Questa ricerca ha ricevuto il sostegno del Progetto QNano http://www.qnano-ri.eu che è finanziato dalle infrastrutture di ricerca della Comunità Europea nell&#39;ambito del programma Capacità del 7 ° PQ (Grant No. INFRA-2010-262163). Ringraziamo anche il consiglio di ricerca Formas per il sostegno finanziario.

NOTA: tutti i parametri indicati nel presente protocollo sono validi per gli strumenti ei modelli qui indicati. Alcuni di questi parametri (contrassegnati con * nel testo) possono variare se si utilizza un altro fabbricante o il modello. 1. Start-up del FIB / SEM <ol><li> Montare il nanomanipulator freddo custom-built (NM) punta senza associare le trecce Cu al anticontaminator (AC). Invece assicurarsi che le trecce sono collegate al resto della NM sopra del punto di isolante per impedire carica durante la fase di affilatura (1.2). <ol><li> Chiudere la camera di SEM, pompa ad alto vuoto e l&#39;immagine della punta NM. </li><li> Se la punta è smussata, piegato o contaminata dall&#39;uso precedente, affinare mediante il fascio di ioni: selezionare motivi fresatura poligonali lungo i lati della punta, in modo che dopo la fresatura, la punta si cono fino a 1 micron o meno. </li><li> Una volta che i lati della punta sono stati fresati distanza, ruotare manualmente di 90 ° l&#39;intera asta NMdall&#39;esterno della camera di SEM. </li><li> Regolare le sagome di fresatura poligonali di adattarsi alla punta ruotato e ripetere fresatura da una diversa angolazione. </li></ol></li><li> Una volta che la punta è stata affilata per essere inferiore a 1 micron, ritrarre il NM e inserire l&#39;ago del sistema di iniezione del gas (GIS); riposizionare l&#39;ago di essere a circa 1 mm sopra la distanza di lavoro (invece del solito 175 micron). </li><li> Se si utilizza un precursore Pt, modificare la temperatura di esercizio a 24-26 ° C (invece dei soliti 40 ° C). Sono necessari questi passaggi per crio-deposizione 13 del Pt. </li><li> Aprire la camera di SEM e preparare il FIB / SEM per crio-mode montando il palco del campione crio e l&#39;aria condizionata. </li><li> Passare il NM in posizione inserito e collegare le sue trecce Cu all&#39;AC. Assicurarsi di non toccare accidentalmente la punta NM. Il sistema viene raffreddato con l&#39;NM inserito per assicurarsi che la perdita di flessibilità della treccia Cu a temperature criogeniche non ostacolare il movimento NMmento. </li><li> Spurgare i tubi per il raffreddamento con azoto secco per qualche minuto. </li><li> Pompare la camera di preparazione crio e la principale camera del campione per alto vuoto. </li><li> Aggiungere azoto liquido per le Dewars raffreddare entrambe le camere. Attendere fino al raggiungimento della temperatura desiderata. </li></ol> 2. Congelamento del campione <ol><li><ol><li> Montare due griglie TEM per i campioni FIB sul supporto di trasferimento SEM. Fissarli serrando le corrispondenti viti con un cacciavite. </li><li> Montare un campione stub appropriato per il campione e aggiungere una parte del campione. A seconda del tipo di campione, il campione può essere fissato con colla criogenico o con un morsetto. Utilizzare gli importi piccoli quanto possibile per garantire il congelamento ottimale. </li><li> Montare il supporto di trasferimento SEM sul dispositivo di trasferimento a vuoto (VTD). </li></ol></li><li><ol><li> Aggiungi azoto liquido nella stazione slushing e pompa giù per ottenere granita di azoto. </li><li> Aprire la slStazione ushing e tuffo-congelare il titolare di trasferimento SEM. Pompare giù di nuovo fino a ebollizione è completato e fango si ottiene di nuovo. Va notato che un etano o propano granite o congelamento ad alta pressione sono tecniche più adatte per ottenere la vetrificazione del campione. </li></ol></li><li><ol><li> Ritrarre il supporto di trasferimento SEM nella camera a vuoto del VTD e sigillarla. </li><li> Vent la stazione slushing e la crio camera stagna camera di preparazione. </li><li> Far corrispondere il sigillo VTD con la camera di compensazione della camera di preparazione crio e la pompa. </li><li> Quando un buon livello di vuoto viene raggiunto, innestare il perno di camera di compensazione per aprire il sigillo del VTD e la camera di equilibrio esterno; inserire il supporto di trasferimento SEM. Ci sono indicazioni sui contatti striscianti nelle camere di preparazione indicano la posizione del campione per sputtering e fratturazione. </li></ol></li><li> Se necessario, il campione può essere: fratturato con il coltello freddo; sublimata impostando una temperatura più alta (solitamente -1006, C); rivestito con Au / Pd o Pt mediante il sputterer freddo (300 V, 10 mA, 60 sec per un 2-3 nm tappo Au / Pd) *. Sublimazione non deve essere usato per i campioni vetrificati per evitare la loro ricristallizzazione. </li><li><ol><li> Usare il coltello freddo per aprire i coperchi di protezione degli slot della griglia TEM. </li><li> Portare la fase fredda nella camera del campione all&#39;altezza ricevente (16 mm *). </li><li> Spegnere l&#39;HT sul FIB / SEM e aprire la camera di equilibrio interiore. </li><li> Utilizzare il VTD per trasferire il titolare SEM nell&#39;apposita camera. Oscuramento l&#39;illuminazione nella stanza può aiutare in questo passaggio. </li><li> Il vano SEM è in fase di freddo, disinnestare la VTD premendo e ruotando. </li><li> Ritrarre l&#39;asta VTD fino in camera a vuoto VTD e chiudere la camera di equilibrio interiore, la camera di compensazione esterna e la guarnizione VTD. La camera di equilibrio esterno può ora essere scaricata per rimuovere il sigillo VTD. Questo ultimo passaggio non è obbligatorio, ma è consigliato come l&#39;asta VTD può essere facilmente sloggiato da incidenti, che possono causare dannial VTD o la camera di equilibrio. </li></ol></li></ol> 3. Fresatura Ion <ol><li> Accendere l&#39;alta tensione su entrambe le colonne e impostare i