Gli autori ringraziano Chris Chartrand, HT (ASCP) per dimostrare la sezione di taglio del blocco cella con indicatore AV.

Introduzione: Questo è un video che descrive il metodo Shidham per la preparazione del blocco delle cellule da liquido a base di citologia (LBC) campione usando HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Rispetto ad altri approcci casuali, i seguenti sono le due caratteristiche fondamentali di questo protocollo per la preparazione di blocchi di celle da campioni relativamente ipocellulare singolarmente con cellule sparse sciolti (1-5). <ol><li> Questo protocollo prevede passi per concentrare le cellule lungo il piano parallelo alla superficie di taglio del blocco di celle. </li><li> Esso include anche un faro, quali l&#39;inserimento oscuro della AV-marker (Figura 1b), che serve due delle seguenti finalità: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Per visualizzare il livello al quale si concentrano le cellule. L&#39;area del blocco di celle con le cellule di interesse ora possono essere visualizzate dal histotechnologist quando il faro di colore scuro è esposto durante il taglio. Questa capacità di monitorare impedirvi dal taglio attraverso il livello con la maggior parte delle cellule, o non tagliare troppo superficiale nel livello con più alta concentrazione di cellule del campione. </li><li> Per servire come punto di riferimento localizzatore nella sezione seriale blocco di celle su diverse diapositive. Questo punto di riferimento agisce come un faro per aiutare a localizzare le cellule o gruppi di cellule per la valutazione di un modello di immunoreattività coordinare con l&#39;approccio SCIP (6,7). </li></ol></li></ol> PROTOCOLLO (Figura 2) Preparazione del campione. <ol><li> Trasferire il residuo LBC campione citologia cervicale ad un tubo di vetro piano inferiore (15mm x 45mm di diametro) (Figura 2.1 a 2.4). Posizionare il tubo di vetro in un tubo di plastica più grandi carrier (28 x 85 millimetri) e centrifugare. Rimuovere il tubo fondo di vetro dal tubo portante e versare il sopranatante. </li><li> Il tubo di vetro viene poi ridotta (per evitare la fuoriuscita di acqua di riscaldamento nel passaggio successivo) e rimesso all&#39;interno di un più ampio piatto tubo di plastica vettore fondo </li><li> Il tubo di plastica vettore contenente il tubo di vetro sono state limitate, posto in una centrifuga (con coppe girevole e non tazze angolo fisso in modo che le cellule cadono perpendicolarmente al fondo piatto del tubo di vetro), e mi sono girato a 1805 g (3000 rpm, rotore raggio-17cm) per cinque minuti (Figura 2.5). </li><li> I tubi vengono poi rimossi verticalmente dalla centrifuga e il tubo di vetro più piccolo viene rimosso con una pinza dal tubo portante più grandi di plastica senza disturbare il pellet sedimentato con le cellule. </li><li> Il tubo di vetro con il campione è non ridotti e il sopranatante è versata via facendo attenzione a non disturbare lo strato di cellule piatte sedimento sul fondo (Figura 2.6). </li></ol> Inserimento delle coordinate di riferimento AV-marker e l&#39;aggiunta di gel <ol><li> Un faro scuro AV-marker (circa 2 mm x 2 mm di diametro, superficie piana, frammento di colore scuro, materiale sezionabili) (Figura 3) si aggiunge come indicatore di percorso per il tubo di vetro (Figura 2.7). </li><li> Liquefare una aliquota di HG dalla fusione in forno a microonde per 10 secondi a media potenza. