Questo protocollo descrive due metodi per l'isolamento di quantitativi milligrammo di CFTR adatti per studi funzionali e strutturali. 

Video: Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Ricerca

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR monitorata Redox Titolazione dei cofattori di<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...