parametri di imaging appropriati (tensione di accelerazione: 10 kV per il fascio di elettroni, 30 kV per il fascio di ioni; dimensioni posto: 3; distanza di lavoro: 5 millimetri, attuali fascio ionico: 10-100 pA per l&#39;imaging, 1-3 nA per la fresatura) *. </li><li> Utilizzare il fascio di elettroni per trovare una caratteristica di interesse e per acquisire immagini per documentare lo stato del campione prima dell&#39;estrazione della lamella. </li><li> Una volta identificato una regione di interesse (ROI) per l&#39;estrazione, segnare da fascio ionico patterning, a meno che la topografia del campione stesso permette una facile identificazione del ROI anche dopo Pt deposizione. Per una maggiore precisione, utilizzare il metodo descritto da Pettersson et al. 14 Le marcature devono essere profonda, ampia e abbastanza lontano da essere ancora visibile dopo essere stato coperto dalla deposizione crio-Pt (che è non-selcace e coprirà diversi mm 2 della superficie del campione). </li><li> Riscaldare il gas precursore di 24-26 ° C e inserire l&#39;ago GIS ad una altezza di circa 1 mm al di sopra della superficie del campione (vedi anche punto 1.3). </li><li> Mentre l&#39;imaging con il fascio di elettroni, aprire la valvola del gas per alcuni secondi. Il tasso di crio-Pt deposizione è 100-500 nm / sec o più, a seconda della distanza dell&#39;ago GIS, la rugosità campione e sistema dell&#39;utente. È consigliabile eseguire alcune deposizioni di prova per determinare i parametri ottimali. </li><li> La prima crio-Pt deposizione è molto agitato e disomogeneo. Curare il deposito sul ROI utilizzando un fascio di ioni di 1.000 pA a basso ingrandimento (per esempio 2.000 X). A differenza della deposizione crio, questo indurimento è sito selettiva e deve essere eseguita solo sul ROI. Lo scopo di questa prima crio-deposizione è proteggere la superficie del campione da danni fascio di ioni e di ridurre curtaining durante ione assottigliamento 13. </li><li> Inclinare il campione52 ° in modo che la superficie è perpendicolare al fascio di ioni. Mill distanza di due trincee a schiera su entrambi i lati del ROI. Dimensioni tipiche per le trincee sono 20-30 micron di direzione (X) parallelo alla lamella da estrarre, 10-15 micron in direzione perpendicolare (Y) e con una variabile, pendenza profondità (Z), con il punto più profondo vicino alla ROI. La pendenza deve essere 45-55 °. In alcuni strumenti, trincee a schiera possono essere fresati solo con il punto più profondo sulla parte superiore. In tal caso, un mulino sotto la ROI, quindi ruotare l&#39;immagine di 180 ° e il mulino secondo sull&#39;altro lato. La profondità di fresatura può essere selezionato se il tasso di polverizzazione del materiale è noto. Per la maggior parte campione congelato-idratato, il tasso sputter di ghiaccio può essere utilizzato 7. </li><li> Inclinare il campione torna a 0 ° e utilizzare il fascio di ioni di tagliare via i lati e la parte inferiore della lamella, assicurandosi che i segni di taglio passare attraverso l&#39;intero lamella (dovrebbero lasciare segni di fresatura sul mulino pendii terrazzatiDE al passaggio precedente). Lasciare solo due piccoli ponti che collegano la lamella al resto del campione. </li><li> Inserire l&#39;ago GIS (puo &#39;spostare leggermente il campione). Manovrare la NM finché la punta è in contatto fisico con la lamella, preferibilmente sul lato. Assicurarsi che il NM non ostruisca la vista del fascio ionico due piccoli ponti di collegamento. </li><li><ol><li> Aprire la valvola GIS per pochi secondi e monitorare la deposizione crio da imaging continuo con il fascio di elettroni. </li><li> Quando un ulteriore strato di 1-2 micron di Pt è stato crio-depositato, chiudere la valvola. </li><li> Curare il Pt (vedi passo 2.6) solo in pochi micron intorno al punto in cui il NM è in contatto con la lamella. </li><li> Utilizzare una corrente elevata fascio di ioni di tagliare la lamella libera. I due ponti di collegamento devono essere fresati distanza, nonché qualsiasi eccesso di Pt che possono essersi formate nuovi punti di contatto tra le lamelle e il resto del campione. Non ritrarre ancora l&#39;ago GIS. </li></ol></li&gt; <li> Manovrare con cautela la NM per estrarre la lamella dalle trincee e spostarlo almeno 500 micron sopra la superficie del campione. Solo dopo questa fase, retrarre l&#39;ago GIS. </li><li> Abbassare la fase del campione di pochi mm e portarlo a una delle griglie TEM è in vista. Spostare l&#39;area di attacco sulla griglia in posizione di lavoro e inserire l&#39;ago GIS. </li><li><ol><li> Manovrare con cautela la NM per portare la lamella divisoria in contatto fisico con la superficie di attacco sulla griglia TEM. Non ci dovrebbe essere pressione o tensione tra la lamella, la griglia TEM e il NM. </li><li> Aprire il rubinetto del gas per pochi secondi e crio-deposito di un ulteriore strato di 1-2 micron di Pt. </li><li> Curare il Pt (vedi passo 2.6) solo in pochi micron attorno al punto di contatto tra la lamella e la griglia TEM. </li></ol></li><li> Utilizzare una corrente elevata fascio di ioni di tagliare la lamella libera del NM. Questo può essere ottenuto dalla macinazione di distanza sia la punta NM o il lato del campione. In tegli primo caso, la punta dovrà essere affilati nuovamente prima dell&#39;uso successivo, come descritto al punto 1.2. </li><li> OPTIONAL: in questa fase è possibile utilizzare il VTD per prendere il titolare trasferimento SEM e memorizzarlo O / N in un Dewar contenente azoto liquido. Questo trasferimento e la memorizzazione O / N sia tale da provocare la formazione di ghiaccio sulla superficie della lamella se cristalli di ghiaccio sono già presenti e / o se l&#39;azoto liquido è esposto all&#39;aria umida; ma tale contaminazione verrà rimosso dalla fase successiva in un tempo relativamente breve. Poiché i passaggi precedenti possono aver preso