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di HG fuso al mix tubo, con il sedimento in fretta, e ricapitolare (Figura 2.8) (Procedere alla fase successiva in fretta senza che il HG per iniziare la solidificazione). </li><li> Aggiungere circa 2,5 ml di caldo (45 ° C) per il tubo di plastica vettore (Figura 2.9). </li><li> Il tubo più piccolo di vetro con tappo viene inserito all&#39;interno del tubo di plastica con acqua calda. (Questo passaggio è necessario per mantenere il HG dalla solidificazione durante le fasi successive) (Figura 2.9). </li><li> Il tubo di plastica vettore è posizionato nella centrifuga (con coppe girevole e non tazze angolo fisso in modo che le cellule cadono perpendicolarmente al fondo piatto del tubo di vetro), e mi sono girato a 1805 g (3000 rpm, raggio di 17 centimetri-rotore) per cinque minuti. Lo scopo di questa fase di centrifugazione è quello di spingere l&#39;AV-marker e di concentrare le cellule in uno strato più vicino alla superficie di taglio della finale blocco di celle paraffina (Figura 1d). </li><li> I tubi vengono poi rimossi con delicatezza e verticalmente dalla centrifuga facendo attenzione a non disturbare il sottile strato sedimentato con le cellule del campione in basso. </li><li> Il tubo di plastica più grande è non ridotti e il tubo di vetro più piccolo viene rimosso verticalmente da una pinza senza disturbare lo strato di sedimento di cellule campione. </li><li> Il piccolo tubo di vetro viene refrigerato in posizione verticale per 15 minuti per raffreddare e solidificare la HG (Figura 2.11). </li></ol> La rimozione del blocco di celle come un pulsante di gel con il campione per l&#39;elaborazione finale <ol><li> Il disco HG solidificato, con lo strato di concentrato / sedimento del campione in basso è staccata dal tubo di vetro piano inferiore da spruzzando formalina al 10% attraverso un ago 23 gauge con la siringa (Figura 2.12). </li><li> L&#39;ago viene inserito lungo il lato del tubo alla periferia del disco solidificato HG con il campione (Figura 2.12). </li><li> Il needle viene ruotato lungo il lato del tubo mentre formalina sta lentamente spinto attraverso la siringa. Il risultato è la separazione del pulsante HG insieme a faro di colore scuro AV-marker e il campione concentrato in essa dal fondo piatto del tubo di vetro (Figura 2.12). </li><li> Il blocco di celle (tasto gel con le cellule del campione) è poi messo in una cassetta etichettati e presentati per la lavorazione dei tessuti per preparare blocchi di celle paraffina (Figura 2.13). </li></ol> Incorporare e il taglio del campione <ol><li> Il disco è incluso in paraffina con il lato oscuro marcatore faro giù come superficie di taglio (Figura 1). </li><li> Il blocco viene sezionato fino a quando il colore scuro AV-marker come un faro è esposta e ben visibile. </li><li> Da tre a quattro sezioni micron vengono tagliate da questo livello che dovrebbe contenere la maggior parte delle cellule singolarmente disperse dal campione. </li><li> Le sezioni sono raccolte sul vetrino per la colorazione ulteriormente, immunoistochimica, o altri test come indicato. I protocolli per questi test tra cui il tipo di diapositive da utilizzare per il montaggio delle sezioni possono variare. Generalmente per immunostaining, vetrini rivestiti sono utilizzati per prevenire la perdita di galleggiamento e sezioni dal diapositive durante le fasi immunocolorazione. </li></ol> Abbreviazioni utilizzate (in ordine alfabetico): CISH, cromogenico in situ test di ibridazione, PESCE, fluorescente in situ test di ibridazione; FFPE, fissate in formalina e inclusi in paraffina, FNA, agoaspirato, HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, citologia in fase liquida; reazione a catena della polimerasi PCR; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. La struttura del blocco di celle preparato dal protocollo di Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. La sintesi delle diverse fasi per la preparazione di blocco di celle da un campione LBC dal protocollo di Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Preparazione di AV-marker da bucce di banana. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="figura 4" /> Figura 4. Confronto di blocchi di celle e sezioni con e senza AV-marker. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="figura 5" /> Figura 5. Confronto di cellularità sezioni di blocco di celle con e senza AV-marker.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