diverse ore per completare, potrebbe essere opportuno farlo, dal momento che dopo il passo successivo tale ammasso O / N non è raccomandato, in quanto non ci sarebbe alcun modo per rimuovere la contaminazione di ghiaccio se non per sublimazione (che non può essere eseguita se la vetrificazione del campione deve essere mantenuta). </li><li> Inclinare il campione a 52 ° e utilizzare il fascio di ioni sottile al di elettroni trasparenza 7. Si consiglia di cominciare con una maggiore, rougle correnti dei fasci per rimuovere la massa e procedere alla lucidatura fine la superficie con correnti dei fasci inferiori, eventualmente anche riducendo la tensione di accelerazione. Lo spessore finale della lamella dovrebbe essere 100-200 nm o meno per l&#39;analisi ultrastruttura in un TEM 100-200 kV o fino a 500 nm per tomografia in un TEM 300 kV, a seconda della composizione del campione. Durante diradamento, le sollecitazioni interne del campione possono causare la lamella arricciamento o piegarsi. In tal caso, la regione assottigliato deve essere limitato. Ciò avvenne per esempio nelle figure 11 e 12. </li></ol> 4. Cryo Trasferimento a TEM <ol><li><ol><li> Lavare la stazione crio-transfer con azoto secco per qualche minuto. </li><li> Aggiungere azoto liquido alla Dewar del TEM AC e alla stazione crio-transfer. </li><li> Inserire il supporto TEM crio-transfer nello slot appropriato della stazione di crio-trasferimento e riempire il suo Dewar pure. Attendere che ogni bozzettoonent ha raggiunto la temperatura desiderata (circa 15 min). Se possibile, il controllore del titolare TEM crio-trasferimento deve essere collegato per monitorare la temperatura durante il trasferimento. È importante rendersi conto che la punta del titolare TEM (la posizione del sensore di temperatura) sarà in contatto con la stazione crio-transfer e verrà raffreddano pertanto molto più velocemente rispetto al resto del titolare TEM. Pertanto si raccomanda che il tempo necessario per l&#39;intera titolare TEM crio-transfer per raffreddare è misurata in anticipo, e che il sistema è consentito thermalize per almeno tale quantità di tempo. </li><li> Riempire una tazza criogenico con azoto liquido e immergere in esso: lo strumento campione serraggio TEM, un cacciavite e pinzette, al fine di raffreddare le loro estremità alla temperatura desiderata. Tutti gli strumenti devono essere adeguatamente isolati su l&#39;altra estremità in modo da non causare ustioni alla mano dell&#39;operatore. </li></ol></li><li> Far corrispondere il VTD per la camera di equilibrio esterno. Portare il cervo freddoe l&#39;altezza di trasferimento (16 mm *). Spegnere l&#39;alta tensione. </li><li><ol><li> Aprire il sigillo VTD, la camera di equilibrio esterno e la camera di equilibrio interiore. </li><li> Utilizzare l&#39;asta VTD per bloccare nel supporto di trasferimento SEM premendo e ruotando in senso orario. </li><li> Ritrarre il supporto di trasferimento SEM nella camera di preparazione crio. </li><li> Usare il coltello fredda per chiudere i coperchi di protezione delle griglie TEM. Ciò è necessario per ridurre la contaminazione ghiaccio possibile durante il trasferimento. </li><li> Utilizzare l&#39;asta VTD per spostare il campione nella camera a vuoto del VTD. </li><li> Chiudere le sacche d&#39;aria e di tenuta. </li></ol></li><li> Vent la camera di compensazione esterna e staccare il VTD. Far corrispondere il VTD alla porta SEM della stazione di crio-transfer. Durante il lavaggio con azoto secco, usa il perno sulla stazione per aprire il sigillo del VTD e far scorrere il supporto di trasferimento SEM nel Dewar della stazione di crio-transfer. </li><li><ol><li> Aggiungere abbastanza azoto liquido in modo che il livello nella stazione crio-transfer è abbastanza altoimmergere solo il campione. </li><li> Utilizzare il cacciavite in precedenza raffreddato ad aprire uno dei coperchi e allentare la corrispondente vite che sta tenendo la griglia TEM a posto. </li><li> Utilizzare le pinzette precedentemente raffreddati a raccogliere la griglia TEM e inserirlo nel supporto TEM. </li><li> Utilizzare il hexring raffreddato per fissare la griglia TEM sul supporto TEM. </li><li> Chiudere l&#39;otturatore del titolare TEM crio-transfer. La fase di trasferimento del campione è fondamentale e potrebbe essere ostacolato da gas azoto riducendo la visibilità del piccolo campione TEM. </li><li> Scollegare la stazione crio-trasferimento dal sistema di pompaggio e trasportarlo vicino al TEM, insieme con il controller di riscaldamento del titolare TEM crio-transfer. </li><li> Avviare la pompa turbomolecolare del TEM per pompare la linea di appoggio per la camera di equilibrio TEM. </li><li> Impostare la fase del campione TEM ad una inclinazione * di -70 °. </li><li> Impostare il breve tempo di pompaggio per la camera di compensazione (30-60 sec), con un solo ciclo di lavaggio con gas di azoto secco. </li&gt; </ol></li><li> Assicurarsi che l&#39;otturatore di protezione sul supporto TEM crio-transfer è chiuso. Rimuovere il supporto TEM dalla stazione di crio-transfer e inserirlo nel goniometro inclinato (azoto liquido fuoriuscire del Dewar titolare TEM). Il ciclo di pompaggio inizierà. Una volta che il ciclo è completato, impostare il goniometro per inclinare di nuovo a 0 ° e, allo stesso tempo, mantenere il supporto del TEM in modo che non ruoti con il goniometro. Inserire completamente all&#39;interno della TEM. Durante questa fase, il titolare TEM crio-trasferimento deve essere collegato ad un regolatore di riscaldamento per controllare la temperatura. La procedura per inserire il supporto del campione nella TEM può variare tra i diversi TEM. Si raccomanda pertanto di contattare il produttore TEM avere la procedura appropriata. </li><li> Riempire il crio-transfer titolare TEM Dewar. Attendere il vuoto nella TEM per raggiungere un livello accettabile. </li></ol>

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Microsc. 226, 263 (2007).</li><li>Pettersson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+producing+site-specific+TEM+specimens+from+low+contrast+materials+with+nanometer+precision.">A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision.</a> Microsc. Microanal. 19 (1), 73 (2013).</li><li>W&#228;tjen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu+out-diffusion+in+kesterites—A+transmission+electron+microscopy+specimen+preparation+artifact.">Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact.</a> Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo è un adattamento piuttosto semplice a temperature criogeniche della preparazione del campione FIB / TEM standard utilizzato in scienze dei materiali a temperatura ambiente. Il metodo produce campioni TEM gratuitamente deformazione meccanica e segni di coltello (il grave inconveniente di microtomia), anche se tendaggi si può verificare se la superficie del campione è disomogeneo. Questo può essere ridotto crio-deposizione di uno strato di incappucciamento (in questo lavoro è stata utilizzata Pt), curato finché è liscio e informe 13. I campioni con componenti di durezza molto diversi possono essere preparate anche senza il rischio che si rompono sotto stress durante la preparazione. Sollecitazioni interne possono ancora provocare il sottile lamella di curvarsi o piegarsi, nel qual caso la dimensione della sezione deve essere ridotto. Un inconveniente rispetto ad altro metodo è la possibilità di modificare la struttura biologica a causa di esposizione al fascio di ioni e possibile impianto degli ioni del campione. Questi inconvenienti si verificano anche a TA per campione prepazione nella scienza dei materiali 15. Essi possono essere ridotte completando il diradamento con un passo lucidatura finale alla tensione più bassa per accelerare gli ioni (500-1000 V). Questo passaggio di lucidatura molto delicato rimuove lo strato danneggiato della lamella. A causa della natura del crio-deposizione (punti 3.5, 3.10 e 3.13), gran parte del campione saranno coperti, ostacolando così la vista della superficie originale. Questo può rendere difficile tenere traccia del ROI, a meno che non si utilizzano più marcature come suggerito al punto 3.3. Durante le fasi 4.5 e 4.7 i rischi lamelle sottili che entrano in contatto con l&#39;aria. Questo è da evitare in quanto provocherebbe l&#39;umidità nell&#39;aria per formare cristalli di ghiaccio sulla superficie del campione, possibilmente fino al punto di oscurare caratteristiche importanti. Tali procedure devono essere eseguite più velocemente possibile, ma allo stesso tempo un maltrattamento durante il trasferimento può comportare la perdita del campione cheauto. Si raccomanda che l&#39;utente esercita tali passaggi utilizzando griglie TEM vuoti prima di un tentativo su un campione reale è fatta. In scienza dei materiali, lo strumento FIB è diventato il metodo principale di preparazione del campione TEM entro un decennio della sua commercializzazione. Poiché può essere utilizzato praticamente su qualsiasi campione, elimina la necessità di adattare la tecnica di preparazione al tipo di campione. Crediamo fermamente lo stesso potrebbe accadere a temperature criogeniche, grazie alla procedura qui dettagliata. La sua applicazione ai campioni più grandi è ancora soggetta alla possibilità di crio-conservazione loro in uno stato vetrificato, ma tecniche come tuffo congelamento o ad alta pressione di congelamento 3,5 può dimostrare di essere le soluzioni ottimali a questo problema.