Blocchi di cellule rappresentano un prezioso strumento per la valutazione dei campioni citologici vari (1). Ancora più importante, oltre ai particolari architettonici del campione, blocchi di celle permettere una valutazione degli studi di accessori, quali immunocitochimica, fluorescente / cromogenico in prove di ibridazione in situ (FISH / CISH) e in situ PCR. Una varietà di metodi per la preparazione del blocco di celle sono descritti. Tuttavia, la maggior parte di questi sono adatti per i non-ginecologica campioni citologici che contengono le cellule relativamente molti e con microfragments tissutale, come nel aspirati FNA e alcuni fluidi sierosi come effusioni (1,3,4,5). Perché blocchi di celle principalmente offrono l&#39;opportunità per la valutazione immunocitochimica, al loro trattamento dovrebbe preferibilmente essere simile a quello della paraffina fissati in formalina-embedded (FFPE) tessuti. In definitiva i risultati ottenuti dopo la valutazione immunocitochimica delle sezioni blocco di celle vengono confrontati con quelli con la letteratura pubblicata effettuato prevalentemente su sezioni di tessuto FFPE. Qualsiasi modifica nel protocollo potenzialmente compromesso e annullare la validità dei risultati ottenuti sui blocchi di celle trattati attraverso fissativi diversi e sequenze di reagenti diversi da quelli utilizzati per FFPE di routine. Alcune tecniche commerciali può avere l&#39;inconveniente di elaborazione attraverso un protocollo di esposizione ad altri fissativo-reagente esposizione. Vari metodi di preparazione delle cellule di blocco sono disponibili per i campioni con una quantità significativa di sedimenti e frammenti di tessuto. Principalmente, i sedimenti concentrato sono supportate da alcuni gel o principio della coagulazione. Il pulsante maneggevole è poi inclusi in paraffina dopo l&#39;elaborazione, come i campioni di patologia chirurgica / biopsie. I gel utilizzati includono gelatina, agar, fibrinogeno / plasma-trombina, e altri gel commerciali come HG. I metodi di concentrazione varia da cubettatura semplice dei sedimenti per centrifugazione della concentrazione di cellule lungo i vari tipi di membrane. Gli esempi includono: Milipore, collodin (celloidina) borse o raschiare le cellule dalla prelievi citologici su vetrini (1). Abbiamo anche valutato una serie di gel provando diverse combinazioni di agar e gelatina. Nessuna delle combinazioni raggiunto la consistenza sufficiente all&#39;azienda di ottenere un disco facilmente manovrabile di gel solidificato con cellule incorporato dal campione in un unico pezzo. HG ha dimostrato coerenza appropriato e nella nostra esperienza i risultati immunostaining su sezioni di cellule HG blocco sono stati eccellenti. Liquido a base di citologia (LBC) i campioni per la citologia cervico-vaginali sono generalmente meno cellulari rispetto ai non-ginecologiche i campioni di cui sopra. Inoltre, i campioni LBC ginecologico prevalentemente contenere singoli sparsi cellule di esfoliazione superficiale di mucosa cervico-vaginali. A causa di questo, cellularità appropriata nelle sezioni bloccare la cella non può essere raggiunto senza un approccio particolare. Poiché questi singolarmente disperse componenti cellulari nel blocco non può essere visto dal histotechnologist durante il taglio sezione, il livello al quale le cellule iniziano ad apparire in sezioni non può essere apprezzato e può perdere, sia per il taglio oltre il livello con la maggior parte delle cellule o no taglio abbastanza in profondità nel livello con più alta concentrazione di cellule del campione (Figura 4). Protocollo Shidham affronta entrambi questi problemi utilizzando HG come incorporare attrezzature di laboratorio di media e convenzionale (2) (Figura 2). Questo protocollo prevede le seguenti due caratteristiche principali (Figura 1): <ol><li> Concentrazione e l&#39;allineamento dei singolarmente cellule sparse in un piano stretto adiacente e parallela alla superficie di taglio del blocco di celle (Figura 5). </li><li> L&#39;inclusione di un faro simil-AV-scuro come un cartello indicatore. Questo è fondamentale per ottenere le seguenti caratteristiche: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Identificare e monitorare il livello al quale si concentrano le cellule nel blocco celle. L&#39;esposizione del cartello di colore scuro mette in evidenza il livello al quale ci si aspetta la maggior parte delle cellule singolarmente sparsi nel blocco delle celle di trovarsi (Figura 4). In questo modo il sovrataglio (taglio oltre il livello con la maggior parte delle cellule) o inferiori (non tagliare abbastanza in profondità nel livello con più alta concentrazione di cellule campione) per il blocco delle cellule e permettono la selezione delle sezioni dal livello nel blocco cella corrispondente con la massima concentrazione delle cellule. </li><li> Il cartello di colore scuro in sezioni serve anche come punto di riferimento di indagine e di identificare esattamente le stesse cellule in diverse sezioni di serie del blocco di celle su diapositive diverse (Figura 4). Questo è fondamentale, mentre interpretare e valutare le proprietà coordinare immunoprofile tali cellule particolare l&#39;approccio SCIP a seguire le stesse cellule in diverse sezioni (6,7). </li></ol></li></ol> Sebbene our protocollo è standardizzato e riportato per i campioni di liquido a base di citologia cervicale, ma può anche essere utilizzata per migliorare resa diagnostica di molti altri non-ginecologiche esemplari, come i fluidi effusione, FNA, brushings, contenuti cisti ecc Inoltre il marcatore AV faciliterebbe una migliore applicazione di approccio SCIP durante la valutazione immunoistochimica di sezioni blocco di celle di questi esemplari. Il mezzo di inclusione può essere sostituito da altri reagenti con le opportune modifiche a passi rilevanti. HG può essere sostituito da plasma (fibrinogeno) da gelificato con trombina a temperatura ambiente (1).