In questo protocollo una cryo-FIB/SEM viene utilizzato per produrre campioni TEM da una regione specifica del campione, precedentemente identificato con elevata precisione mediante analisi SEM. Microscopia elettronica (scansione o trasmissione) analisi di campioni biologici è una tecnica di routine utilizzato per la ricerca e diagnostica. SEM è piuttosto veloce e facile da utilizzare e interpretare, ma le informazioni vengono ottenute solo dalla superficie del campione e con una risoluzione nell&#39;intervallo 1.5 nm. TEM ha una risoluzione più alta, ma è più difficile da attuare, l&#39;analisi delle immagini è meno semplice e che si ottiene informazione di massa, i campioni devono essere diluiti a elettroni trasparenza (meno di circa 500 nm di spessore). Un ulteriore problema è che i requisiti per vuoto di tali strumenti sono raramente tollerati da campioni contenenti acqua. Nella maggior parte dei casi, i campioni biologici devono essere fisso chimicamente (acqua con sostituzione, per esempio, polimeri) o secchi. In entrambi i casi, le modifiche significative allamorfologia e struttura del campione sono suscettibili di verificarsi. Crio TEM preparazione dei campioni idratati induce cambiamenti chimici minime e produce campioni più vicino possibile al loro stato nativo, soprattutto se vetrificazione di ghiaccio si ottiene 1-6. Il FIB è ampiamente utilizzato per preparare i campioni TEM per i suoi numerosi vantaggi 7. Per citarne alcuni: l&#39;uso di ioni ad alta energia ad incidenza quasi normale riduce al minimo l&#39;effetto dei tassi di fresatura differenziali legati ai materiali; la regione estratto dal campione globale può essere scelto con una precisione sub-micron; una piccola quantità di materiale viene estratto. Alcuni recenti sviluppi tecnici hanno reso possibile con il FIB anche per la preparazione del campione TEM a temperature criogeniche 2,8-10. Ci sono diversi vantaggi rispetto al metodo tradizionale di preparazione crio-microtomia 11,12 utilizzato principalmente per campioni materia soffice, come la mancanza di deformazione meccanica della lamella affettato,l&#39;assenza di segni di coltello e la possibilità di preparare campioni compositi con hard / interfacce o componenti morbide.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Strata DB 235&#160;</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">FIB/SEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omniprobe 100&#160;</td>
			<td colspan="2">Oxford Instruments&#160;</td>
			<td>nanomanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alto 2500</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo preparation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cryo-holder model 626</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo transfer TEM holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tecnai F30</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
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cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam

Qui vi presentiamo un protocollo utilizzato per preparare i campioni crio-TEM di spore di Aspergillus niger, ma che può essere facilmente adattato per qualsiasi numero di microrganismi o soluzioni. Noi facciamo uso di una stazione di crio-transfer personalizzato costruito e modificato crio-SEM camera di preparazione 2. Le spore sono presi da una cultura, immergersi, congelato in una granita azoto liquido e osservato nel crio-SEM per selezionare una regione di interesse. Un sottile lamella viene poi estratto utilizzando il FIB, attaccato ad una griglia TEM e successivamente diluito all&#39;elettrone trasparenza. La griglia viene trasferito a un titolare crio-TEM e in un TEM per studi ad alta risoluzione. Grazie all&#39;introduzione di una punta nanomanipulator raffreddato e una stazione di crio-transfer, questo protocollo è un adattamento semplice a temperatura criogenica del preparato FIB utilizzato di routine di campioni TEM. Come tale, ha il vantaggio di richiedere una piccola quantità di modifiche agli strumenti esistenti, le impostazioni e le procedure; sono ios facile da implementare; ha una vasta gamma di applicazioni, in linea di principio lo stesso che per la preparazione del campione crio-TEM. Una limitazione è che richiede una gestione sapiente dei campioni a passaggi critici per evitare o minimizzare contaminazioni.