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

Questo video dimostra metodo Shidham per la preparazione di blocchi di celle da campioni di liquido a base di citologia cervico-vaginali contenenti cellule individuali e gruppi sparsi a piccole cellule. Questa tecnica utilizza HistoGel (Thermo Scientific) con attrezzature di laboratorio convenzionali. L&#39;uso di sezioni di blocco cellulare è uno strumento prezioso accessorio per la valutazione della non-ginecologiche citologia. Esse permettono di studiare citopatologo ulteriori dettagli morfologici campione compresa l&#39;architettura della lesione. Più importante, consentono per la valutazione degli studi ancillari, quali immunocitochimica, in prove di ibridazione in situ (FISH / CISH) e in situ di reazione a catena della polimerasi (PCR). Tradizionali tecniche di preparazione delle cellule blocco sono stati per lo più applicate ai vettori non ginecologica campioni citologici, di solito per effusioni liquidi corporei e aspirazione con ago sottile biopsie. I campioni di liquido a base cervico-vaginali sono relativamente meno rispetto ai loro cellulari non-ginecologica controparti con molte singole celle sparse. Per questo motivo, cellularità adeguata all&#39;interno delle sezioni blocco di celle è difficile da raggiungere. Inoltre, il histotechnologist sezionamento del blocco non è possibile visualizzare il livello al quale le cellule sono a più alta concentrazione. Pertanto, è difficile monitorare il livello appropriato in cui le sezioni possono essere selezionati per essere trasferito al vetrini per il test. Di conseguenza, l&#39;area del blocco di celle con le cellule di interesse può mancare, sia per il taglio del passato o non taglio abbastanza profondo. Attuale protocollo per il metodo Shidham affronta questi temi. Anche se questo protocollo è standardizzato e riportato per ginecologiche campioni citologici liquido a base, può essere applicato anche ai non-ginecologiche esemplari, come i fluidi effusione, FNA, brushings, cisti ecc contenuti per una migliore qualità del materiale diagnostico nelle sezioni blocco di celle.

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Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Shidham metodo per la preparazione di blocchi di celle con AV-marker da campioni citologici contenenti cellule individuali e gruppi sparsi a piccole cellule.

Cellule preparazione del blocco da campioni Citologia con predominanza di cellule sparse individualmente

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

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Biology

73.2K Views.  University of Wisconsin - Milwaukee. Shidham metodo per la preparazione di blocchi di celle con AV-marker da campioni citologici contenenti cellule individuali e gruppi sparsi a piccole cellule.

Video: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

Le cellule umane ES: Cultura partire da cellule congelate

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

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Biologia

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Preparazione di Single-Cell Sospensioni da Spleen mouse con il dissociatore gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Preparazione di Qualità pirofosfati Inositolo

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...