In questo lavoro abbiamo fatto uso di: un doppio fascio FIB / SEM dotato di nanomanipulator e una camera di crio-preparazione; un TEM con un supporto crio-transfer; una stazione di crio-transfer prototipo. Il anticontaminator (AC) lame della camera di crio-preparazione e la punta del nanomanipulator (NM) sono stati modificati da Gatan. Rispetto ad una camera di crio-preparazione standard, le lame AC sono più grandi di fornire una maggiore dissipatore di calore per la punta NM. Inoltre, l&#39;AC è dotato di morsetti per il collegamento delle trecce Cu per lo scambio termico con la punta NM. I pneumatici della FIB / SEM sono state modificate per consentire al NM di essere e restare inseriti anche quando la camera del campione è stato sfiatato. Va notato che i parametri utilizzati in questo lavoro sono più adatti per l&#39;apparecchiatura di cui sopra; tali parametri possono essere regolati necessaria quando si lavora con altri tipi di apparecchiature. Per lavorare con questo protocollo, le normali precauzioni per la manipolazione di criogenia, sistemi di azoto e vuoto liquido deveda seguire. Il metodo è stato testato su diversi tipi di campioni con buoni risultati, che vanno da soluzioni o matrici polimeriche contenenti nanoparticelle, di organismo unicellulare ai nematodi. Esempi delle varie fasi della procedura sono illustrati nelle figure 1-12 su A. spore niger colorate con tetrossido di osmio e permanganato di potassio. Le spore vengono prima esposte mediante SEM (Figura 1) per identificare il sito per l&#39;estrazione. In questo caso, una sezione trasversale di qualsiasi spora era sufficiente, ma è possibile posizionare il ROI per estrazione con sub-micrometrica precisione, per esempio, tagliare una cella specifica ad una distanza determinata dalla membrana cellulare. Una volta individuata la caratteristica di interesse, il primo passo della deposizione crio-Pt è implementato (Figura 2), per proteggere il campione da danni fascio dalla macinazione ione. Il campione è inclinato a 52 ° per procedere con i primi passi of la fresatura (Figura 3): lo sputtering di due trincee su entrambi i lati della lamella. Il campione viene quindi inclinato indietro e in seguito lavorato a lasciare solo due piccoli ponti che collegano alla rinfusa (Figura 4). Il nanomanipulator raffreddata viene portato a contatto con la lamella (Figura 5) e un altro crio-deposizione di Pt loro saldature insieme (Figura 6). I ponticelli di collegamento vengono poi macinati distanza e la NM sposta la lamella in prossimità della zona di fissaggio della griglia TEM (Figura 7), dove viene saldato con un finale crio-deposizione di Pt (Figura 8). Il NM viene poi separato dal lamella (Figura 9), che viene ridotto alla elettroni trasparenza con il fascio di ioni (Figura 10 e 11). La lamella è finalmente trasferito al TEM (Figura 12) dove imaging ad alta risoluzione, spettroscopia, tomografia e altre tecniche can essere impiegati. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> Figura 1. Cryo-SEM immagine di spore di A. niger, prima di Pt deposizione. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> Figura 2. La stessa area in Figura 1 dopo Pt deposizione ma prima dell&#39;indurimento. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> Figura 3. Cryo-SEM immagine della stessa area in Figura 2, inclinato 52 °, dopo Pt deposizione e polimerizzazione, con trincea fresatura corso(Vedi passo 3.7). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> Figura 4. La lamella, pronto per lift-out. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> Figura 5. La punta nanomanipulator fredda entra in contatto con la lamella. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> Figura 6. A seconda Pt crio-deposizione è usato per saldare insieme le nanomanipulator e la lamella. <img alt = &quot;Figura 7&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7. L&#39;nanomanipulator freddo viene utilizzato per trasferire la lamella alla zona di attacco della griglia TEM. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> Figura 8. Cryo-deposizione viene utilizzato ancora una volta per fissare la lamella alla rete TEM. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> Figura 9. La lamella viene tagliata del nanomanipulator ed è ora pronto per l&#39;archiviazione o diradamento di elettroni trasparenza. <p class="jove_content" fo:keep-together.entro-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> Figura 10. Una fase intermedia del diradamento, con alcune spore visibili in sezione trasversale. <img alt="Figura 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> Figura 11 Cryo-SEM immagine del campione dopo diradamento finale.; la maggior parte degli altri spore doveva essere lavorato via perché la lamella aveva cominciato ad arricciarsi. <img alt="Figura 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> Figura 12. Una foto crio-TEM composito della lamella. Parte del Al stub è stato inclusonella lamella (freccia nera).

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Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo Electron Microscopi, sia a scansione (SEM) o trasmissione (TEM), sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione di campioni biologici o di altri materiali con un elevato contenuto di acqua 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) viene utilizzato per identificare le caratteristiche di interesse in campioni ed estrarre una lamella sottile elettrone-trasparente per il trasferimento ad un crio-TEM.

Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.4K Views.  Uppsala University.  Cryo Electron Microscopi, sia a scansione (SEM) o trasmissione (TEM), sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione di campioni biologici o di altri materiali con un elevato contenuto di acqua 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) viene utilizzato per identificare le caratteristiche di interesse in campioni ed estrarre una lamella sottile elettrone-trasparente per il trasferimento ad un crio-TEM. 

Video: Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Ricerca

Biologia

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups. This technique uses HistoGel (Thermo Scientific) with conventional laboratory equipment.
The use of cell block sections is a valuable ancillary tool for evaluation of non-gynecologic cytology. They enable the cytopathologist to study additional morphologic specimen detail including the architecture of the lesion. Most importantly, they allow for the evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ polymerase chain reaction (PCR). Traditional cell block preparation techniques have mostly been applied to non-gynecologic cytology specimens, typically for body fluid effusions and fine needle aspiration biopsies.
Liquid based cervicovaginal specimens are relatively less cellular than their non-gynecologic counterparts with many individual scattered cells. Because of this, adequate cellularity within the cell block sections is difficult to achieve. In addition, the histotechnologist sectioning the block cannot visualize the level at which the cells are at the highest concentration. Therefore, it is difficult to monitor the appropriate level at which sections can be selected to be transferred to the glass slides for testing. As a result, the area of the cell block with the cells of interest may be missed, either by cutting past or not cutting deep enough. Current protocol for Shidham's method addresses these issues. Although this protocol is standardized and reported for gynecologic liquid based cytology specimens, it can also be applied to non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc for improved quality of diagnostic material in cell block sections.

Shidham's method for preparation of cell blocks with AV-marker from cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups.

Cellule preparazione del blocco da campioni Citologia con predominanza di cellule sparse individualmente

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

Esame della<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvali tracheali Terminal cellule al microscopio ottico

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Cosa fare e cosa non fare di Cryo-microscopia elettronica: A Primer su preparazione del campione e raccolta dati di alta qualità per la ricostruzione macromolecolare 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. For many years electron microscopy (EM) has remained an inherently two-dimensional technique. With the advent of serial scanning electron microscope imaging techniques (volume EM), using either an integrated microtome or focused ion beam to slice then view embedded tissues, the third dimension becomes easily accessible. Serial block face scanning electron microscopy (SBF-SEM) uses an ultramicrotome enclosed in the SEM chamber. It has the capability to handle large specimens (1,000 &#181;m x 1,000 &#181;m) and image large fields of view at small X,Y pixel size, but is limited in the Z dimension by the diamond knife. Focused ion beam SEM (FIB-SEM) is not limited in 3D resolution, (isotropic voxels of &#8804;5 nm are achievable), but the field of view is much more limited. This protocol demonstrates a workflow for combining the two techniques to allow for finding individual regions of interest (ROIs) in a large field and then imaging the subsequent targeted volume at high isotropic voxel resolution. Preparing fixed cells or tissues is more demanding for volume EM techniques due to the extra contrasting needed for efficient signal generation in SEM imaging. Such protocols are time consuming and labor intensive. This protocol also incorporates microwave assisted tissue processing facilitating the penetration of reagents, which reduces the time needed for the processing protocol from days to hours.

Here, we present a protocol for efficiently combining serial block face and focused ion beam scanning electron microscopy to target an area of interest. This allows for efficient searching, in three dimensions, and locating rare events in a large field of view.

Studi mirati utilizzando la faccia a blocchi seriali e la microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.